嚴寬 陳放 魏琴 馮瑞章 周萬海 周敏

（1. 四川大學生命科學學院，成都 610044；2. 宜賓學院生命科學與食品工程學院，宜賓 644000）

內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油積累及生理生化特性的影響

嚴寬1，2陳放1魏琴2馮瑞章2周萬海2周敏2

（1. 四川大學生命科學學院，成都 610044；2. 宜賓學院生命科學與食品工程學院，宜賓 644000）

旨在研究內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油積累及生理生化特性的影響。以4株內(nèi)生真菌（2J1、3J1、5J2、YB）作為材料，將內(nèi)生真菌孢子懸浮液均勻噴灑在油樟葉片上進行處理后，提取油樟葉片中的揮發(fā)油，利用GC-MS測定揮發(fā)油中1，8-桉葉油素、α-松油醇的量。結果顯示，采用2J1和3J1兩種內(nèi)生真菌對油樟進行處理，在處理21 d時揮發(fā)油含量達到最大值，其主要成分1，8-桉葉油素分別比對照高出201.53%、174.47%，α-松油醇高出364.14%、307.29%，且過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MOD）的含量有顯著提高；由5J2和YB處理的油樟揮發(fā)油含量、POD與CAT活性以及MOD含量與對照相比差異均不顯著。采用2J1和3J1處理油樟植株，能有效提高油樟揮發(fā)油的含量。

內(nèi)生真菌；油樟；揮發(fā)油；生理生化特性

油樟［Cinnamomum longepaniculatum（Gamble）N. Chao］屬樟科、樟屬，是國家Ⅱ級重點保護植物（國務院1999年8月4日批準）和我國特有且盛產(chǎn)天然芳香油的主要樹種之一，在林業(yè)生產(chǎn)上占有重要地位。因其根、枝、葉、木材均可提取樟油而揚名天下，油樟葉中提取的芳香油主要成分為萜類物質(zhì)，其中已報道有重要經(jīng)濟價值的1，8-桉葉油素、α-松油烯、α-松油醇等成分是國防、輕工，香料、醫(yī)藥、食品工業(yè)及軍工等燴烯及冰片方面的稀有原料［1-3］。隨著社會經(jīng)濟和人們生活水平地不斷提高，對于油樟這種天然香料油的需求倍增，供需矛盾十分突出［4］。再加上植物中次生代謝產(chǎn)物含量不穩(wěn)定以及環(huán)境制約等因素的影響，油樟油的產(chǎn)量與品質(zhì)得不到保證。鑒于此，如何利用新的技術和手段大幅提高油樟油的產(chǎn)量，更有效、低成本和可持續(xù)獲得油樟油，己成為油樟資源及植物芳香油研究的重要內(nèi)容和新的發(fā)展方向。目前對于油樟研究相對深入的是光照、溫度、濕度等外環(huán)境生物因素，而忽視了微生物等內(nèi)環(huán)境因素的作用，特別是內(nèi)生真菌的作用，且研究主要集中在內(nèi)生真菌的生物多樣性［5-8］、次生代謝產(chǎn)物及生物活性多樣性［9-11］和內(nèi)生真菌與宿主之間的相互關系［12-14］等方面，而對于內(nèi)生真菌影響植物次生代謝產(chǎn)物合成與積累及其作用機制的研究不夠深入。本研究以油樟的內(nèi)生真菌為研究對象，通過研究內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油（1，8-桉葉油素、α-松油醇）積累的影響，揭示出內(nèi)生真菌影響油樟油產(chǎn)量和品質(zhì)的機制，并為后續(xù)相關調(diào)控基因的克隆和油樟次生代謝物質(zhì)合成的人工調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

所有供試油樟種子均來源于宜賓紅巖山油樟基地，并由宜賓學院魏琴教授鑒定；油樟幼苗由種子萌發(fā)而來，并參照姚祥等［15］的方法對種子進行不帶菌處理；4株內(nèi)生真菌2J1（Penicillium commune）、3J1（Neurospora crassa）、5J2（Aspergillus fumigatus）和YB（Penicillium paneum）前期從油樟植株中分離并進行鑒定，采用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)保存。

