歐云文 馬小元 張杰 丁耀忠 張永光 賈寧

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046）

豬細小病毒1型VP2基因的原核表達及反應(yīng)原性分析

歐云文1，2馬小元2張杰2丁耀忠2張永光2賈寧1

（1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國家重點實驗室，蘭州 730046）

旨在研究豬細小病毒1型（PPV1）VP2蛋白（第155-439位氨基酸）的抗原性，為開發(fā)PPV1的檢測方法奠定基礎(chǔ)。以PPV1型AV31株的DNA為模板，擴增獲得849 bp的目的片段，擴增產(chǎn)物克隆入pET30a（+）原核表達載體，構(gòu)建pET30a-PPV1-VP2（155-439 aa）重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）；在37℃，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達6 h；采用Ni-NTA樹脂親和層析純化重組蛋白，并用不同濃度的尿素對純化蛋白進行復(fù)性。SDS-PAGE分析表明，該VP2編碼基因在大腸桿菌中得到表達，蛋白大小約為39 kD；Western blot檢測結(jié)果表明，該重組蛋白與PPV1陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，與NA-PRRSV和PCV2陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。該實驗成功構(gòu)建了PPV1-VP2（155-439 aa）原核表達載體，實現(xiàn)了在大腸桿菌中的表達，純化后的復(fù)性蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

豬細小病毒1型；VP2基因；原核表達；反應(yīng)原性

豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）屬于細小病毒科細小病毒屬，是一種自主復(fù)制型病毒，是造成母豬繁殖障礙性疫病的主要病原體之一；母豬感染該病毒后可導(dǎo)致流產(chǎn)、木乃伊胎及死胎等，其給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失；Mary與Mahnel在1966年首次發(fā)現(xiàn)了該病毒，而后發(fā)展到世界多個國家和地區(qū)；在20世紀80年代，我國的多個地方都分離發(fā)現(xiàn)豬細小病毒?。?］。目前，隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的發(fā)展，PPV2、PPV3、PPV4、PPV5和PPV6等幾個新型豬細小病毒已被發(fā)現(xiàn)，這幾個新型的PPV在基因組方面，尤其是在VP2基因方面存在較大差異性；雖然研究者在一定程度上對其臨床發(fā)病率和潛在作用進行了相關(guān)研究，但是其致病性尚不清楚［2-4］。PPV1是豬細小病毒家族中重要的成員，也是豬群中最常見的豬細小病毒型［5］。與此同時，PPV1常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬圓環(huán)病毒（PCV）等繁殖性障礙病毒混合感染而導(dǎo)致豬只發(fā)病，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失［6］。因而，加強豬細小病毒的研究，對有效預(yù)防和控制PPV而言都有著重要意義。

PPV病毒為單股線狀DNA病毒，病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，基因組全長約為5 kb，含有2個主要的開放閱讀框（ORF），其中ORF1編碼3個非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NS2、NS3；ORF2編碼2個結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2，VP2可進一步水解為VP3［7］。組成核衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白是VP2，其分子大小為64 kD，由579個氨基酸構(gòu)成，VP2具有良好的抗原性，在病毒的致病性方面起著重要重要，并且可以誘導(dǎo)動物機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)［8］。有研究者發(fā)現(xiàn)，在VP2的第60-68位、第81-88位、第266-275位、第351-357位、第398-404位氨基酸是主要的抗原位點區(qū)域［9］。因此，本研究主要以NADL-2經(jīng)典毒株的VP2基因為參考序列，以豬細小病毒AV31毒株的DNA為模板，設(shè)計了編碼VP2蛋白第155-439位氨基酸的表達引物，誘導(dǎo)表達該氨基酸片段，并對表達產(chǎn)物進行鑒定，探討該重組蛋白的反應(yīng)原性，為后續(xù)的診斷方法或試劑盒的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET30a（+）載體購于Novagen公司，DNA Marker、蛋白Marker、BamH I、Xho I限制性酶都購于TaKaRa公司，質(zhì)粒小量制備試劑盒、DNA膠回收試劑盒、PCR清潔試劑盒都購于AxyPrep公司，Taq DNA聚合酶購自Fermentas公司，異丙基-β-D-硫代半乳糖甘（IPTG）、辣根過氧化物酶（HRP）標記兔抗豬IgG購于SIGMA公司，即用型透析袋購于Spectrum公司，蛋白胨、酵母提取物購自 OXOID（英國）公司，Ni-NTA樹脂購于QIAGEN公司，AV31毒株購于中國獸藥監(jiān)察所，卡那霉素購于Hyclone公司，PPV1陽性血清為采用豬細小病毒滅活疫苗（WH-1株）（購于中牧實業(yè)股份有限公司）制備的高免陽性血清、NA-PRRSV陽性血清、PCV2陽性血清購于VMRD公司，NA-PRRSV-重組N蛋白、PCV2-重組Cap蛋白由本實驗室自己制備，并且都有較好的抗原性；感受態(tài)大腸桿菌Trans109和BL21（DE3）均為本實驗室保存，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank公布的NADL-2經(jīng)典毒株的VP2基因為參考序列，設(shè)計VP2蛋白的第155-439位氨基酸編碼區(qū)的表達特異性引物，在上游引物上加上BamH I限制性酶切位點，在下游引物上Xho I限制性酶切位點。上游引物P1：5'-CAGGATCCGCAACCTCACCACC-3'；下游引物P2：5'-GCCTCGAGATGCATGTTAGATTTCCC-3'，引物由Invitrogen（上海）公司合成。

