吳錦波，葉小漢，冼紹祥，董明國

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

比索洛爾改善心力衰竭大鼠心功能的機(jī)制探討

吳錦波，葉小漢，冼紹祥，董明國

目的：觀察比索洛爾對(duì)心力衰竭大鼠心功能的影響，并探討其機(jī)制。

心力衰竭；肌細(xì)胞，心臟；微小核糖核酸

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:274.)

慢性心力衰竭（CHF）是多種心血管疾病的終末期表現(xiàn)，心力衰竭歸根究底是心肌收縮和（或）舒張功能受損，心肌細(xì)胞興奮-收縮耦聯(lián)障礙。肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a （SERCA2a）對(duì)興奮-收縮耦聯(lián)具有重要調(diào)控作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)SERCA2a基因治療可以改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和CHF患者的心功能[1、2]；抑制微小核糖核酸-25（miR-25）表達(dá)也可以提高SERCA2a表達(dá)水平，改善心功能[3]。β受體阻滯劑可以上調(diào)衰竭心臟β1受體并恢復(fù)其正常功能，改善心功能，提高左心室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）。β受體阻滯劑常與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑聯(lián)合應(yīng)用，已經(jīng)成為治療CHF的基石[4]。研究發(fā)現(xiàn)：美托洛爾可以使衰竭心臟SERCA2a的蛋白水平和活性正?；痆5]，這是美托洛爾治療CHF的分子機(jī)制之一。CIBIS-Ⅱ臨床試驗(yàn)顯示，比索洛爾能降低CHF患者的病死率和再住院率[6]。然而，關(guān)于比索洛爾治療CHF的分子機(jī)制研究報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)通過腹腔注射阿霉素建立CHF大鼠模型，觀察比索洛爾對(duì)大鼠心功能和SERCA2a活性的影響，并探討其對(duì)SERCA2a、受磷蛋白（PLB）和miR-25-3p表達(dá)水平的影響，進(jìn)一步探討比索洛爾治療CHF的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康雄性SD大鼠80只，平均體質(zhì)量（230±20） g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（粵）2013-0020；動(dòng)物合格證號(hào)：440059000]。SPF級(jí)凈化空間，生長條件為12 h/12 h光照周期，溫度（22±3） ℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由攝食、飲水。實(shí)驗(yàn)藥物采用指南[1]推薦劑量，并經(jīng)過人與大鼠體表面積換算。比索洛爾（德國Merck Serono，批號(hào)：191839）189 mg加無菌蒸餾水2100 ml，制成濃度為0.09 mg/ml的溶液，灌胃劑量為0.9 mg/（kg·d）。卡托普利（中美上海施貴寶，批號(hào)：AAB9465）2205 mg加無菌蒸餾水2100 ml，制成濃度為1.05 mg/ml的溶液，灌胃劑量為10.5 mg/（kg·d）。阿霉素（美國Medchemexpress LLC，批號(hào)：HY-15142）；氯胺酮（福建古田藥業(yè)，批號(hào)：1504153）；地西泮（天津金耀藥業(yè)，批號(hào)：1507077）。

主要試劑：酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國RayBiotech公司；超微量Ca2+-ATP酶檢測試劑盒由南京建成提供；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒由碧云天生物技術(shù)研究所提供；β-actin抗體、SERCA2a抗體由美國Santa Cruz公司提供；PLB抗體購自美國Abgent公司；miR-25-3p反義探針購自上海GenePharma公司；U6反義探針購自美國Sigma公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液（ ECL）購自美國Millipore公司。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）試劑由德國DBI公司提供。

主要儀器：HP5500心臟超聲儀（美國惠普）；GDS7600凝膠掃描系統(tǒng)（英國UVP公司）；ABI9700PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）。

1.2 動(dòng)物造模、分組及檢測指標(biāo)

雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[7]，采用阿霉素腹腔注射法（用滅菌注射用水溶解成0.25 mg/ml溶液，每次注射劑量為2.5 mg/kg，2周內(nèi)分6次注射，總劑量15 mg/kg）建立CHF大鼠模型。首次腹腔注射5周后應(yīng)用心臟超聲儀檢測并計(jì)算左心室短軸縮短率（FS），以心腔擴(kuò)大，F(xiàn)S＜30%作為CHF成模標(biāo)準(zhǔn)。