儀器與設備：GC-MS（7890A-5975c，Agilent），高壓蒸汽滅菌鍋（MLS-3780，日本），雙光束紫外可見分光光度計（TU-901，北京普析通用儀器有限公司），高速冷凍離心機（Sorvall LYNX 6000，Thermos），超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離與純化 采集新鮮油樟植株外植體（莖、葉），用自來水反復沖洗后，切割成小段，然后進行表面消毒：0.1%升汞消毒5-8 min，無菌水沖洗3次后，再用75%乙醇消毒20 s，無菌水沖洗3次后，將消毒后的外植體剪切成0.3-0.5 cm小片，接種于PDA平板上，28℃培養(yǎng)8-10d，待樣品邊緣有菌絲長出，切取組織塊邊緣菌絲進行繼續(xù)培養(yǎng)，不斷轉接分離，直至純化。

1.2.2 內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油積累的影響 將純化后的內(nèi)生真菌接種至PDA培養(yǎng)基平面，置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后，用滅菌水將分生孢子洗下，配制成孢子濃度為2.0×105個/mL的分生孢子懸浮液，用于接種處理。選擇生長健壯均一，苗齡為3個月的油樟幼苗栽植于無菌土壤的花盆中（15 cm×12 cm），適應性培養(yǎng)7 d后，將上述配制的分生孢子懸浮液均勻噴灑在油樟葉片上，同時以無菌水噴灑接種為對照，每處理設6次重復，測定揮發(fā)油含量和生理生化指標。

1.2.3 揮發(fā)油含量的測定 精確稱取一定量的油樟葉片，加4倍量（1∶4）的環(huán)己烷過夜冷浸，之后超聲15 min，5 000 r/min離心4 min后取上清液，并定容到一定體積。色譜條件：HP-5MS色譜柱，30 m×0.250 mm；柱溫60℃；進樣體積1 μL；程序升溫：從60℃開始以10℃/min上升至190℃并保持2 min，之后以5℃/min上升至210℃保持2 min，再以10℃/min上升至220℃保持8 min。同時，分別稱取適量的1，8-桉葉油素和α-松油醇對照品，用環(huán)己烷定容至5 mg/mL的溶液，再用環(huán)己烷稀釋后注入GC-MS測定，即得標準曲線（1，8-桉葉油素：y=73 900x-29 920，R2=0.999 3；α-松油醇：y=51 620x+16 220，R2=0.999 2）。

1.2.4 油樟葉片粗酶液的制備 取0.50 g新鮮葉片，加入0.01 g PVP，5 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.8，含有0.2 mmol/L EDTA，β-疏基乙醇0.4 mmol/L）冰浴研磨，低溫（4℃），12 000 r/min離心10 min后，所得上清液為待測液。

1.2.5 過氧化氫酶（CAT）活性的測定 取100 μL待 測 液 中加入到3 mL含有0.1%的H2O2100 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液中，于240 nm處每隔30 s測其吸光度，以△A/min/g表示酶活性大小。

1.2.6 過氧化物酶（POD）活性的測定 在50 mL，100 mmol/L，pH7.0的磷酸鹽緩沖液中加入28 μL愈創(chuàng)木酚，溶解冷卻后加入19 μL 30%的H2O2即為POD反應液。測定時取100 μL待測液與2 mL POD反應液和1 mL 0.2 mol/L的磷酸二氫鉀溶液反應，于470 nm處每隔30 s測其吸光度，以△A/min/g表示酶活性大小。

1.2.7 丙二醛（MDA）含量的測定 取待測液1.0 mL，加入5.0 mL 20%TCA（含0.5% TBA）混勻后塞上塞子，水浴煮沸30 min，快速冷卻，4 000 r/ min離心10 min，以20%TCA為參照，上清液在532 nm和600 nm處測定吸光值，重復3次求平均值，MDA含量用△A（△A=A532-A600）表示。

