趙 亮，鄒益東，胡 鯤，楊先樂(lè)，黃保華

(1.上海海洋大學(xué)，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海，201306；2. 江蘇天石生物科技有限公司，無(wú)錫，214258；3. 上海黛龍生物科技有限公司，上海，201400)

聚六亞甲基胍對(duì)異育銀鯽鰓出血病藥效的初步研究

趙 亮1，鄒益東2，胡 鯤1，楊先樂(lè)1，黃保華3

(1.上海海洋大學(xué)，國(guó)家水生動(dòng)物病原庫(kù)，上海，201306；2. 江蘇天石生物科技有限公司，無(wú)錫，214258；3. 上海黛龍生物科技有限公司，上海，201400)

通過(guò)PCR檢測(cè)及序列對(duì)比分析，確診江蘇海豐農(nóng)場(chǎng)兩塘口內(nèi)異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)所患疾病為鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2)引發(fā)的鯽造血器官壞死癥(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，而后分別每10 d 使用0.5 mL/m3和0.75 mL/m3聚六亞甲基胍(Polyhexamethylene guanide, PHMG)潑灑治療，并定期采樣，利用Real Time PCR測(cè)定樣品中病毒表達(dá)量。結(jié)果顯示：該病毒(DF2015) CyHV-2的DNA解旋酶基因序列長(zhǎng)為316 bp，與絕大多數(shù)病毒株有較近的親緣關(guān)系(99%)，但與病毒株ST-J1和H.Fukuda的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)(63%)。與其余病毒株等有較近的親緣關(guān)系(99%)；治療近2個(gè)月后，兩塘的病毒相對(duì)表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)，且具有顯著差異性，但0.75 mL/m3治療塘病毒相對(duì)表達(dá)量極顯著降低，治療效果相對(duì)更顯著。

聚六亞甲基胍；異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)；鯽造血器官壞死癥；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；鯉皰疹病毒Ⅱ型

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚類, 養(yǎng)殖規(guī)模越來(lái)越大[1-4]。2011年，江蘇異育銀鯽出現(xiàn)一種怪病，引起大量死亡，嚴(yán)重時(shí)發(fā)病率高達(dá)80%，俗稱鰓出血病[5]，給江蘇地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái), 鰓出血病給中國(guó)部分水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)帶來(lái)重創(chuàng)，有研究者確認(rèn)了該病為鯽造血器官壞死癥(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2)[6-9]，該病具有突發(fā)性及流行廣和致死率高的特點(diǎn)。主要癥狀為體表有大小不同的出血斑, 下頜、鰭基部及側(cè)線鱗以下及胸部出血尤為明顯，鰓腫脹呈暗紅色, 當(dāng)鰓蓋張合或魚泳動(dòng)時(shí)會(huì)有血液從鰓蓋下方流出，鰓出血病嚴(yán)重阻礙中國(guó)水產(chǎn)業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。

已有研究表明0.5 mL/m3聚六亞甲基胍(Polyhexamethylene guanide, PHMG)能夠有效預(yù)防鯽鰓出血病[10]，聚六亞甲基胍是一種新型的多用途高分子聚合物，具有無(wú)色無(wú)味、易溶于水、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[11]，對(duì)白色念珠菌、弧菌等具有良好殺滅效果[12-14]。PHMG是一種陽(yáng)離子表面活性劑，易被呈負(fù)電性的各類細(xì)菌與病毒所吸附，從而抑制它們的分裂繁殖功能[15]，因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與性能，常被用于食品行業(yè)及環(huán)境消毒等行業(yè)中[16-17]。PHMG有刺激性小、安全低毒、易溶解、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，目前有報(bào)道表明PHMG對(duì)多種水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病具有顯著功效[18]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有良好的應(yīng)用前景[10, 19]。本研究欲驗(yàn)證聚六亞甲基胍用于外塘的效果，并為該藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖的合理安全使用提供科學(xué)的參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)塘口

江蘇大豐海豐農(nóng)場(chǎng)，一區(qū)11#、12#塘為鰓出血發(fā)病遺留塘，兩塘口面積均約為90 m2，水深約1.5 m。2014年秋季發(fā)病后，重新放入了異育銀鯽小魚種。2015年3月底采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)魚體有鰓出血癥狀，且11#塘相對(duì)更嚴(yán)重。隨即制定聚六亞甲基胍用藥方案，同時(shí)帶病樣回實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2.2 實(shí)驗(yàn)試劑

聚六亞甲基胍有效濃度約為25%，上海黛龍生物科技工程有限公司?；蚪MDNA抽提試劑盒、DNA片段純化試劑盒、rTaq、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)等購(gòu)自Takara，iQTMSYBR?Green Supermix購(gòu)自Bio-rad公司。

2.3 實(shí)驗(yàn)方法

2.3.1 聚六亞甲基胍用藥方案

由于一區(qū)11#、12#塘，已發(fā)現(xiàn)鰓出血病癥狀，故首次用藥采用治療方案，具體方案如下：

11#塘：以0.5 mL/m3，每天潑灑一次，連用3 d。

12#塘：以0.75 mL/m3，每天潑灑一次，連用2 d。

而后每10 d按照相應(yīng)濃度潑灑一次，并分別進(jìn)行取樣檢測(cè)。

2.3.2 病毒檢測(cè)

