聶毅磊 賈緯 曾艷兵 羅立津 陳星偉 莊鴻 陳宏

（1. 福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007；2. 江西省農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所，南昌330200）

兩株好氧反硝化聚磷菌的篩選、鑒定及水質(zhì)凈化研究

聶毅磊1賈緯1曾艷兵2羅立津1陳星偉1莊鴻1陳宏1

（1. 福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007；2. 江西省農(nóng)科院質(zhì)標(biāo)所，南昌330200）

旨在從環(huán)境樣品中篩選對富營養(yǎng)化水體具有良好脫氮除磷效果的好氧反硝化菌。采集福州某養(yǎng)豬場污水處理池中的水樣。通過反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)、BTB培養(yǎng)基平板分離、硝酸鹽還原試驗和藍(lán)白斑篩選法、異染顆粒以及聚-β-羥基丁酸（PHB）顆粒染色試驗，篩選獲得兩株具有脫氮除磷特性的菌株，命名為N1和N2。經(jīng)16S rRNA 基因序列分析，N1和N2分別屬于無色桿菌屬（Achromobacter.sp）和短波單胞菌屬（Brevundimonas.sp）。將菌株N1和N2復(fù)配，獲得脫氮除磷復(fù)合菌FIM-1?？疾炝司陮θ斯ず铣晌鬯透粻I養(yǎng)化水體脫氮除磷的效果。結(jié)果表明，兩株菌在含磷量較低的水體中，對磷的去除率較高，相對于單菌，復(fù)合菌表現(xiàn)出更佳的脫氮除磷效果。

好氧反硝化；聚磷菌；脫氮除磷；富營養(yǎng)化

富營養(yǎng)化（Eutrophication）是指在人類活動影響下，水體接納了過量的氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)，造成水質(zhì)惡化、水體生態(tài)系統(tǒng)和水功能受到阻礙和破壞的現(xiàn)象［1，2］。氮、磷污染物是導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化的主要因素，它們的協(xié)同去除是污水生物處理的主要目標(biāo)。傳統(tǒng)的生物脫氮除磷過程中，反硝化細(xì)菌和聚磷菌之間往往因碳源競爭、泥齡適應(yīng)不統(tǒng)一等問題使得傳統(tǒng)的生物脫氮除磷工藝有著自身難以解決的矛盾［3］。20世紀(jì)80年代以來，研究者發(fā)現(xiàn)了在有氧條件下利用好氧反硝化酶進(jìn)行反硝化作用的好氧反硝化菌［4，5］，從而拓寬了傳統(tǒng)厭氧反硝化現(xiàn)象的認(rèn)識。此類現(xiàn)象也使好氧條件下同時完成反硝化和除磷兩種功能成為可能，有效地解決了原有反硝化除磷技術(shù)不同步的矛盾。

在污水處理的工程中多采用A/O、A2/O、O/A等工藝，這些工藝在工程應(yīng)用中占地大、成本高、運(yùn)行周期長。好氧反硝化菌的應(yīng)用，可以使硝化反硝化在同一環(huán)境下同時進(jìn)行，大大減少占地面積和建設(shè)資金。反硝化過程中產(chǎn)生的堿度可以部分補(bǔ)償硝化過程中損失的堿度，能使系統(tǒng)中的pH值保持相對穩(wěn)定。反硝化階段不需要另外添加碳源，可以減少碳源，降低成本。尤其在水產(chǎn)養(yǎng)殖水體污染物的去除上，由于亞硝酸鹽氮和可溶性磷的有效去除是水產(chǎn)業(yè)亟需解決的關(guān)鍵問題之一，在魚蝦養(yǎng)殖過程中必須充氧來保證水中的溶解氧量，好氧反硝化除磷菌的篩選與應(yīng)用為解決該問題提供了思路。