2 結果

2.1 內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油積累的影響

內(nèi)生真菌侵入宿主植物后，在某些條件下能促進宿主體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的形成和累積。本研究通過前期分離得到的4株內(nèi)生真菌（2J1、3J1、5J2、YB），對油樟幼苗進行處理，并分別在0、7、14、21、28 d考察對油樟揮發(fā)油（1，8-桉葉油素、α-松油醇）積累的影響。

由表1和表2可見，用不同內(nèi)生真菌處理油樟幼苗，其1，8-桉葉油素和α-松油醇的積累存在明顯差異。在0 d時，各個油樟處理之間揮發(fā)油含量沒有明顯差異。隨著處理時間增加，除處理YB外，其他處理的揮發(fā)油積累量都相應增加，尤其以2J1和3J1增加幅度最大。如在處理后7 d，2J1與3J1的桉葉油素含量明顯高于其他處理組，它們分別較對照增加67.61%和78.02%；到14 d、21 d和28 d時，2J1與3J1的揮發(fā)油含量繼續(xù)增加，顯著高于其他處理，其中尤以2J1的含量最高，其與對照相比，桉葉油素分別提高151.07%、201.53%和195.11%，松油醇分別提高224.38%、364.14%和359.91%。說明添加內(nèi)生真菌2J1和3J1進行處理，能促進揮發(fā)油的合成和積累，提高揮發(fā)油的產(chǎn)量，且用2J1處理比用3J1處理有更大的積累量。因此，通過內(nèi)生真菌影響油樟揮發(fā)油產(chǎn)量上的差異，可尋找出優(yōu)勢菌種，提高油樟油產(chǎn)量。

表1 內(nèi)生真菌對油樟1，8-桉葉油素積累的影響

表2 內(nèi)生真菌對油樟α-松油醇積累的影響

2.2 內(nèi)生真菌作用下油樟揮發(fā)油含量的動態(tài)變化

由圖1和圖2可知，油樟幼苗在添加內(nèi)生真菌進行培養(yǎng)后，CK、2J1、3J1和5J2的兩種揮發(fā)油成分的含量逐漸增長。在第7天時只有2J1、3J2以及CK較剛添加內(nèi)生真菌時有顯著增加，其桉葉油素含量分別達到9.900、10.578和5.942 mg/L，松油醇含量分別達到4.294、4.958和2.499 mg/L；而5J2則增長不顯著，YB有所下降。到21 d時，2J1和3J1的兩種揮發(fā)油成分含量達到最大值，尤其是2J1較之3J1的含量更大，之后緩慢下降；而CK和5J2在7 d時達到最大含量，YB則從0 d時就呈現(xiàn)下降趨勢。表明由2J1和3J1處理過的油樟幼苗，其揮發(fā)油含量增長時間較長，達到21 d，且在整個培養(yǎng)周期內(nèi)，其揮發(fā)油含量都顯著高于其它菌種；而CK與5J2在7 d后揮發(fā)油含量逐漸下降，且增長的量較0 d時無顯著差異。

綜上所述，說明添加2J1和3J1對油樟進行處理，可以促進油樟揮發(fā)油含量顯著增加，添加YB則可能對油樟揮發(fā)油積累有抑制作用，而添加5J2沒有明顯促進揮發(fā)油的增加。因此，通過內(nèi)生真菌影響油樟揮發(fā)油增長的時間差異，可以找到最佳取油時間，從而獲得更多的油料。