1.2.2 病毒DNA提取與PCR擴增 按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒的操作說明提取PPV 1型AV31細胞毒株的DNA，以抽提的DNA為模板，采用50 μL反應(yīng)體系，即Ex-Taq酶25 μL，上下游引物各1 μL，模板 2.5 μL，補水至50 μL。反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，進行35個循環(huán)；72℃延伸10 min。取10 μL擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，樣品于-20℃保存。

1.2.3 pET30a-PPV-VP2重組載體的構(gòu)建與鑒定 利用BamH I和Xho I分別對pET30a（+）載體和DNA凝膠回收產(chǎn)物進行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為：PCR膠回收產(chǎn)物或pET30a（+）載體20 μL，10×K Buffer 3 μL，BamH I 2 μL，Xho I 2 μL，ddH2O 3 μL，總體體積為30 μL。輕微振蕩混勻，瞬時離心，先放入30℃水浴3 h，再37℃水浴3 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)T4連接酶16℃連接過夜，取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于Trans109大腸桿菌感受態(tài)細胞，涂布于含卡那霉素抗性的LA平板上，37℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落過夜培養(yǎng)，離心收菌，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行BamH I、Xho I酶切鑒定。將構(gòu)建成功的pET30a-PPV1-VP2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)細胞，并按上述相同方法培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，對質(zhì)粒分別進行PCR鑒定和BamH I、Xho I酶切鑒定。反應(yīng)產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，同時將陽性重組質(zhì)粒送往GENEWIZ（金唯智）公司進行測序。

1.2.4 重組蛋白表達及SDS-PAGE電泳鑒定 分別設(shè)置終濃度為0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L的IPTG，誘導(dǎo)溫度為25℃、30℃、37℃，誘導(dǎo)時間為6 h、12 h、24 h，優(yōu)化誘導(dǎo)表達條件；將篩選出的陽性重組質(zhì)粒的表達菌（即BL21（DE3）大腸桿菌感受態(tài)）于37℃振蕩培養(yǎng)約3 h，至OD600為0.6-1.0時，加入終濃度為1 mmol/L IPTG于37℃誘導(dǎo)6 h，12 000 r/min離心收菌，ddH2O懸浮洗滌，對菌體進行SDSPAGE電泳分析，觀察重組蛋白表達情況，再對重組菌體懸浮液進行超聲破碎，離心收集上清裂解液和沉淀，分別進行SDS-PAGE電泳分析，分析重組蛋白的存在方式。

