董曉曼+蔣超+袁媛+查良平+彭代銀+趙玉洋

[摘要]建立一種快速、準(zhǔn)確鑒別鐵皮石斛加工制品的方法。該研究通過(guò)對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的鐵皮石斛及其同屬近緣物種的ITS序列進(jìn)行對(duì)比分析，根據(jù)變異位點(diǎn)設(shè)計(jì)雙阻滯位點(diǎn)特異性鑒別引物，并優(yōu)化PCR條件，對(duì)鐵皮石斛及其69種近緣種共362個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。結(jié)果顯示，在退火溫度為60 ℃的同一PCR反應(yīng)中，鐵皮石斛均擴(kuò)增出397 bp條帶，而其他69種近緣物種均無(wú)條帶，且該方法靈敏度高，檢出限可達(dá)0.03 mg·L^-1。該文所建立的位點(diǎn)特異性PCR方法可實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛的準(zhǔn)確鑒別，具有操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定可靠、應(yīng)用范圍廣的優(yōu)點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞] 鐵皮石斛； 位點(diǎn)特異性PCR； 分子鑒定

[Abstract] Based on rDNA ITS sequences of Dendrobium officinale and the other 69 species of Dendrobium， a pair of dismatched allele-specific diagnostic primers， TPSH-AS1F and TPSH-AS1R were designed to authenticate D. officinale from the other species. Thebidirectional PCR amplification were performed using the diagnostic primers with the total DNAs of the original plants or processing products as a template. When the annealing temperature was raised to 60 ℃， only the template DNA of D. officinale could be amplified whereas the diagnostic PCRs of the other Dendrobium species were all negative. Compared with the other authentification methods， the bidirectional PCR amplifications is not only simpler and time-saving but practical and effective.

[Key words] Dendrobium officinale； PCR amplificationof specificalleles； molecularidentification

近20年來(lái)，分子鑒別技術(shù)尤其是特異性PCR鑒別已廣泛用于食品和中藥的真?zhèn)舞b別。作為特異性PCR的發(fā)展性技術(shù)，位點(diǎn)特異性PCR（allele-specific PCR）、擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)及其衍生方法利用引物末端不完全匹配形成的擴(kuò)增阻滯差異，已能夠?qū)魏塑账岫鄳B(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)差異進(jìn)行分型從而實(shí)現(xiàn)近緣物種的鑒別^[1-3]。但位點(diǎn)特異性PCR鑒別在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要選擇適宜的GC含量且盡量不含有重復(fù)序列，PCR擴(kuò)增時(shí)也需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆磻?yīng)條件，因退火溫度、酶量、引物量、循環(huán)數(shù)、模板濃度、Taq酶種類均可影響SNP分型結(jié)果，導(dǎo)致該方法應(yīng)用推廣受限^[4]。

對(duì)一些難以進(jìn)行基因分型的近緣物種，需要建立更加穩(wěn)定的鑒別方法。鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是石斛屬石斛組藥用植物，同組有30余個(gè)近緣物種，其形態(tài)和化學(xué)成分相似，傳統(tǒng)手段鑒別困難。核糖體ITS序列在部分石斛種間存在極其顯著的差異，且在種內(nèi)具有一定的遺傳穩(wěn)定性，多個(gè)石斛屬物種均有各自特異性SNP位點(diǎn)，是石斛物種鑒別的有效DNA分子標(biāo)記^[5-9]。但核糖體DNA多為高重復(fù)串聯(lián)序列，且具有很高的GC含量，設(shè)計(jì)的位點(diǎn)特異性PCR引物需要非常嚴(yán)格的PCR反應(yīng)條件^[10-12]。為解決這一問(wèn)題，本文在完成亞洲大陸石斛屬分子系統(tǒng)學(xué)研究的基礎(chǔ)上，以鐵皮石斛為研究材料，利用石斛屬I(mǎi)TS區(qū)變異豐富的特點(diǎn)，通過(guò)2個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)1對(duì)均在3′端倒數(shù)第2位引入錯(cuò)配堿基的雙阻滯特異性引物，使得僅鐵皮石斛出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，而石斛屬其余69種物種均無(wú)條帶，為鐵皮石斛與近緣物種的鑒別提供了分子依據(jù)。

