段薈芹 王利

（1. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041）

齊口裂腹魚(yú)CDH5基因特性及其對(duì)溫和氣單胞菌感染的應(yīng)答

段薈芹1王利2

（1. 西南民族大學(xué) 青藏高原研究院，成都 610041；2. 西南民族大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041）

探討齊口裂腹魚(yú)（Schizothorax prenanti）血管內(nèi)皮黏附分子（Cadherin 5，CDH5）的基因特性。用生物信息學(xué)軟件分析齊口裂腹魚(yú)CDH5基因序列，用Real-time PCR檢測(cè)CDH5基因在齊口裂腹魚(yú)感染溫和氣單胞菌后0 h、24 h和 48 h的表達(dá)變化。獲得CDH5基因全長(zhǎng)cDNA序列，GenBank登錄號(hào)為KT329441。該序列長(zhǎng)4 825 bp，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2 313 bp，編碼770個(gè)氨基酸。蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白相對(duì)分子量為85.19 kD，等電點(diǎn)為5.01。存在信號(hào)肽序列，二級(jí)結(jié)構(gòu)以隨機(jī)卷曲、延伸鏈、α-螺旋為主。齊口裂腹魚(yú)CDH5氨基酸序列與斑馬魚(yú)同源性達(dá)74%，與人的相似性為43%。CDH5在感染溫和氣單胞菌后在各組織中均有表達(dá)。脾臟中CDH5基因在24 h表達(dá)量顯著高于0 h和48 h（P＜0.05）。肝臟、腎臟和肌肉中CDH5在48 h的表達(dá)量均顯著高于24 h（P＜0.05）。心臟和腸道中CDH5基因在48 h的表達(dá)量顯著高于0 h（P＜0.05）。CDH5基因在可能參與了齊口裂腹魚(yú)抗溫和氣單胞菌感染的免疫應(yīng)答，為深入研究CDH5在齊口裂腹魚(yú)中的功能奠定基礎(chǔ)。

CDH5；齊口裂腹魚(yú)；組織表達(dá)；溫和氣單胞菌

血管內(nèi)皮黏附分子（Cadherin 5，CDH5）是血管內(nèi)皮細(xì)胞中的特異性的黏附分子，為黏附分子家族中的成員。其作用主要表現(xiàn)在能夠介導(dǎo)細(xì)胞之間的黏附、調(diào)控細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（如MAPK信號(hào)通路）、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡來(lái)調(diào)控細(xì)胞增殖、存活和分化等［1-3］。目前，CDH5已在斑馬魚(yú)（Danio rerio）、人血管內(nèi)皮、小鼠、豬中被發(fā)現(xiàn)［3，4］。關(guān)于CDH5基因的報(bào)道主要集中在克隆、鑒定、啟動(dòng)子調(diào)控和免疫調(diào)控等方面［5-12］。齊口裂腹魚(yú)（Schizothorax prenanti），又稱(chēng)雅魚(yú)，屬鯉科（Cyprinidae）、裂腹魚(yú)亞科、裂腹魚(yú)屬，主要分布在我國(guó)長(zhǎng)江上游的岷江、金沙江、青衣江、大渡河等水域，是我國(guó)特有的冷水性經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)［13，14］，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來(lái)，隨著養(yǎng)殖戶(hù)養(yǎng)殖面積的擴(kuò)大，細(xì)菌性疾病逐年發(fā)生，而溫和氣單胞菌（Aeromomas sobria）是一種常見(jiàn)的人魚(yú)共患的致病菌，養(yǎng)殖實(shí)踐表明該菌已經(jīng)對(duì)漁業(yè)生產(chǎn)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，需要從基礎(chǔ)研究的角度發(fā)掘魚(yú)的免疫相關(guān)基因，探討其抗細(xì)菌免疫機(jī)制，從而為漁業(yè)生產(chǎn)的疾病控制服務(wù)。目前，有關(guān)齊口裂腹魚(yú)免疫相關(guān)基因的研究主要有過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ輔助活化因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α）［15］、MyD88［16］、心 型 脂 肪 酸 結(jié) 合 蛋 白（heart fatty acid binding protein，H-FABP）［17］、同種移植炎癥因子（allograft inflammatory factor- 1，AIF- 1）［18］等，尚未見(jiàn)CDH5基因的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)從課題組已經(jīng)構(gòu)建的齊口裂腹魚(yú)脾臟的轉(zhuǎn)錄組中獲得CDH5基因的全長(zhǎng)cDNA序列，采用Real-time PCR分析齊口裂腹魚(yú)感染溫和氣單胞菌后CDH5基因的表達(dá)量變化，旨在為研究CDH5基因在魚(yú)類(lèi)中的作用積累科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的齊口裂腹魚(yú)來(lái)源于四川雅安某養(yǎng)殖場(chǎng)，共20尾，體長(zhǎng)35-40 cm，體重390-410 g。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 溫和氣單胞菌株（WS6202）由本實(shí)驗(yàn)室留存，Trizol試劑購(gòu)于Invitrogen公司，異丙醇、DEPC溶液、氯仿、RocketScriptTMRT PreMix購(gòu)于BIONEER公司，IQTMSYBR Green Supermix購(gòu)于BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 齊口裂腹魚(yú)感染實(shí)驗(yàn) 將實(shí)驗(yàn)室保存的溫和氣單胞菌株常溫復(fù)蘇，參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄖ瞥蓾舛葹?.0×108CFU/mL的菌懸液，取1 mL菌液注射魚(yú)腹腔內(nèi)，保持28℃水溫，用充氧泵間歇供氧。分別在0 h、24 h和48 h隨機(jī)采3尾，記為0 h組、24 h組和48 h組并收集不同組魚(yú)脾臟、心臟、腎臟、肝臟、肌肉、腸道6種組織于液氮快速冷凍后，-80℃保存。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 將各組魚(yú)的脾臟、心臟、肝臟、腎臟、肌肉、腸道組織從-80℃冰箱中取出，用Trizol提RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳及分光光度計(jì)檢測(cè)RNA提取質(zhì)量和完整性。按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成。合成的各組組織cDNA放于-20℃冰箱保存。