1.2.5 重組蛋白Ni-NTA樹脂純化及復(fù)性 對以包涵體形式表達的重組蛋白分別用包涵體洗滌緩沖液（pH8.0）、2 mol/L尿素洗滌2-3次，離心棄上清液保留沉淀，再用Buffer B（pH8.0）溶解包涵體沉淀，離心棄沉淀保留上清液。將樣品與Ni- NTA樹脂室溫結(jié)合40 min，上柱，然后分別用Buffer C（pH6.3）、Buffer D（pH5.9）、Buffer E（pH4.5）洗滌柱子，并分別收集對應(yīng)積份，對每個積份進行SDS-PAGE分析，確定目的蛋白存在于何種積份，并測定含有目的蛋白條帶積份的OD280值。再將純化后的蛋白液依次放于8 mol/L尿素、4 mol/L尿素、2 mol/L尿素、1 mol/L尿素、PBS液中進行透析復(fù)性，每種透析液透析時間為6 h，最后對復(fù)性蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 重組蛋白的Western blot分析 純化的未復(fù)性VP2蛋白和復(fù)性VP2重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加PPV1陽性血清（1∶100稀釋）于室溫搖床孵育1 h，PBST緩沖液洗滌PVDF膜3遍，再加HRP標記的豬二抗（1∶5 000稀釋）于室溫搖床孵育1 h， PBST緩沖液洗PVDF膜3遍，HRP-DAB底物顯色試劑避光顯色10 min，暗室中曝光，同時設(shè)pET30a空載體誘導(dǎo)表達菌作為陰性對照；采用上述相同的方法將復(fù)性VP2重組蛋白與NA-PRRSV-重組N蛋白，復(fù)性VP2重組蛋白與PCV2-重組Cap蛋白分別轉(zhuǎn)印至2張PVDF膜，脫脂奶粉封閉，分別加美洲型豬繁殖與呼吸綜合征病毒（NA-PRRSV）陽性血清（1∶100稀釋）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）陽性血清（1∶100稀釋）作為一抗，再加HRP標記的兔抗豬二抗（1∶5000稀釋），顯色曝光。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增結(jié)果

以PPV 1型AV31細胞毒株的DNA為模板，P1、P2為引物，擴增獲得1條約849 bp的目的片段（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符合。

圖1 PPV1-VP2片段PCR擴增

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

構(gòu)建的重組質(zhì)粒pET30a-PPV1-VP2經(jīng)PCR鑒定，獲得849 bp的部分VP2基因目的片段，而陰性對照無目的條帶（圖2）；重組質(zhì)粒經(jīng)BamH I、Xho I酶切鑒定，獲得849 bp的VP2基因片段和5 422 bp的pET30a（+）載體片段，而陰性對照無目的條帶（圖3）。

2.3 重組蛋白表達、Ni柱純化及復(fù)性結(jié)果

BL21（DE3）表達菌在不同誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間下進行誘導(dǎo)表達，實驗結(jié)果表明，不同誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間對目的蛋白的表達量無顯著影響，但誘導(dǎo)劑濃度越高，誘導(dǎo)時間越長，則雜蛋白條帶越多；在IPTG終濃度為1 mmol/L、誘導(dǎo)溫度37℃、誘導(dǎo)時間6 h的條件下對重組表達菌進行誘導(dǎo)表達，經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，發(fā)現(xiàn)表達產(chǎn)物的分子量約為39 kD（圖4），與理論值相一致，同時發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體形式存在。Ni-NTA樹脂純化的目的蛋白主要集中于E2-E7積份，其中在E3-E6階段出現(xiàn)較集中的洗脫峰（表1、圖5）。并且復(fù)性后的重組蛋白較純于未復(fù)性的重組蛋白，幾乎無其他雜蛋白帶（圖4）。

圖2 重組質(zhì)粒PCR鑒定

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

圖4 PPV-VP2重組蛋白SDS-PAGE分析

表1 各積份的蛋白濃度

圖5 各積份的蛋白濃度

2.4 重組蛋白的Western blot分析結(jié)果

表達蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，用PPV1陽性血清檢測重組蛋白的反應(yīng)原性。結(jié)果（圖6-B）表明，在39 kD處出現(xiàn)特異性的顯色條帶，而pET30a空載體處無特異性條帶。因此，PPV1-VP2重組蛋白與PPV陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有良好的反應(yīng)原性。同時，復(fù)性后的純化重組蛋白不與PCV2、NA-PRRSV陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)（圖6-A），這表明該重組蛋白具有很好的特異性。