本研究從福州某養(yǎng)豬場污水處理池中的水樣中篩選獲得兩株具有在好氧狀態(tài)下脫氮聚磷效果的反硝化聚磷菌，并考察了菌株對人工合成污水和富營養(yǎng)化水體脫氮除磷的效果，旨在為好氧反硝化除磷技術(shù)的應(yīng)用與推廣提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 BTB 培養(yǎng)基［6］；限P和P過量的葡萄糖-MOPS 固體培養(yǎng)基［7］；硝酸鹽還原培養(yǎng)基［7］YG培養(yǎng)基［7］；反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基［7］；反硝化除磷培養(yǎng)基（mg/L）：琥珀酸鈉4.72，NaNO20.05，KH2PO40.09，MgSO4·7H2O 1.0，pH7.2；人工合成污水（mg/L）：葡萄糖360，酵母膏80，磷酸二氫鉀 14，七水硫酸鎂 24，氯化銨 60，氯化鈣 18，碳酸氫鈉 24，七水硫酸錳 6，三氯化鐵 0.3，亞硝酸鈉30，硝酸鉀 30，pH7.0，1000 mL水。

1.1.2 主要試劑 格里斯（Griess）試劑Ⅰ：磺胺酸0.5 g，溶于150 mL醋酸溶液（30%），棕色瓶保存。格里斯（Griess）試劑Ⅱ：a-萘胺 0.5 g，加入50 mL蒸餾水中，煮沸后，緩緩加入100 mL醋酸溶液中，保存于棕色瓶子中。二苯胺試劑：二苯胺0.5 g溶于100 mL濃硫酸中，用20 mL蒸餾水稀釋。所用化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 Nikon fci-LZ生物顯微鏡（NIKON儀器（上海）有限公司）；紫外分光光度計（SP752，上海光譜儀器有限公司）；ZHWY-3112B搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）；PCR擴(kuò)增儀（S1000，Bio-Rad公司）；電泳儀（6003EN，上海申能博彩生物科技有限公司）；HH-4恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）；5B-1（F）型COD快速測定儀（聯(lián)華科技）。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 污水樣品采集自福州某養(yǎng)豬場污水處理池中的水樣。

1.2.2 菌種分離 吸取5 mL水樣，加入0.8%無菌生理鹽水100 mL，混勻。按5%（v/v）比例接入反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基中，于28℃、120 r/min的搖床上振蕩富集培養(yǎng)5 d。用0.8%無菌生理鹽水稀釋富集培養(yǎng)液，采用梯度稀釋及涂布法，將培養(yǎng)液均勻涂布于BTB培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)1-2 d。挑取周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)藍(lán)色的單菌落為初篩菌，將菌體接種至裝有10 mL硝酸鹽還原培養(yǎng)基的試管中，培養(yǎng)1、3、5、8 d。每株細(xì)菌做3個平行樣，并設(shè)置不接種的體系作為對照。選取硝酸鹽還原陽性的的菌株點種于限磷和磷過量的葡萄糖-MOPS培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)1-2 d。觀測藍(lán)白斑的生長情況。挑取在兩種培養(yǎng)基上同時都產(chǎn)生藍(lán)斑的菌株，接入反硝化除磷培養(yǎng)基，培養(yǎng)30 h。挑選能夠在有氧條件下高效去除亞硝酸鹽氮及PO43--P 的菌株，接種到Y(jié)G培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)24 h。挑取細(xì)菌，按常規(guī)制成涂片，采用蘇丹黑染色法進(jìn)行PHB染色［8］。再好氧培養(yǎng)24 h。挑取細(xì)菌，按常規(guī)制成涂片，利用Albert染色法進(jìn)行Poly-P染色［9］。

1.2.3 菌種DNA的提取、擴(kuò)增和分析 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液5 mL，8 000 r/min離心10 min，傾去上清液，收集菌體。采用CTAB/NaCl法［10］提取菌體基因組DNA。步驟如下：菌體中加入1.35 mL TE溶液（pH8.0），懸浮，加入0.3 mL 10%十二烷基硫酸鈉（SDS）、100 μL 100 mg/mL溶菌酶和100 μL 100 mg/mL蛋白酶K，混勻，60℃水浴1 h，加0.25 mL 5 mol/L NaCl和0.2 mL CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10 min，以等體積的苯酚/氯仿/異戊醇和氯仿/異戊醇各抽提1次，異丙醇沉淀DNA，DNA溶于50 μL TE中，-20℃保存?zhèn)溆?。利?%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對提取的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的DNA 產(chǎn)物送至上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。用BLAST軟件與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的的16S rRNA序列進(jìn)行比對分析。

1.2.4 菌株拮抗試驗 采用平板對峙法觀察菌株之間有無拮抗作用，選取其中一株菌作為指示菌，其余菌株以十字劃線的方式接種到含有指示菌的平板上，培養(yǎng)72 h至更長，觀察有無抑菌現(xiàn)象的出現(xiàn)。