80只大鼠隨機(jī)選取10只為正常對(duì)照組，10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水。采用阿霉素腹腔注射法造模共60只，造模過程中有15只大鼠因出現(xiàn)重度心力衰竭和肝硬化腹水而死亡，死亡率為25%；FS不達(dá)標(biāo)5只，成模率為67%。40只成功造模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：模型組（n=10）、比索洛爾組（n=10）、卡托普利組（n=10）和比索洛爾＋卡托普利組（n=10），后三組分別以比索洛爾[0.9 mg/（kg·d）]、卡托普利[10.5 mg/（kg·d）]和比索洛爾[0.9 mg/（kg·d）]＋卡托普利[10.5 mg/（kg·d）]灌胃，每天1 次，連續(xù)35天；其余各組以10 ml/kg的蒸餾水灌胃。在隨后的實(shí)驗(yàn)干預(yù)中，每組各有1只大鼠因灌胃不當(dāng)而死亡。

大鼠心功能指標(biāo)檢測：干預(yù)前后采用腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）和地西泮（5 mg/kg）混合麻醉大鼠，胸前剃毛，大鼠取仰臥位，固定在木板上，應(yīng)用心臟超聲儀，分別測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）等，計(jì)算FS、心排出量（CO）和LVEF。

ELISA法檢測血漿B型利鈉肽（BNP）水平：處死大鼠時(shí)腹主動(dòng)脈取血，肝素抗凝，靜置1 h，300×g離心10 min，取上清－20℃冰箱保存，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

莖環(huán)狀引物實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測大鼠心肌miR-25-3p表達(dá)水平：取大鼠心室肌組織100 mg勻漿后，用Trizol法抽提心肌總RNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得c DNA，莖環(huán)狀引物實(shí)時(shí)定量PCR測定miR-25-3p的表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，PCR 擴(kuò)增40循環(huán)。電泳、凝膠成像，軟件分析。以U6作為內(nèi)參，以2-△△Ct公式計(jì)算miR-25-3p的相對(duì)表達(dá)水平。引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)均由廣州維伯鑫生物科技有限公司完成。PCR引物見表1。

表1 莖環(huán)狀引物實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物

免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測心肌細(xì)胞SERCA2a和PLB的蛋白表達(dá)水平：取100 mg心肌組織，加入裂解液，冰上裂解1 h，提取細(xì)胞內(nèi)蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量[8]。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用牛血清蛋白封閉，經(jīng)Ⅰ抗結(jié)合后洗膜，Ⅱ抗結(jié)合，洗膜后采用ECL顯色，軟件分析。以SERCA2a和PLB的平均灰度值與相應(yīng)內(nèi)參照蛋白β-actin的平均灰度值的比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算SERCA2a/PLB比值。

定磷法測定SERCA2a活性：參照文獻(xiàn)[9]測定心肌ESRCA2a活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，SLD法進(jìn)行組間兩兩比較，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較

CHF大鼠出現(xiàn)不同程度的食欲減退、精神較差、張口呼吸和乏力等癥狀。模型組、比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組術(shù)后體重分別為（325.0+50.8）g、（338.6 ±57.4）g、（341.3 ±51.5）g和（334.7±58.2）g，均明顯低于正常對(duì)照組（443.2±69.3）g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；術(shù)后5周內(nèi)模型組、比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組大鼠體重有不同程度回升，分別為（343.5±86.1）g、（475.2±32.7）g、（473.5±25.3）g和（480.4+25.5）g，比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組明顯高于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組大鼠心功能指標(biāo)、血漿BNP水平比較（表2）

干預(yù)后，模型組FS、CO和LVEF明顯低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組FS、CO和LVEF明顯高于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組血漿BNP水平顯著高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.01），比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組顯著低于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)、血漿B型利鈉肽水平比較

表2 各組大鼠心功能指標(biāo)、血漿B型利鈉肽水平比較

注：與正常對(duì)照組和假手術(shù)組比較*P＜0.01；與模型組比較△P＜0.01

?

2.3 各組大鼠心肌miR-25-3p的表達(dá)水平比較（圖1）

模型組miR-25-3p 表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.01），卡托普利組、比索洛爾組和比索洛爾＋卡托普利組miR-25-3p 表達(dá)水平顯著低于模型組（P＜0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠心肌miR-25-3p的相對(duì)表達(dá)水平比較（n=9）

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞SERCA2a和PLB的蛋白表達(dá)水平比較（圖2）

模型組SERCA2a和PLB表達(dá)水平明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.01），降幅分別為83.5%和62.4%，SERCA2a降幅大于PLB，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組SERCA2a和PLB表達(dá)水平明顯高于模型組（P＜0.01），升幅分別為315.3%和122.4%、201.8%和87.2%、311.3%和118.6%，SERCA2a升幅均大于PLB（P＜0.01）。比索洛爾組和比索洛爾＋卡托普利組SERCA2a/PLB比值[（6.16±0.34）和（6.05±0.35）]明顯高于模型組（3.82±0.57），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.6 各組 大鼠心肌SERCA2a活性比較（圖3）