1 材料

1.1 植物材料 選取來(lái)自不同產(chǎn)地的鐵皮石斛168個(gè)單株和69種194個(gè)石斛屬近緣物種的莖362個(gè)DNA樣品進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR研究。植物樣品采自我國(guó)安徽、云南、廣西、浙江、重慶、貴州、西藏、海南、臺(tái)北等省市，以及尼泊爾、老撾、越南和泰國(guó)，分別由安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授和中國(guó)科學(xué)院植物研究所金效華博士鑒定，憑證標(biāo)本保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，見(jiàn)表1。

1.2 儀器 Veriti^TM 96孔梯度PCR儀（Applied Biosystems公司）；GeneAmp 9700型PCR儀（Applied Biosystem公司）；TC-512梯度PCR儀（TECHNE公司）；5810R型高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司）； DYY-12型電腦三恒多用電泳儀（北京六一儀器廠）； SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)（GENE公司） 。

1.3 試劑 rTaq DNA聚合酶、SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶、DL 2 000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司； 2× High-Fidelity Master Mix購(gòu)自北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 SNP位點(diǎn)的篩選和引物設(shè)計(jì) 利用BioEdit軟件對(duì)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中石斛屬植物的ITS序列進(jìn)行同源對(duì)齊，校對(duì)后分析鐵皮石斛與近緣石斛物種差異SNP位點(diǎn)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)鐵皮石斛雙阻滯位點(diǎn)特異性鑒別引物TPSH-AS1F/TPSH-AS1R，序列及PCR擴(kuò)增程序見(jiàn)表2。

2.2 基因組總DNA的提取和PCR擴(kuò)增條件的確定 取100 mg干燥樣品，研磨成細(xì)粉后，置于1.5 mL離心管中，加入65 ℃預(yù)熱的CTAB沉淀液750 μL，充分震蕩混勻，65 ℃溫育40 min，低速離心5 min，棄去上清，剩下管內(nèi)材料按改良CTAB法^[13]提取總DNA。取不同樣品DNA，調(diào)整至濃度約30 mg·L^-1，用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR反應(yīng)以檢測(cè)模板DNA質(zhì)量。PCR反應(yīng)體系為2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L-1 dNTPs，上下游引物各0.2 μL，0.5 U rTaq酶（5 U·μL^-1），1 μL DNA模板。反應(yīng)在Veriti^TM 96孔梯度PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序見(jiàn)表2。反應(yīng)結(jié)束后在PCR反應(yīng)體系內(nèi)加入5 μL 6×loading buffer，混勻后于EB染色的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SYNGENE凝膠成像系統(tǒng)觀察成像。

利用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR反應(yīng)，并分別考察退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)、Taq酶種類、不同PCR儀對(duì)鐵皮石斛鑒別結(jié)果的影響，以確定最優(yōu)反應(yīng)體系和條件。

2.3 鐵皮石斛位點(diǎn)特異性PCR鑒別 取來(lái)自安徽、云南、廣西、浙江等地362個(gè)石斛樣品，提取DNA并進(jìn)行雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增以檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和適用性。PCR反應(yīng)體系為2.5 μL 10×PCR Buffer，1 μL 10 mmol·L^-1dNTPs，引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R（10 μmol· L^-1）各0.25 μL，0.2 U rTaq酶，1 μLDNA模板和19.8 μL ddH₂O。反應(yīng)在Veriti^TM 96孔梯度PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)程序見(jiàn)表2。

2.4 檢出限調(diào)整 鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的總DNA至300 mg·L^-1，并進(jìn)行逐級(jí)稀釋依次獲得質(zhì)量濃度為300，30，3，0.3，0.03 mg·L^-1的系列DNA。以所稀釋的DNA為模板進(jìn)行鐵皮石斛雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR，以能擴(kuò)出條帶的最低濃度確定檢出限。

2.5 隨機(jī)雙盲測(cè)試 按醫(yī)學(xué)雙盲測(cè)試的要求，即樣品編號(hào)、實(shí)驗(yàn)操作與結(jié)果判定3個(gè)環(huán)節(jié)分由3人完成，隨機(jī)取40批經(jīng)過(guò)確證的樣品，提取DNA并進(jìn)行雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增。