1.2.5 人工合成污水吸磷實驗 用接種環(huán)從斜面挑起少量菌體，接入YG培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min培養(yǎng)3-4 d至對數(shù)生長期，菌液8 000 r/min離心5 min，棄上清液得到菌體，用0.8%生理鹽水洗去菌體上的培養(yǎng)基，用無菌水溶解，離心，棄上清液得到菌體，重復(fù)3次，獲得單株菌菌體。稱取等量的以上單株菌菌體混合配比成復(fù)合菌劑。

將上述制備的菌體分別以1%的接種量接入人工合成污水中。28℃、120 r/min培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液8 000 r/min離心5 min，吸取上清液測定其中的磷含量。

1.2.6 富營養(yǎng)化水體的凈化實驗 采集福州某富營養(yǎng)化河水（COD在100 mg/L以下）作為實驗對象。量取10 L河水，加入到處理容器中，設(shè)置實驗組和對照組，實驗組分別投加2.5%（v/v）的單菌菌體和復(fù)合菌體，在室溫下采用間歇曝氣方式，即曝氣8 h，停曝16 h。不同時間取樣測定水中總氮、NO3--N和總磷的含量。

1.2.7 測定方法 總氮采用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，NO3--N采用二苯胺試劑檢測；總磷采用過硫酸鉀氧化-鉬酸銨分光光度法測定［11］。

2 結(jié)果

2.1 富集、分離培養(yǎng)

經(jīng)反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基富集和BTB平板劃線純化后共獲得89個單菌落，其中65株菌硝酸鹽還原陽性。從限磷和磷過量的葡萄糖-MOPS培養(yǎng)基上挑取能同時產(chǎn)生藍(lán)斑的單菌落，共獲得21個單菌落。對該21株細(xì)菌進(jìn)行反硝化除磷性能的比較研究，最終篩選出兩株能夠在有氧條件下去除亞硝酸鹽氮及PO43--P 的菌株，它們對亞硝酸鹽氮的去除率可達(dá)80.5 %、84.2%，對PO43--P 的去除率可達(dá)87.2 %、80.4%。菌株N1和N2經(jīng)堿性美藍(lán)染色后顯微鏡油鏡觀察（圖1，圖2）。

圖1 菌株N1堿性美藍(lán)染色形態(tài)（1 000×）

圖2 菌株N2堿性美藍(lán)染色形態(tài)（1 000×）

菌株N1和N2經(jīng)蘇丹黑染色法和Albert染色法染色后油鏡觀察。在培養(yǎng)過程中菌株N1和N2菌體內(nèi)均有poly-P和PHB累積。由于N1和N2的染色結(jié)果相類似，所以以N1的染色圖片（圖3，圖4）為代表?？梢钥闯?，菌株N1經(jīng)蘇丹黑染色法染色后，膜內(nèi)除細(xì)胞質(zhì)外有明顯的黑色顆粒，說明胞內(nèi)有PHB。菌體呈粉紅色，類脂粒呈藍(lán)黑色。通常聚磷菌體內(nèi)PHB為細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)儲存能量的脂質(zhì)內(nèi)含物。它分解產(chǎn)生能量，一部分供聚磷菌正常的生長繁殖，另一部分供其主動吸收環(huán)境中的磷合成聚磷。圖4可以看出，菌株N1經(jīng)Albert染色法染色后菌體呈綠色，poly-P呈黑色。

圖3 菌株N1的PHB顆粒染色

圖4 菌株N1的poly-P染色

2.2 菌株16S rRNA的鑒定

用BLAST軟件將菌株N1和N2與NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的的16S rRNA序列進(jìn)行比對分析。N1與 Achromobacter sp. NT 5-04的16S rRNA基因序列的相似性為99%，鑒定為無色桿菌屬（Achromobacter sp.）。N2與 Brevundimonas sp. H208和Brevundimonas sp. KACC10191 的相似性分別為100%和99%，鑒定為短波單胞菌屬（Brevundimonas sp.）。

2.3 菌株拮抗試驗

通過菌株之間的拮抗試驗，確定菌株N1和N2之間無拮抗作用，將菌株N1和N2等量配比，獲得復(fù)合菌FIM-1，進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.4 人工合成污水吸磷實驗