模型組SERCA2a活性顯著低于正常對(duì)照組和假手術(shù)組（P＜0.01），比索洛爾組和比索洛爾＋卡托普利組SERCA2a活性顯著高于模型組（P＜0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠心肌細(xì)胞SERCA2a和PLB的相對(duì)表達(dá)水平的比較（n=9）

圖3 各組大鼠心肌SERCA2a活性的比較（n=9）

3 討論

大量的實(shí)驗(yàn)研究證明，SERCA2a具有正性肌力和正性變舒效應(yīng)，能夠提高心肌收縮力和改善舒張功能[1]。SERCA2a的含量與心臟指數(shù)、肺動(dòng)脈壓等血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)相關(guān)，與去甲腎上腺素正相關(guān)，與心鈉素的mRNA含量負(fù)相關(guān)[10]。SERCA2a的含量還受miR-25的影響。研究發(fā)現(xiàn)：miR-25選擇性作用于SERCA2a mRNA 3'非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)，干擾SERCA2a 的合成從而降低其水平；通過給經(jīng)主動(dòng)脈縮窄術(shù)誘導(dǎo)的心衰小鼠注射Anti-miR-25可以降低miR-25水平，增加SERCA2a水平。miR-25-3p可能與miR-25一樣，通過不精確的堿基配對(duì)與SERCA2a mRNA上的特異識(shí)別元件結(jié)合從而干擾其翻譯[3]。心肌SERCA2a活性主要受PLB調(diào)控，PLB與SERCA2a結(jié)合可誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，減少SERCA2a與Ca2+的親和力，降低肌漿網(wǎng)Ca2+攝取率；SERCA2a/PLB比值降低可以減弱SERCA2a活性[1]。

由于交感神經(jīng)系統(tǒng)的長期過度激活，CHF患者心肌β1受體下調(diào)和功能受損，對(duì)兒茶酚胺的反應(yīng)降低，心肌興奮-收縮耦聯(lián)功能障礙，心功能受損；β受體阻滯劑可以恢復(fù)β1受體功能并使之上調(diào)，心肌興奮-收縮耦聯(lián)趨于正?；?，心功能得到改善[4]：β腎上腺素激活腺苷酸環(huán)化酶（cAMP），cAMP磷酸化并激活蛋白激酶（PKA），PKA磷酸化PLB導(dǎo)致SERCA2a抑制減弱，SERCA2a活性增強(qiáng)[1，4]。已有研究表明：美托洛爾可以使衰竭心臟SERCA2a的蛋白水平和活性正?；?，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，恢復(fù)Ca2+穩(wěn)態(tài)，改善心功能[5]。

本實(shí)驗(yàn)中，CHF大鼠心肌SERCA2a和PLB表達(dá)水平降低，而比索洛爾可以提高SERCA2a和PLB表達(dá)水平，PLB的變化幅度較SERCA2a少。擴(kuò)張型或缺血性心肌病患者心臟中，PLB mRNA的表達(dá)水平下降[1]，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。與比索洛爾不同，美托洛爾對(duì)CHF狗模型的PLB沒有明顯的提升作用[5]，原因可能與藥物不同、物種不同和造模方法不同有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，CHF大鼠SERCA2a活性降低，究其原因可能有：（1）miR-25-3p抑制SERCA2a合成；（2）SERCA2a降幅大于PLB，SERCA2a/PLB比值降低，PLB抑制作用增強(qiáng)，SERCA2a活性降低，這在人類的衰竭心臟中亦有類似變化[11]。比索洛爾增強(qiáng)SERCA2a活性的可能機(jī)制有：（1）提高SERCA2a和PLB的表達(dá)水平，SERCA2a升幅大于PLB，SERCA2a/PLB比值升高，PLB的抑制作用減弱，SERCA2a活性增強(qiáng)；（2）miR-25-3p對(duì)SERCA2a的抑制作用減弱。本實(shí)驗(yàn)中，卡托普利也可以降低miR-25-3p，但其對(duì)SERCA2a的提升作用不如比索洛爾明顯，對(duì)SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性的影響不明顯；這也提示，SERCA2a除受miR-25-3p影響以外，還有其他途徑（例如β1受體上調(diào)等）影響了SERCA2a的含量和活性。