3 結(jié)果與分析

3.1 鐵皮石斛雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR引物設(shè)計(jì) 對(duì)石斛屬33個(gè)物種175條ITS序列分析表明，ITS序列60位和417位為鐵皮石斛特有SNP位點(diǎn)，鐵皮石斛60位為C，其他石斛為非C；鐵皮石斛417位為A，其他石斛均非A。利用這2個(gè)SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)鐵皮石斛雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR引物，使正向引物TPSH-AS1F 3′端與鐵皮石斛60位完全匹配，并在3′端倒數(shù)第2位引入錯(cuò)配C，反向引物TPSH-AS1R 3′端與鐵皮石斛417位完全匹配，并在3′端倒數(shù)第2位引入錯(cuò)配A以增強(qiáng)引物特異性。利用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR時(shí)，鐵皮石斛模板末端與正反向引物匹配，擴(kuò)增出長(zhǎng)397 bp的條帶，而石斛屬其他近緣物種因擴(kuò)增阻滯使擴(kuò)增速度大大降低，見(jiàn)圖1。

3.2 條件優(yōu)化 位點(diǎn)特異性PCR衍生出的方法會(huì)受到退火溫度、循環(huán)數(shù)、Taq DNA聚合酶及不同升降溫等條件的影響。由于鐵皮石斛、霍山石斛和細(xì)莖石斛親緣關(guān)系較近^[14]，且是市場(chǎng)上流通的主要品種，商品形態(tài)上較為相近，更易混淆、難于鑒別，故本文挑選鐵皮石斛、霍山石斛及細(xì)莖石斛，對(duì)這4個(gè)因素進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)退火溫度和Taq DNA聚合酶對(duì)雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR具有較大影響，而PCR儀及PCR循環(huán)數(shù)影響小。結(jié)果表明退火溫度在58～62 ℃時(shí)，僅鐵皮石斛獲得約400 bp的特異性條帶，退火溫度過(guò)低時(shí)鐵皮石斛近緣物種也產(chǎn)生微弱條帶，導(dǎo)致假陽(yáng)性，見(jiàn)圖2A；當(dāng)循環(huán)數(shù)為27～36時(shí)，僅鐵皮石斛出現(xiàn)特異性鑒別條帶，而循環(huán)數(shù)超過(guò)36次時(shí)，鐵皮石斛近緣物種也可觀測(cè)到微弱擴(kuò)增條帶，見(jiàn)圖2B；在所選擇的6種DNA聚合酶中，僅rTaq聚合酶能實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的鑒別，見(jiàn)圖2C；對(duì)不同PCR儀進(jìn)行考察，表明3種PCR儀均可用于鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的鑒別，見(jiàn)圖2D。

3.3 準(zhǔn)確性測(cè)試 所建立的方法對(duì)鐵皮石斛的專屬性鑒別能力，使用引物TPSH-AS1F和TPSH-AS1R對(duì)鐵皮石斛及其同屬69個(gè)近緣物種進(jìn)行了雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR，僅鐵皮石斛出現(xiàn)397 bp的鑒別條帶，近緣物種均無(wú)條帶（部分鑒定結(jié)果見(jiàn)圖3A），說(shuō)明雙阻滯位點(diǎn)特異性PCR能專一性鑒別鐵皮石斛。對(duì)鐵皮石斛主產(chǎn)區(qū)安徽、云南、浙江、廣西的362個(gè)樣品和來(lái)自亳州的22批鐵皮石斛楓斗進(jìn)行鑒別也均可得到相同結(jié)果，見(jiàn)圖3B，說(shuō)明該方法具有良好的適用性。

3.4 檢出限測(cè)試 優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件，對(duì)不同濃度的模板DNA進(jìn)行特異性PCR。DNA模板質(zhì)量濃度在30～0.03 mg·L^-1時(shí)，只有鐵皮石斛能擴(kuò)增出397 bp的特異性鑒別條帶，且條帶亮度隨DNA模板濃度降低而減弱，模板DNA檢出限達(dá)0.03 mg·L^-1，見(jiàn)圖4。