人工合成污水吸磷實驗結(jié)果（表1）表明，菌株N1、N2和復(fù)合菌FIM-1具有一定的除磷效果，但隨著水體中磷含量的增加，磷的去除率明顯下降，說明這兩株菌可能更適合于低濃度磷廢水的凈化。

表1 菌株對不同磷濃度的人工合成污水中磷的去除率

2.5 富營養(yǎng)化水體的凈化實驗

富營養(yǎng)化水體的凈化實驗結(jié)果（圖5）表明，加入菌劑的試驗組的總氮和總磷初始階段均呈下降趨勢，總氮至40 h降至最低，隨后上升，對照組的總氮在18 h內(nèi)上升，18 h后下降（加入N1、N2、FIM-1和對照組CK的總氮在40 h內(nèi)去除率分別為9.20%、17.16%、32.84%和4.72%）。總磷則至18 h降至最低（加入N1、N2、FIM-1和對照組CK的總磷在18 h內(nèi)去除率分別為14.04%、8.77%、28.95%和2.63%），隨后上升，可能是后期菌體自溶釋放出磷，導(dǎo)致水體中磷濃度上升。加入菌劑的實驗組對總氮、總磷的去除效果均優(yōu)于空白對照組，而混合菌對總氮、總磷的去除效果優(yōu)于單菌。

圖5 富營養(yǎng)化水體脫氮（A）除磷（B）實驗結(jié)果

3 討論

目前已報道的好氧反硝化細(xì)菌主要?dú)w屬于假單胞菌屬（Pseudomonas sp.）、克雷伯菌屬（Klebsiella sp.）、紅球菌屬（Rhodococcus sp.）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes sp.）、動膠菌屬（Zoogloea sp.）、副球菌屬（Paracoccus sp.）、蒼白桿菌屬（Ochrobacterium sp.）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium sp.）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）等［12-16］，本研究中篩選獲得的無色桿菌屬（Achromobacter.sp）和短波單胞菌屬（Brevundimonas.sp）在好氧反硝化細(xì)菌的研究報道中較少見。

雖然好氧反硝化技術(shù)引起越來越多的關(guān)注，但是在好氧條件下反硝化和除磷的研究報道甚少。于大禹等［17］研究了一株假單胞菌的好氧脫氮除磷的效能。Ma等［18］探討了不同氧濃度對農(nóng)桿菌Agrobacterium sp. LAD9脫氮除磷的影響。馬放等［19］分離到一株高效除磷的芽孢桿菌。安健等［20］從養(yǎng)蝦塘中篩選到在有氧條件下同時具有反硝化和除磷功能的蠟樣芽胞桿菌。本研究中篩選獲得具有好氧反硝化脫氮除磷特性的無色桿菌屬和短波單胞菌屬菌株，擴(kuò)大了好氧反硝化聚磷菌的菌源。

根據(jù)生物除磷代謝機(jī)理模式可知，厭氧/好氧或厭氧/缺氧環(huán)境的交替變化都可以誘導(dǎo)磷的超量吸收，前者以分子氧作為電子受體、后者以NO3-作為電子受體。由于NO3--N 電子受體傳遞鏈短、氧化還原電位低，產(chǎn)生ATP 只有氧電子受體的2/3，因此，從生物除磷的角度分析，缺氧吸磷的效果不如好氧吸磷［21，22］。在序批式生物膜工藝中，缺氧反硝化吸磷速率較好氧反硝化吸磷速率明顯降低，約為好氧吸磷速率的1/6［23］；方茜等［24］考察了SBR 系統(tǒng)內(nèi)DO 濃度對反硝化除磷的影響，發(fā)現(xiàn)在有氧條件下，更有利于反硝化除磷效率的發(fā)揮，因此好氧反硝化聚磷菌在實際廢水脫氮除磷工藝中具有更好的應(yīng)用潛力，應(yīng)加強(qiáng)對此方面的深入研究。