圖1 內(nèi)生真菌作用下油樟1，8-桉葉油素含量的變化

圖2 內(nèi)生真菌作用下油樟α-松油醇含量的變化

2.3 內(nèi)生真菌對油樟生理生化特性的影響

2.3.1 內(nèi)生真菌對油樟自由基清除系統(tǒng)保護酶的影響 油樟經(jīng)過內(nèi)生真菌處理后，過氧化物酶（POD）（圖3）和過氧化氫酶（CAT）（圖4）的活性發(fā)生了相應變化。POD活性在處理后的12 h達到最高值，其中2J1和3J1的活性顯著高于對照，分別為對照的2.48和2.06倍，而5J2和YB的POD活性則略低于對照；在處理后的18 h，2J1和3J1的CAT活性達到最大值并顯著高于對照，5J2和YB的活性雖達到峰值，但與對照相比差異不顯著。2J1和3J1在一段時間內(nèi)維持了相對較高的POD活性，而CAT活性在0-6 h基本與對照保持一致，隨后大幅增加，并一直顯著高于對照，從而消除了過量積累的H2O2對植株產(chǎn)生的毒害作用；5J2與YB對油樟POD和CAT活性的影響不大。以上說明，經(jīng)2J1和3J1兩種內(nèi)生真菌處理后能引起油樟植株活性氧的增加，并促進具有防御能力的酶活性的增加。由于自由基清除系統(tǒng)中氧化還原酶活性的動態(tài)變化，可能改變油樟植株中細胞的氧化還原態(tài)勢，并刺激其生理狀態(tài)和代謝結構發(fā)生變化。

圖3 內(nèi)生真菌對油樟POD活性的影響

圖4 內(nèi)生真菌對油樟CAT活性的影響

2.3.2 內(nèi)生真菌對油樟丙二醛（MDA）含量的影響 丙二醛（MDA）含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度。從圖5可以看出，油樟在添加內(nèi)生真菌后，各個處理葉片的MDA含量都有上升，其中2J1和3J1從一開始就呈上升趨勢，3J1在12 h后開始下降，2J1在18 h后出現(xiàn)下降，它們在整個培養(yǎng)周期的MDA含量都顯著高于對照；CK、5J2和YB的MDA含量變化基本一致，出現(xiàn)先下降再上升，而后再下降的趨勢。說明在油樟中加入2J1和3J1兩種內(nèi)生真菌進行培養(yǎng)能夠引起MDA含量的上升，并促使植株膜脂過氧化程度上升。

3 討論

近年來，研究者從多種植物中分離得到了能產(chǎn)生與宿主相同物質(zhì)或成分的內(nèi)生真菌［16，17］。這些內(nèi)生真菌能促進植物中有效物質(zhì)或成分的合成和積累，參與到植物這些物質(zhì)的形成過程中，并與宿主植物有相似的代謝途徑，從而形成相同或相似的代謝產(chǎn)物［18，19］。本研究表明，不同內(nèi)生真菌對油樟揮發(fā)油積累的影響是有差異的，用2J1和3J1兩種內(nèi)生真菌對油樟進行處理，能促進揮發(fā)油的合成和積累，大幅提高揮發(fā)油的產(chǎn)量，且2J1較之3J1有更大的積累量；YB處理的油樟揮發(fā)油含量從一開始呈現(xiàn)下降趨勢，5J2則在7 d后逐漸下降，兩者在整個培養(yǎng)周期的揮發(fā)油含量都低于CK，可能對油樟揮發(fā)油的積累具有抑制或無明顯促進作用，其具體原因還有待進一步研究。綜上所述，本研究的內(nèi)生真菌促進油樟揮發(fā)油積累能力大小依次為：2J1＞3J1＞5J2＞YB，因此根據(jù)內(nèi)生真菌揮發(fā)油產(chǎn)量上的差異，可尋找出優(yōu)勢菌種，從而利用其培育出高油量的油樟品種。

圖5 內(nèi)生真菌對油樟MDA含量的影響

另外，內(nèi)生真菌處理不僅可以提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量，而且還能使植物某些酶的活性發(fā)生變化。一般來說，特征酶誘導活性和次生代謝產(chǎn)物積累具有直接相關性［20，21］。本研究表明，2J1和3J1兩種內(nèi)生真菌能顯著促進油樟揮發(fā)油的合成，同時能引起POD和CAT活性以及MOD含量大幅上升，說明油樟酶活性的變化在一定程度上與揮發(fā)油合成存在正相關。這可能是由于添加內(nèi)生真菌后使得某些特定的次生代謝途徑被啟動，路徑中有一些相關酶的表達被加強，進而引起揮發(fā)油含量的增加。