3.5 隨機(jī)雙盲測(cè)試 為檢測(cè)方法的可靠性，隨機(jī)取40批經(jīng)過(guò)確證的樣品，按醫(yī)學(xué)雙盲測(cè)試的要求運(yùn)用本方法進(jìn)行檢測(cè)，鑒別結(jié)果與正偽品信息一致，見(jiàn)圖5。

4 討論

石斛屬Dendrobium Sw.植物全世界約有1 000種，我國(guó)有74種2變種，而本研究選取了來(lái)自不同產(chǎn)地的鐵皮石斛168個(gè)和69種194個(gè)石斛屬的近緣物種共362個(gè)樣品進(jìn)行位點(diǎn)特異性PCR研究，幾乎囊括了亞洲大陸石斛屬全部物種，且鐵皮石斛樣品量大，采樣地點(diǎn)多，具有一定代表性，對(duì)保障方法準(zhǔn)確性具有重要意義。

位點(diǎn)特異性PCR具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)，理論上可對(duì)任意SNP位點(diǎn)進(jìn)行分型，已被廣泛應(yīng)用于藥材的真?zhèn)舞b定和鑒別研究^{[1-3，10-12，15-16]}。位點(diǎn)特異性PCR對(duì)反應(yīng)條件較為嚴(yán)格，退火溫度、循環(huán)次數(shù)、Taq酶種類及PCR儀均可能影響鑒定結(jié)果，即當(dāng)更換其中某一條件時(shí)，需重新調(diào)校其他條件，故在實(shí)驗(yàn)操作方面，引物的篩選和實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化尤為重要。目前已報(bào)道的利用位點(diǎn)特異性PCR對(duì)石斛屬植物鑒定方法多對(duì)復(fù)性溫度、DNA模板濃度及純度要求較高^[10-12]，容易導(dǎo)致方法重現(xiàn)性較低，應(yīng)用受限。本文研究結(jié)果表明，退火溫度、PCR循環(huán)數(shù)和PCR儀對(duì)本方法鑒別結(jié)果均影響不大；PrimeSTAR HS DNA聚合酶與SpeedSTAR HS TaqDNA聚合酶、MightyAmp DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶及2×High-Fidelity Master Mix均為高保真酶，具有3′-5′外切酶活性，對(duì)DNA合成時(shí)的錯(cuò)配堿基存在“識(shí)別—逸漏—反復(fù)識(shí)別”的過(guò)程^[17]，反應(yīng)中DNA模板濃度、添加酶量及退火溫度均影響酶的聚合能力；采用的Taq酶無(wú)3′-5′外切酶活性，可造成混淆品因延伸反應(yīng)擴(kuò)增受阻而致反應(yīng)速度大大降低；在方法建立中使用了雙盲測(cè)試，更進(jìn)一步驗(yàn)證了所建立方法特異性好、重復(fù)性高、穩(wěn)定可靠。

本研究根據(jù)鐵皮石斛與石斛屬近緣物種的ITS序列設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，發(fā)現(xiàn)引入錯(cuò)配堿基的個(gè)數(shù)和位置對(duì)特異性引物擴(kuò)增效果和鑒別特異性影響均較大。Kwok等^[18]研究表明，在引物3′端倒數(shù)第2，3個(gè)堿基的位置引入錯(cuò)配對(duì)提高引物特異性的效果最好，且G/T錯(cuò)配擴(kuò)增相對(duì)容易。本實(shí)驗(yàn)中在上下游引物3′端前一位均人為引入錯(cuò)配，且所有錯(cuò)配均為嘌呤-嘧啶替換模式，這種替換模式可有效阻滯69種鐵皮石斛近緣物種的非特異性擴(kuò)增，而鐵皮石斛特異性擴(kuò)增效果依然較好。此外，本方法的檢出限為模板DNA質(zhì)量濃度在0.03～30 mg·L^-1，這可能與所使用的SNP位點(diǎn)位于具有高拷貝數(shù)的ITS序列上，故對(duì)降解程度較嚴(yán)重的石斛加工制品仍能有效鑒別，所以本方法對(duì)市場(chǎng)上鐵皮石斛加工制品的真?zhèn)舞b別有重要參考價(jià)值，也對(duì)鐵皮石斛加工制品的質(zhì)量穩(wěn)定性和安全性提供技術(shù)保障。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Wang H， Kim M K， Kwon W S， et al. Molecular authentication of Panax ginseng and ginseng products using robust SNP markers in ribosomal external transcribed spacer region[J]. J Pharmaceut Biomed， 2011， 55（5）： 972.