1.2.3 CDH5基因的生物信息學(xué)分析 用DNAStar軟件分析該序列，用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Blastp進(jìn)行序列比對(duì)，用ORF Finder 對(duì)開(kāi)放性閱讀框進(jìn)行分析，齊口裂腹魚(yú)CDH5基因氨基酸序列分析應(yīng)用DNAMAN軟件，用ExPASy程序中的Interproscan、SOPMA、TMpred、SignalP、Smart、NetPhos 2.0、NetNGlyc 1.0分別對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜螺旋特征、信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)和糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建應(yīng)用Clustalx1.83和Mega5.0軟件。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 參照轉(zhuǎn)錄組中CDH5基因序列，用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)定量引物，CDH5引物序列Primer A：5'-CCGAGAGAAACAGAGTCAGTAT-3'，Primer B：5'-AGTCACAATCGTAGTAGCAGAAT-3 '，齊口裂腹魚(yú)18S rRNA內(nèi)參基因引物序列Primer F：5'-GGAATGAGCGTATCCTAAACCC- 3'，Primer R：5'-CTCCCGAGATCCAACTACAAGC- 3'，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.5 CDH5基因定量分析 分別以不同組6種組織的cDNA為模板，每個(gè)樣品3個(gè)平行。以齊口裂腹魚(yú)18S rRNA基因作內(nèi)參，進(jìn)行CDH5定量檢測(cè)。10 μL 反應(yīng)體系：ddH2O 1.2 μL，Primer F 0.4 μL，Primer R 0.4 μL，SYBR Green? Supermix 6 μL，模板2 μL。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；95℃ 10 s，59℃ 20 s，72℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；65℃ 5 s；95℃ 10 s。對(duì)溶解曲線分析后，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用-2ΔΔCt法計(jì)算，并利用SPSS 17.0軟件中的單因素方差分析（One-way ANOVA）對(duì)CDH5基因進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 CDH5基因序列分析

從轉(zhuǎn)錄組獲得CDH5基因的全長(zhǎng)cDNA序列（GenBank登錄號(hào)為：KT329441），該序列長(zhǎng)4 825 bp，5'-UTR長(zhǎng)346 bp，3'-UTR長(zhǎng)2 165 bp，有典型的加尾信號(hào)AATAAA及PloyA尾。開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)2 313 bp，編碼770個(gè)氨基酸（圖1）。在線軟件預(yù)測(cè)顯示，該蛋白相對(duì)分子量為85.19 kD，等電點(diǎn)5.01。帶負(fù)電荷殘基數(shù)（Asp+Glu）為111，帶正電荷殘基數(shù)（Arg+Lys）為83。脂肪系數(shù)為81.38。不穩(wěn)定系數(shù)為38.71，為穩(wěn)定蛋白。CDH5蛋白出現(xiàn)頻率較高的氨基酸有Ser（9.1%）、Asp（8.6%）、Leu（7.4%）、Ile（7.1%）。總平均親水性為-0.421。TMpred跨膜螺旋分析CDH5蛋白跨膜特征，參照跨膜拓?fù)鋵W(xué)分析模型，要求當(dāng)分值大于500時(shí)該蛋白有跨膜螺旋推測(cè)，CDH5蛋白有2個(gè)明顯的跨膜螺旋區(qū)。