2.3.2.1 樣品制備

采集使用聚六亞甲基胍前塘口內(nèi)的病魚，每塘取5條，并將兩塘病魚的腎臟組織分別置于無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌剪刀剪碎，液氮研磨后，用于巢式PCR檢測(cè)，驗(yàn)證是否為CyHV-2病毒感染。

使用聚六亞甲基胍后分批采集病魚，每次每塘取5條，分別取每批次病魚腎臟組織于無(wú)菌離心管中，用無(wú)菌剪刀剪碎，放入凍存管中-80 ℃保存，用于Real Time PCR檢測(cè)。

2.3.2.2 PCR檢測(cè)及序列分析

[10, 20]，調(diào)整相關(guān)條件后，采用巢式PCR檢測(cè)，引物設(shè)計(jì)參照GenBank中已有的CyHV-2的DNA解旋酶基因序列(登錄號(hào)：EU349287)設(shè)計(jì)。外引物為W1-F：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG，W1-R：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA；內(nèi)引物為W2-F：GAACACCGCTGCTCATCATC，W2-R：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC[10]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

巢式PCR兩輪擴(kuò)增后，產(chǎn)物在1%(W/V)的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)作成像分析。

將上述內(nèi)引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物用DNA回收試劑盒(TaKaRa)切膠回收純化后送上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAStar和NCBI BLAST與已發(fā)布的CyHV-2基因組序列進(jìn)行核苷酸同源性序列分析比對(duì)。從GenBank中選擇與陽(yáng)性序列相似的參考毒株，用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2.3.3 Real Time PCR

2.3.3.1 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

分離異育銀鯽腎，按Trizol法提取總RNA。采用紫外分光光度計(jì)與1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度及完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆?。使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反轉(zhuǎn)錄體系及反應(yīng)條件按照試劑盒推薦體系進(jìn)行。

2.3.3.2 Real Time PCR

根據(jù)參考文獻(xiàn)[21-22]中的引物，參照GenBank中CyHV-2的DNA解旋酶基因序列設(shè)計(jì)，由上海生工生物有限公司合成，引物如表1。熒光定量PCR反應(yīng)必須確定擴(kuò)增的特異性、最適溫度及擴(kuò)增效率。具體要求為：確定最適溫度從而使模板與內(nèi)參基因的擴(kuò)增可同時(shí)進(jìn)行；目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率必須都介于95%～102%，且差異小于2%[23]。Real Time PCR反應(yīng)參數(shù)為: 95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃10 s，64 ℃ 10 s，共40 個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸 1 min。用內(nèi)參β-actin對(duì)各個(gè)樣品的Ct值進(jìn)行均一化處理，采用2-△△Ct確定不同樣品mRNA的相對(duì)含量[24, 25]。

表1 Real Time PCR所用引物

2.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0軟件統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行方差分析(one-way-ANOVA)，差異顯著時(shí)采用最小顯著性差異法(Least Significant Difference，LSD)比較各組平均樣，數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±SD)。

3 結(jié)果

3.1 病毒檢測(cè)結(jié)果

巢式PCR檢測(cè)到CyHV-2感染，檢測(cè)結(jié)果病魚均為陽(yáng)性，這4個(gè)樣本都能擴(kuò)增出一條316 bp的單一亮帶(圖1)。

圖1 巢式PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 CyHV-2 Nested-PCR assay of fish samples.M：DL1000 DNA marker；1、2：11#塘口病魚；3、4：12#塘口病魚

3.2 DNA序列比對(duì)分析

對(duì)上述巢式PCR二次擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示目的基因片段為316 bp，并命名為DF2015。將其在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果分析表明，DF2015與CyHV-2病毒株同為一支，但與CyHV-2病毒株中的ST-J1和H.Fukuda的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與CyHV-3病毒株等有較近的親緣關(guān)系(圖2)。

圖2 同源性的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis

3.3 Real Time PCR結(jié)果

雖然許多出版單位在數(shù)字出版領(lǐng)域進(jìn)行了探索和發(fā)展，并取得了一定的成績(jī)。但如果要想在未來(lái)的數(shù)字出版領(lǐng)域站穩(wěn)腳跟、發(fā)展壯大，就必須不斷開(kāi)拓創(chuàng)新。數(shù)字出版只有在開(kāi)拓創(chuàng)新中不斷摸索、總結(jié)經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)，大力推進(jìn)品牌建設(shè)，形成自己的運(yùn)營(yíng)體系，才能吸引更多的讀者群體，出版單位才能在這個(gè)領(lǐng)域中站穩(wěn)腳跟。