[2] 龍平， 崔占虎， 李虔全， 等. 基于位點(diǎn)特異性 PCR 的黃芪與紅芪鑒別方法研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2013， 38（16）： 2561.

[3] 蔣超， 張雅華， 陳敏， 等. 基于雙向位點(diǎn)特異性 PCR 的金銀花真?zhèn)舞b別方法研究[J]. 中國(guó)中藥雜志， 2012， 37（24）： 3752.

[4] 蔣超， 黃璐琦， 袁媛， 等. 金銀花中幾種分子的真?zhèn)舞b別方法比較及其研究進(jìn)展[J]. 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2014 （8）： 1831.

[5] 丁小余，王崢濤，徐紅，等.楓斗類石斛 rDNA ITS 區(qū)的全序列數(shù)據(jù)庫(kù)及其序列分析鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2002，37（7）：567.

[6] 顧慧芬，莊意麗，馬子建，等.基于 ITS 序列分析鐵皮石斛與近緣類群的親緣關(guān)系[J]. 中成藥， 2010， 32（4）： 628.

[7] Xu H， Wang Z， Ding X， et al. Differentiation of Dendrobium species used as"Huangcao Shihu" by rDNA ITS sequence analysis[J]. Planta Med， 2006， 72（1）： 89.

[8] Chiang C H， Yu T A， Lo S F， et al. Molecular authentication of Dendrobium species by multiplex polymerase chain reaction and amplification refractory mutation system analysis[J]. J Am Soc Hortic Sci， 2012， 137（6）： 438.

[9] Xu S， Li D， Li J， et al. Evaluation of the DNA barcodes in Dendrobium （Orchidaceae） from mainland Asia[J]. PLoS ONE， 2015， 10（1）： e0115168.

[10] 徐紅， 王崢濤， 丁小余， 等. 金釵石斛的位點(diǎn)特異性PCR鑒別研究[J]. 中草藥， 2005， 36（10）： 1540.

[11] 丁小余， 徐珞珊， ?？。?等. 兜唇石斛的位點(diǎn)特異性PCR鑒別[J]. 南京師范大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2002（4）： 17.

[12] 羅玉明， 丁小余， 徐珞珊，等. 細(xì)葉石斛的位點(diǎn)特異性PCR鑒別[J]. 淮陰師范學(xué)院學(xué)報(bào)： 自然科學(xué)版， 2002 （1）： 82.

[13] 崔光紅，唐曉晶，黃璐琦.含淀粉及多糖類中藥材DNA的提取方法研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，31（16）：1365.

[14] 武榮花. 我國(guó)石斛屬植物種質(zhì)資源及其親緣關(guān)系研究[D]. 北京：中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院， 2007.

[15] 羅玉明，張衛(wèi)明，丁小余，等.紫蘇屬藥用植物的rDNA ITS區(qū) SNP 分子標(biāo)記與位點(diǎn)特異性 PCR 鑒別[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，41（9）：840.

[16] 曹亮，蔣超，彭華勝，等.白術(shù)，蒼術(shù)種子位點(diǎn)特異性 PCR 鑒別方法研究[J].中國(guó)中藥雜志，2013，38（16）：2567.

[17] 陳琳玲， 張佳， 彭翠英，等. DNA聚合酶高保真機(jī)理的新發(fā)現(xiàn)及其在SNP分析中的應(yīng)用[J]. 遺傳， 2005， 27（2）：279.

[18] Kwok S， Chang S Y， Sninsky J J， et al. A guide to the design and use of mismatched and degenerate primers[J]. Genome Res， 1994， 3（4）： S39.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]