雖然投加篩選到的某些高效菌株對特定廢水進(jìn)行處理能夠在一定程度上彌補(bǔ)活性污泥工藝的不足，但單一聚磷菌在實際應(yīng)用中因影響因素較多，并不能很好表現(xiàn)超量聚磷特性。本研究也證實了此觀點，篩選到的兩株反硝化聚磷菌在實際的富營養(yǎng)化水體初步凈化試驗中，雖然對總氮和總磷具有一定的去除能力，但其脫氮除磷效果尚不理想。但復(fù)合菌劑FIM-1表現(xiàn)出比單菌N1和N2更顯著的脫氮除磷效果，說明投加優(yōu)勢菌株的生物強(qiáng)化技術(shù)在實際應(yīng)用中，須考慮各類微生物協(xié)同脫氮除磷的作用。在加入菌劑的初始期總磷和總氮下降明顯，因此可根據(jù)此特性調(diào)整處理工藝以提高脫氮除磷效率。特定菌株的反硝化特性與碳源類型、碳氮比、溫度、鹽度、溶解氧和 pH 等因素有關(guān)［25-30］，后續(xù)將進(jìn)行該方面的相關(guān)研究。

即使是經(jīng)過運(yùn)行穩(wěn)定的污水處理系統(tǒng)處理過的污水（磷含量在1.0 mg/L以下），排入自然水體后，磷含量仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出使水體呈現(xiàn)安全狀態(tài)的16-30倍，仍舊會引發(fā)“藻華”的爆發(fā)，不能有效防止富營養(yǎng)化的發(fā)生。所以，在當(dāng)前污水除磷的基礎(chǔ)上，對于已經(jīng)處理的出水及其它磷濃度相對較低（1.0 mg/L左右）的污水進(jìn)行進(jìn)一步的除磷，也是非常必需和重要的。該無色桿菌N1和短波單胞菌N2及其復(fù)合菌FIM-1較適合于低濃度磷廢水的凈化。因而有必要對其在低濃度磷廢水凈化中的應(yīng)用做進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本實驗從福州某養(yǎng)豬場污水處理池的底泥樣品中分離獲得2株反硝化聚磷菌N-1和N-2，其屬于無色桿菌屬和短波單胞菌屬。將菌株N-1和N-2復(fù)配，獲得脫氮除磷復(fù)合菌FIM-1。富營養(yǎng)化水體的凈化實驗結(jié)果表明，加入單菌N1、N2和復(fù)合菌FIM-1的富營養(yǎng)化水體的總氮在40 h內(nèi)去除率分別為9.20%、17.16%和32.84%，而總磷在18 h內(nèi)去除率分別為14.04%、8.77%和28.95%，復(fù)合菌比單菌表現(xiàn)出更佳的脫氮除磷效果。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Screening and Identification of Two Aerobic Denitrifying Phosphorusaccumulating Strains，and Denitrifying Biological Phosphorus Removal

NIE Yi-lei1JIA Wei1ZENG Yan-bing2LUO Li-jing1CHEN Xing-wei1ZHUANG Hong1CHEN Hong1
（1. Fujian Institute of Microbiology，F(xiàn)ujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，F(xiàn)uzhou 350007；2. Agricultural Product Quality Safety and Standards Institute， Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang 330200）

It is aimed to screen highly-efficient aerobic denitrification bacterium simultaneously removing nitrogen and phosphorus（P）from the piggery wastewater sample in a pig farm of Fuzhou. Two effective strains，named as N1 and N2，were acquired by culturing with medium for denitrification strain，then isolating with the BTB streak plate，further screening with the blue- and white-colored spot，and finally dyeing with metachromatic granules and PHB（poly-β-hydroxybutyrate）granule. By 16S rRNA gene sequence analyses，two strains were identified as Achromobacter sp. and Brevundimonas sp.，respectively. Combined strain FIM-1 was formulated with N1 and N2. The effectiveness of their removing the nitrogen and phosphorus in artificial wastewater and eutrophic water was investigated. The results showed that the removal rate of nitrogen by N1，N2，and FIM-1 at 40 h was 9.20%，17.16%，and 32.84% respectively，and the removal rate of total P at 18 h was 14.04%，8.77%，and 28.95%，respectively，indicating that FIM-1 performed better than the single ones.

aerobic denitrification；phosphorus-accumulating organisms（PAOs）；nitrogen and phosphorus removal；eutrophication

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.017

2016-06-16

福建省公益類科研院所專項（2014R1009-9），福建省科技重大專項（2013YZ0001-1），江西省自然科學(xué)基金（20142BBF60019）

聶毅磊，男，碩士，副研究員，研究方向：生物工程；E-mail：nie2050@sina.com

陳宏，碩士，高級工程師；研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：peaceful88@163.com