本研究結(jié)果顯示：比索洛爾可以提高SERCA2a含量和SERCA2a活性，這也許是比索洛爾治療CHF的一種分子機(jī)制。必須指出：本實(shí)驗(yàn)使用動(dòng)物樣本量少，而且是小動(dòng)物，只針對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的特定心衰模型，比索洛爾的效應(yīng)及其治療心衰的分子機(jī)制有待大規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證和解答。

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Exploration of Bisoprolol Improving Cardiac Function in Heart Failure Rats

WU Jin-bo, YE Xiao-han, XIAN Shao-xiang, DONG Ming-guo.
Department of Cardiology, Central Hospital of Dongguan City, Dongguan (510405), Guangdong, China Corresponding Author: WU Jin-bo, Email: wujinbocn@163.com

Objective: To observe the effect of bisoprolol on cardiac function in heart failure (HF) rats and to explore the mechanism.Methods: The experimental rats were divided into 6 groups: Control group, with normal healthy rats, Sham group, the rats received intraperitoneal injection of normal saline; chronic heart failure (CHF) model was successfully established in 40 rats and divided into 4 groups: CHF group, CHF+bisoprolol (Bis) group, CHF+captopril (Cap) group and CHF+Bis and Cap group.n=10 in each group. The cardiac function was observed among different groups; plasma BNP level was measured by ELISA, myocardial miR-25-3p expression was examined by RT-PCR, protein expressions of SERCA2a and phospholamban (PLB) were detected by Western blot analysis and SERCA2a activity was determined by inorganic phosphorus method.Results: Compared with Control group, CHF group showed decreased cardiac output (CO), left ventricular fractional shortening (LVFS), left ventricular ejection fraction (LVEF), reduced expression of cardiac SERCA2a, PLB, the ratio of SERCA2a/PLB and SERCA2a activity; while increased plasma BNP and miR-25-3p expression, allP＜0.01. Compared with CHF group, CHF+Bis, CHF+Cap and CHF+Bis and Cap groups had increased CO, LVFS, LVEF, elevated expression of cardiac SERCA2a, PLB, the ratio of SERCA2a/PLB and SERCA2a activity; while decreased plasma BNP and miR-25-3p expression, allP＜0.05.Conclusion: Bisoprolol could improve cardiac function in HF rats, which might be related to down regulating myocardial miR-25-3p expression, up regulating myocardial protein expressions of SERCA2a, PLB and enhancing SERCA2a activity.

Heart failure; Myocyte, cardiac; MicroRNA

2016-07-21）

（編輯:許菁）

510405 廣東省，東莞市中醫(yī)院 心內(nèi)科（吳錦波、葉小漢、董明國）；廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心內(nèi)科（冼紹祥）

吳錦波 副主任醫(yī)師 博士 研究方向?yàn)樾牧λソ叩脑\治 Email: wujinbocn@163.com 通訊作者：吳錦波

R54

A

1000-3614（2017）03-0274-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.03.016

方法：80只SD大鼠隨機(jī)選取10只為正常對(duì)照組，10只作為假手術(shù)組，假手術(shù)組腹腔注射10 ml/kg的生理鹽水。造模過程中有15只死亡，左心室短軸縮短率不達(dá)標(biāo)5只，40只成功造模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成4組：模型組（n=10）、比索洛爾組（n=10）、卡托普利組（n=10）和比索洛爾＋卡托普利組（n=10）。觀察各組大鼠心功能指標(biāo)，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿B型利鈉肽水平，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測心肌miR-25-3p表達(dá)水平，免疫蛋白印跡試驗(yàn)（Western blot）檢測心肌肌漿網(wǎng)鈣ATP酶2a（SERCA2a）和受磷蛋白（PLB）表達(dá)水平，定磷法測定心肌SERCA2a活性。

結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心輸出量、左心室短軸縮短率、左心室射血分?jǐn)?shù)、心肌SERCA2a和PLB表達(dá)水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性顯著降低，血漿B型利鈉肽水平和心肌miR-25-3p表達(dá)水平顯著升高（P均＜0.01）。與模型組比較，比索洛爾組、卡托普利組和比索洛爾＋卡托普利組大鼠心輸出量、左心室短軸縮短率、左心室射血分?jǐn)?shù)、心肌SERCA2a和PLB表達(dá)水平、SERCA2a/PLB比值和SERCA2a活性顯著升高，血漿B型利鈉肽水平和心肌miR-25-3p表達(dá)水平顯著降低（P均＜0.05）。

結(jié)論：比索洛爾可以改善心力衰竭大鼠心功能，機(jī)制可能與下調(diào)心肌miR-25-3p表達(dá)，提高SERCA2a和PLB表達(dá)，提升SERCA2a/PLB比值，增強(qiáng)SERCA2a活性有關(guān)。