用藥及取樣時(shí)間如表2所示，并分別對(duì)樣品的腎臟進(jìn)行編號(hào)并保存?zhèn)溆谩?/p>

Real Time PCR結(jié)果(圖3) 顯示，兩個(gè)塘口用藥后病毒mRNA表達(dá)量整體趨勢(shì)為逐漸減少。其中，圖3為11#塘樣品病毒相對(duì)表達(dá)量，其它批次樣品與第一批樣品病毒相對(duì)表達(dá)量具有顯著差異(P<0.05)，同時(shí)，11-3批次樣品病毒量出現(xiàn)增加的情況(P<0.05)；而圖4為12#塘樣品病毒相對(duì)表達(dá)量，與第一批樣品病毒相對(duì)表達(dá)量相比，其它批次樣品極顯著降低(P<0.01)。

表2 用藥、取樣時(shí)間及樣品編號(hào)

圖3 11#塘樣品病毒相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of CyHV-2 in fishes of 11#

圖4 12#塘樣品病毒相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression of CyHV-2 in fishes of 12#

4 討論

俞軍等[10 ]通過(guò)人工感染實(shí)驗(yàn)證明，當(dāng)濃度≥0.5 mL/m3時(shí)，PHMG對(duì)預(yù)防異育銀鯽患鰓出血病保護(hù)率可達(dá)60%以上；而當(dāng)藥物濃度≥0.75 mL/m3時(shí)，PHMG對(duì)治療感染3 d后的鯽保護(hù)率達(dá)63.33%以上。本研究以該研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，同時(shí)綜合分析、考慮成本與效果問(wèn)題，制定用藥方案，進(jìn)行養(yǎng)殖塘內(nèi)驗(yàn)證研究，發(fā)現(xiàn)每10 d使用0.75 mL/m3PHMG潑灑發(fā)病癥狀較輕的12#塘，相對(duì)較每10 d使用0.5 mL/m3PHMG潑灑發(fā)病癥狀較重的11#塘，效果更顯著，后期病毒相對(duì)表達(dá)量降低更顯著。與此同時(shí)，6月份開(kāi)始，11#塘出現(xiàn)死魚情況，約每天死亡100～200尾，而12#只是出現(xiàn)零星死魚。這可能表明，PHMG濃度高于0.75 mL/m3且在發(fā)病初期時(shí)，才能更好地抑制病情發(fā)展。

據(jù)報(bào)道，5月份是鰓出血病的爆發(fā)期，此時(shí)的季節(jié)溫度適宜CyHV-2 病毒繁殖[5]。因此，11#塘的第三批次樣品出現(xiàn)病毒相對(duì)表達(dá)量增加的情況，可能與當(dāng)時(shí)環(huán)境、季節(jié)(4月29日)適宜病毒繁殖有關(guān)。

另外，由于PHMG的作用機(jī)制是通過(guò)其自身所帶正電荷吸附帶負(fù)電的物質(zhì)，而養(yǎng)殖塘內(nèi)水體復(fù)雜，除有害病原外，其它物質(zhì)是否也會(huì)消耗PHMG尚不明確。所以，盡管本研究中所用的兩個(gè)塘相鄰，且日常管理相同，但它們之間水體狀況仍可能差異極大，最終防治效果差異是否僅與PHMG使用量有關(guān)，需更進(jìn)一步研究證明。同時(shí)，本研究因條件限制，未設(shè)置對(duì)照塘，因此研究結(jié)果或存在一定局限性。

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(責(zé)任編輯：鄧 薇)

A pilot study of the effect of polyhexamethylene guanide onCarassiusauratusgibeliohematopoietic necrosis

ZHAO Liang1, ZOU Yi-dong2, HU Kun1, YANG Xian-le1, HUANG Bao-hua3

(1.ShanghaiOceanUniversityNationalPathogenCollectionCentreforAquaticAnimals，Shanghai201306，China;2.JiangsuSkystoneBiotechnologyCo.,LTD，Wuxi214258，China；3.ShanghaiDelonBiologicalEngineeringTechnologyCo.,LTD，Shanghai201400，China)

Using nested-PCR assay and the amplification product assay, we decided the disease ofCarassiusauratusgibelioin two areas of Jiangsu Haifeng Farm is caused by Cyprinid herpesvirusⅡ(CyHV-2), and then respectively treated with 0.5 mL/m3and 0.75 mL/m3Polyhexamethylene guanide (PHMG) each 10 days, sampled regularly, and eventually evaluated the relative expression of CyHV-2 by Real Time PCR. The results showed that the sequence of virus’ CyHV-2 DNA helicase gene is 316bp，and forms an independent branch on the phylogenetic tree with other CyHV-2 strains. After two months treatment, relative expression of CyHV-2 of both treatments decreased significantly, and relative expression of CyHV-2 of the one treating with 0.75 mL/m3PHMG decreased more significantly, and the efficiency is much better.

polyhexamethylene guanide;Carassiusauratusgibelio; crucian carp hematopoietic necrosis; real time PCR; cyprinid herpesvirusⅡ

2016-04-05；

2016-07-21

國(guó)家重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(ZD-2012-345)；上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)項(xiàng)目(ZF1206)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201203085)；國(guó)家863計(jì)劃項(xiàng)目(2011AA10A216)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31172430)

趙 亮(1986-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)。E-mail:574219289@qq.com 通訊作者：楊先樂(lè)。E-mail:xlyang@shou.edu.cn

S948

A

1000-6907-(2017)02-0096-05