本研究雖然找出了能提高油樟揮發(fā)油含量的內(nèi)生真菌以及最大含油量的時間，但是它們的相關機制還不清楚，特別是如何促進代謝通路中某些關鍵酶活性的提高，以及內(nèi)生真菌在分離出來培養(yǎng)一段時間后合成揮發(fā)油能力開始“退化”，這種“退化”現(xiàn)象與宿主之間關系如何都需進一步研究。因此，今后將繼續(xù)探討內(nèi)生真菌對油樟油產(chǎn)量與品質(zhì)影響的作用機制，并為相關調(diào)控基因的克隆和油樟揮發(fā)油合成的人工調(diào)控提供參考依據(jù)。

4 結論

本研究以4株內(nèi)生真菌作為材料，將內(nèi)生真菌孢子懸浮液均勻噴灑在油樟葉片上進行處理后，提取油樟葉片中的揮發(fā)油，利用GC-MS測定揮發(fā)油中1，8-桉葉油素、α-松油醇的量，結果表明，采用2J1和3J1兩種內(nèi)生真菌對油樟進行處理，在處理21 d時揮發(fā)油含量達到最大值，其主要成分1，8-桉葉油素和α-松油醇的含量顯著高于對照。同時，兩種內(nèi)生真菌能引起POD、CAT活性及MOD含量大幅上升，證明油樟酶活性的變化在一定程度上與揮發(fā)油合成存在正相關。

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（責任編輯 狄艷紅）

Effect of Endophytic Fungi on Iits Essential Oil Accumulation and Physiological-biochemical Characteristic of Cinnamomum longepaniculatum

YAN Kuan1，2CHEN Fang1WEI Qin2FENG Rui-zhang2ZHOU Wan-hai2ZHOU Min2
（1. College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610044；2. College of Life Science and Food Engineering，Yibin University，Yibin 644000）

The aim of this study was to examine the effects of endophytic fungi on the accumulation and physiological-biochemical characteristics of essential oil in Cinnamomum longepaniculatum. The essential oil of C. longepaniculatum was extracted after spraying four endophytic fungi spore suspension（2J1、3J1、5J2、YB）on the leaves separately，and the content of 1，8-cineole and α-terpineol was determined by GC-MS. The results showed that the content of essential oil reached a peak at 21 d after treatment with 2J1 and 3J1，and the contents of 1，8-cineole increased by 201.53% and 174.47% compared with controls，and α-terpineol increased by 364.14% and 307.29% as well，respectively. Furthermore，the peroxidase（POD）content，catalase（CAT）activity，and malondialdehyde（MOD）content of suspension cells increased significantly. No significant difference was detected between C. longepaniculatum treated with 5J2 and the control group in terms of essential oil accumulation，CAT and POD activity，and MOD contents，nor did YB. Consequently，treatment with 2J1 and 3J1 could significantly increase the accumulation of essential oil in C. longepaniculatum.

endophytic fungi；Cinnamomum longepaniculatum；essential oil production；physiological- biochemical characteristic

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.020

2016-09-01

四川省教育廳項目（14TD0031），四川省大學生創(chuàng)新項目（201510641016），四川省高校重點實驗室項目（2015XLZ001）

嚴寬，男，博士研究生，研究方向：微生物與植物相互關系；E-mail：158542439@qq.com

陳放，男，教授，研究方向：研究方向：植物發(fā)育生物學及生物技術；E-mail：chenfang@scu.edu.cn

魏琴，女，教授，研究方向：研究方向：宜賓特色生物資源油樟的開發(fā)利用；E-mail：weiqin2001-67@163.com