3 討論

豬細小病毒作為引起母豬繁殖障礙性疫病的主要病原體之一，導(dǎo)致感染母豬出現(xiàn)流產(chǎn)等癥狀，給國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失；PPV主要分為NADL-2株、NADL-8株、Kresse株、腸炎型毒株4種類型，但這4類毒株共用一種血清型［10］，目前在中國大陸較為高發(fā)的毒株是JSNJ62［11］。近年來，有學(xué)者采用PK-15等細胞系對PPV的增殖及感染機制進行研究，取得豐碩的成果［12-14］，Ren等［15］對PPV的系統(tǒng)發(fā)育與演變進行了研究，發(fā)現(xiàn)在大約250年前，PPV擁有共同祖先。VP2是組成豬細小病毒衣殼的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其具有良好的免疫原性，VP2基因被VP1基因完全包含于內(nèi)，研究者發(fā)現(xiàn)暴露在外的378、383、436等幾個氨基酸殘基決定著PPV的趨向性和毒力，該位點主要通過與宿主的多細胞因子反應(yīng)發(fā)揮其作用，而不是與宿主細胞表面的受體［16］。Sun等［17］通過研究桿狀病毒表達的重組PPV1-VP2蛋白來鑒定3種VP2蛋白特異性B細胞的線性表位，明確了VP2抗原的結(jié)構(gòu)，以及為PPV1-VP2血清學(xué)診斷和抗原檢測奠定基礎(chǔ)。大腸桿菌表達載體作為成熟的表達載體，其擁有生長速度快、便于培養(yǎng)等特點，并且其中的pET30a載體可用于目的基因的大量誘導(dǎo)表達［18］。

圖6 PPV1-VP2重組蛋白Western blot分析

本實驗通過擴增豬細小病毒1型VP2序列的第469-1317位基因（長度為849 bp），構(gòu)建pET30a-PPV1-VP2重組表達載體，BamH I、Xho I酶切鑒定呈陽性。重組大腸桿菌表達系統(tǒng)在IPTG的誘導(dǎo)下，誘導(dǎo)表達出大小約為39 kD的重組VP2蛋白，研究發(fā)現(xiàn)目的蛋白以包涵體形式存在。通過Ni-NTA樹脂對包涵體蛋白進行純化，得到較高純度的目的重組蛋白，并對純化后蛋白進行復(fù)性處理；研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)性后的重組蛋白純度高于復(fù)性前，由于蛋白復(fù)性是一個復(fù)雜的過程，這可能是重組蛋白在恢復(fù)高級結(jié)構(gòu)的過程中，在蛋白疏水鍵的形成以及透析膜的濾過等作用下，對重組蛋白完成了一定程度的純化作用［19］。重組VP2蛋白與PPV1陽性血清進行Western blot反應(yīng)呈陽性，與NA-PRRSV、PCV2陽性血清Western blot反應(yīng)呈陰性，表明該重組蛋白具有很好的反應(yīng)原性，并且不與NA-PRRSV、PCV2陽性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。

4 結(jié)論

本實實驗成功構(gòu)建了pET30a-PPV1-VP2（155-439 aa）原核表達載體，實現(xiàn)了VP2基因在大腸桿菌中的表達，純化后的復(fù)性重組VP2蛋白具有較好的反應(yīng)原性。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression of Gene VP2 of Porcine Parvovirus Type 1 and the Reactinogenicity Analysis of the Expressed Protein

OU Yun-wen1，2MA Xiao-yuan2ZHANG Jie2DING Yao-zhong2ZHANG Yong-guang2JIA Ning1
（1. College of Veterinary Medicine，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070；2. State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology，Lanzhou Veterinary Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730046）

This experiment is aimed to study the antigenicity of VP2 protein（amino acid 155-439）of porcine parvovirus type 1（PPV1）for laying a base for the development of detecting PPV1. The 849 bp target fragment was amplified using the DNA of strain AV31of PPV1 as the template. The product was cloned into pET30a（+）vector，and recombinant plasmid pET30a-PPV1-VP2（amino acid 155-439）was constructed，then transferred into Escherichia coli BL21（DE3）for the 6 h induced expression by IPTG. The recombinant protein was purified by Ni-NTA，and refolded by different concentration of urea. The results of SDS-PAGE showed that the gene VP2 was successfully expressed in E. coli BL21（DE3）with a relative molecular weight of 39 kD. The results of Western blot showed that this recombined protein specifically reacted with PPV1 positive serum，while no cross reaction with NA-PRRSV and PCV2 positive serum. This study achieved the aims：the recombinant vector pET30a-PPV1-VP2 was successfully constructed，and the gene was successfully expressed in E. coli，and the purified and re-folded protein demonstrated promising reactinogenicity .

porcine parvovirus type 1（PPV1）；VP2 gene；prokaryotic expression；reactinogenicity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.024

2016-08-09

國家國際合作項目（2012DFG31890），國家自然科學(xué)基金項目（31072143）

歐云文，男，碩士，研究方向：人獸共患病及公共衛(wèi)生學(xué)研究；E-mail：oyw813@163.com

賈寧，男，博士，教授，研究方向：人獸共患病及獸醫(yī)病理學(xué)研究；E-mail：1963jianing@163.com