SigalP信號(hào)肽分析表明，該蛋白存在一個(gè)由29個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽序列。該序列位于第1-29位，切割位點(diǎn)在29-30位氨基酸之間，表明該蛋白為分泌型蛋白。CDH5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖2）顯示，該蛋白隨機(jī)卷曲占41.17%、延伸鏈占26.75%，α-螺旋占22.73%，β-轉(zhuǎn)角占9.35%。Smart預(yù)測(cè)CDH5蛋白結(jié)構(gòu)域顯示，該蛋白包括5個(gè)重復(fù)鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域（CA domain，黃色部分）、2個(gè)跨膜域（Transmembrane region，藍(lán)色部分）和4個(gè)低組分復(fù)雜性區(qū)域（Low complexity，紫色部分）（圖3）。NetPhos 2.0蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，CDH5蛋白氨基酸序列有57個(gè)磷酸化位點(diǎn)，分別位于絲氨酸（Ser）、酪氨酸（Tyr）和蘇氨酸（Thr）殘基上，即有42個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，6個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)和9個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。NetNGlyc 1.0糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白有6個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分 別 為（121NLTA124）、（138NDTF141）、（197NGTD200）、（480NRSH483）、（521NFTL524）和（529NNTA532）。

2.2 CDH5同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

用NCBI中的Blastp程序進(jìn)行比對(duì)分析顯示，齊口裂腹魚(yú)CDH5氨基酸序列與其它物種的相似性大約為41%-74%，其中與斑馬魚(yú)（D. rerio）相似性最高，達(dá)74%，與白斑狗魚(yú)（Esox lucius）相似性為53%，與人（Homo sapiens）的相似性為43%。用DNAMAN軟件對(duì)不同物種CDH5氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（圖4）顯示，齊口裂腹魚(yú)CDH5氨基酸序列在不同物種中比較保守。用Mage 5.0軟件，選取相似性較高的序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖5）。在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上，齊口裂腹魚(yú)CDH5氨基酸序列與斑馬魚(yú)CDH5親緣關(guān)系最密切，其最先與斑馬魚(yú)聚為一類(lèi)，隨后與白斑狗魚(yú)聚為一類(lèi)，最后再與其他哺乳類(lèi)動(dòng)物聚為一類(lèi)。

2.3 齊口裂腹魚(yú)CDH5對(duì)溫和氣單胞菌感染的應(yīng)答

以18S rRNA基因作為內(nèi)參進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)，結(jié)果（圖6）顯示，CDH5基因在健康齊口裂腹魚(yú)各組織中均有不同程度的表達(dá)。在0 h各組織的表達(dá)量大小順序?yàn)楦闻K＞脾臟＞肌肉＞心臟＞腎臟＞腸道。在溫和氣單胞菌感染后，脾臟中CDH5基因在24 h表達(dá)量顯著高于0 h和48 h（P＜0.05）。肝臟、腎臟和肌肉中CDH5在48 h的表達(dá)量均顯著高于24 h（P＜0.05）。心臟和腸道中CDH5基因在48 h的表達(dá)量顯著高于0 h（P＜0.05）。

3 討論

鈣黏素（Cadherin，CDH）是一種重要的黏附分子，最初被定義為依賴(lài)Ca2+的細(xì)胞黏附分子，其作為鈣黏素家族成員之一，主要作用為介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的粘附，參與細(xì)胞分化等過(guò)程［19］。Dejana等［6］體外研究顯示，CDH5在內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)功能研究方面具有重要作用，主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附，細(xì)胞增殖、存活，細(xì)胞形狀，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑及調(diào)控轉(zhuǎn)錄基因等方面。Schubert等［20］研究顯示，CDH5基因是由糖皮質(zhì)激素所調(diào)節(jié)，且與中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變有關(guān)，可以增加脈絡(luò)膜血管的滲透性。Vestweber 等［21］研究表明CDH可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖及凋亡，對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程也起重要作用。

圖1 CDH5基因CDS區(qū)核苷酸及氨基酸序列（星號(hào)代表終止密碼子）

圖2 CDH5蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 CDH5蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

迄今為止，CDH5基因在魚(yú)類(lèi)中僅見(jiàn)在斑馬魚(yú)和白斑狗魚(yú)中的報(bào)道。吳西軍等［4］從斑馬魚(yú)胚胎中克隆出CDH5全長(zhǎng)序列為3 061 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)2 301 bp，本實(shí)驗(yàn)獲得齊口裂腹魚(yú)CDH5基因全長(zhǎng)為4 825 bp，編碼區(qū)長(zhǎng)2 313 bp，造成此差異的原因可能是由于不同品種的CDH5基因的片段大小存在一定的差異，或是不同的環(huán)境壓力下變異程度可能出現(xiàn)差異有關(guān)。生物信息學(xué)分析顯示，CDH5蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為38.71，而穩(wěn)定蛋白標(biāo)準(zhǔn)為不穩(wěn)定系數(shù)小于40，由此可知，CDH5蛋白為穩(wěn)定蛋白［23］。CDH5蛋白存在1個(gè)信號(hào)肽序列和2個(gè)明顯的跨膜螺旋區(qū)，表明此蛋白可能在細(xì)胞質(zhì)中合成，分泌過(guò)程后將信號(hào)肽切除，從而形成具生物學(xué)功能的蛋白，為分泌型蛋白［24］。Smart預(yù)測(cè)CDH5蛋白結(jié)構(gòu)域顯示，CDH5包括一個(gè)保守的由5個(gè)串聯(lián)重復(fù)的胞外鈣黏蛋白結(jié)構(gòu)域、2個(gè)跨膜域和4個(gè)低組分復(fù)雜性區(qū)域。這和王賓等［22］報(bào)道的在胞外域，經(jīng)典鈣黏蛋白有5個(gè)同源染色體重復(fù)序列片段相一致，但有1個(gè)跨膜域有所不同，原因可能是由于物種不同所造成。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，齊口裂腹魚(yú)與斑馬魚(yú)聚為一簇，表明彼此親緣關(guān)系較為密切?；蛟诓煌M織中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)特征可能是其功能的一種表現(xiàn)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR顯示，CDH5基因在健康齊口裂腹魚(yú)各組織中均有表達(dá)，也提示CDH5可能具有多種生物學(xué)功能。雖然CDH5基因廣泛分布，但其表達(dá)量存在一定差異。在溫和氣單胞菌感染后，CDH5基因在脾臟中24 h表達(dá)量最高，這表明該基因在此時(shí)間參與了對(duì)溫和氣單胞菌的應(yīng)答，而在48 h表達(dá)量降低，但與0 h相比，也有一定程度的增加。這說(shuō)明CDH5基因在48 h也可能參與了機(jī)體抵抗細(xì)菌侵染的免疫反應(yīng)。

圖4 CDH5蛋白氨基酸序列多重比對(duì)（部分）

圖5 CDH5氨基酸序列與其他動(dòng)物進(jìn)化樹(shù)分析

圖6 CDH5基因在不同組織中的表達(dá)量

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)獲得齊口裂腹魚(yú)CDH5基因的cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)生物信息學(xué)分析，結(jié)合其在健康齊口裂腹魚(yú)各組織的表達(dá)情況以及溫和氣單胞菌刺激下的表達(dá)變化，初步揭示其在齊口裂腹魚(yú)的免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮的一定作用。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Characteristics of Gene CDH5 in Schizothorax prenanti and Its Response to Aeromomas sobria Infection

DUAN Hui-qin1WANG Li2
（1. Institute of Qinghai-Tibet Plateau，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041；2.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041）

This work is to characterize cadherin 5（CDH5）gene of Schizothorax prenanti. Bioinformatics tools were used to analyze the gene sequence of CDH5，and real-time PCR to detect the expression variation of CDH5 gene at 0 h，24 h，and 48 h of S. prenanti infected with Aeromomas sobria. The full-length cDNA of CDH5 was 4 825 bp，ORF was 2 313 bp，and encoded 770 amino acids. Its molecular weight was 85.19 kD and pI was 5.01. The CDH5 protein had a signal peptide sequence，and its secondary structure was mainly composed of random coil，extend strand，and α-helix. Multiple alignment analysis revealed that CDH5 shared 74% homology with Danio rerio，low similarity with Homo sapiens（43%）. CDH5 were expressed in all detected tissues after A. sobria infection，the expression of CDH5 in spleen at 24 h was significantly higher than at 0 h and 48 h（P ＜ 0.05），also the expression of CDH5 in the liver，kidney，and muscle at 48 h higher than at 24 h（P ＜ 0.05），and significantly higher expression of CDH5 at 48 h in heart and intestines than at 0 h（P ＜ 0.05）. It indicated that CDH5 of S. prenanti might be involved in immune response to A. sobria infection，laying a foundation for the further study on the functions of S. prenanti.

CDH5；Schizothorax prenanti；tissue expression；Aeromomas sobria

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.023

2016-07-10

四川省科技支撐項(xiàng)目（2016NZ0044），西南民族大學(xué)研究生學(xué)位點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目（2016XWD-SO71007）

段薈芹，女，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)；E-mail：917077886@qq.com

王利，女，副教授，研究方向：動(dòng)物免疫學(xué)；E-mail：qinxin916@aliyun.com