黃娜娜 孫曉倩 楊倩 李曉宇

[摘要]建立適宜于抗急性肝損傷（肝郁脾虛證）中藥復(fù)方活性發(fā)現(xiàn)、藥效評價(jià)和新藥研發(fā)的方證相應(yīng)動物模型。依照中醫(yī)病因病機(jī)演變規(guī)律和現(xiàn)代病理機(jī)制研究，抽提適宜于急性肝損傷（肝郁脾虛證）大鼠動物模型評價(jià)的證候、確定積分，根據(jù)藥證相符原則選定逍遙丸和水飛薊賓葡甲胺片為模型反證藥物，大鼠每天腹腔注射豬血清，并按分組給予不同配比高脂低蛋白飼料及食用乙醇進(jìn)行誘導(dǎo)；共7 d。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察大鼠的體重、食量、飲水量及一般觀察并對其進(jìn)行中醫(yī)證候積分，實(shí)驗(yàn)結(jié)束檢測大鼠血清ALT，AST，PA，TBIL，TBA等肝功能指標(biāo)的水平，檢查肝組織病理學(xué)變化。在造模1周后，各模型組的大鼠均達(dá)到明顯急性肝損傷程度，且大鼠主證、次證均符合肝郁脾虛證的證候表現(xiàn)。與正常對照組比較，血清ALT和AST活性升高，TBIL和TBA含量升高，PA含量降低；肝組織病理形態(tài)學(xué)檢查顯示各模型組的大鼠均出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤、嗜酸性變或嗜酸性脂肪變，反證藥物組可不同程度改善上述病變表現(xiàn)。腹腔注射豬血清+高脂低蛋白飼料（895%玉米粉、10%豬油、05%膽固醇）+10%食用乙醇連續(xù)造模7 d，經(jīng)藥物反證，可建立擬臨床肝郁脾虛證的急性肝損傷大鼠模型，具有成模耗時(shí)短、死亡率低、動物狀態(tài)與臨床患者證候表現(xiàn)相近等特點(diǎn)，可適用于抗急性肝損傷（肝郁脾虛證）中藥復(fù)方活性發(fā)現(xiàn)、藥效評價(jià)、新藥研發(fā)和臨床方證相關(guān)性研究與機(jī)制探討。

[關(guān)鍵詞]急性肝損傷； 肝郁脾虛證； 病證結(jié)合； 大鼠； 動物模型

Research on rat models of acute liver injury with syndrome of

liver depression and spleen deficiency

HUANG Nana1，2， SUN Xiaoqian2， YANG Qian3， LI Xiaoyu1， SUN Rong1*

（1 Shandong Academy of Chinese Medicine， Ji′nan 250014， China；

2 Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Ji′nan 250355， China；

3 Rizhao City Hospital of Traditional Chinese Medicine， Rizhao 276800， China）

[Abstract]This paper aimed to establish animal models which are suitable for the activity found， efficacy evaluation of herbs resistant to acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency and new drug research and development based on corresponding of formula and syndrome The symptoms that are suitable for evaluating the rat models of acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency were extracted according to the evolution rule of the etiology and pathogenesis in traditional Chinese medicine and the modern pathological mechanism Xiaoyao pill and silibin meglumine tablets were used as drug counter evidence for models in accordence with the principle of consistence of prescription and syndrome Rats model were fed with highlipid and lowprotein fodder of different proportion and induced by intraperitoneal injection with pig serum， intragastric administration with edible alcohol once a day for 7 days Daily record of body weight， daily food intake and daily water intake were conducted day after day in experimental session Symptoms were also observed and evaluated by score at the same time The contents of ALT， AST， PA， TBIL and TBA in serum were detected and histopathological changes of liver were checked at the ending of experiment Obvious acute liver injury occurred to all rats in model groups at 1 week following model induction Both main symptoms and secondary symptoms were consistent with syndrome manifestation of liver depression and spleen deficiency Compared with normal control group， the activity of ALT，AST and contents of TBIL，TBA in serum increased and the content of PA decreased Liver tissue pathological morphology showed inflammatory cells infiltration， eosinophilic or eosinophilic adipose change in hepatocytes of rats in model groups All the above lesions manifestation could be improved by drug counterevidence By the disproof of medicine， rat models of acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency could be induced by fed with highlipid and lowprotein fodder which contained 895% cornstarch， 10% lard and 05% cholesterol， intraperitoneal injected with pig serum， intragastric administrated with edible alcohol for 7 days The rat models with a low mortality could be induced in a short time and animal status were similar to syndrome performance of patients So the rats models are suitable for the activity found， efficacy evaluation and drug discovery of herbs resistant to acute liver injury with syndrome of liver depression and spleen deficiency， and also can be used in the research of correlation between prescription and syndrome and its mechanism

[Key words]acute liver injury； liver depression and spleen deficiency； combination of disease and syndrome； rat； animal model

doi：10.4268/cjcmm20162318

急性肝損傷主要是由病毒感染、藥物服用不當(dāng)、過量飲酒、高脂飲食因素造成的急性肝功能異常為代表的疾病。中醫(yī)并無此病名，因黃疸貫穿于該病始終、且臨床表現(xiàn)多勢急病重，并多伴有神志昏蒙等證候，故中醫(yī)多將其歸為“急黃”范疇，多由飲食不節(jié)、飲酒、情志不遂等因素造成。隨著現(xiàn)代生活方式的改變，魯曉嵐等[12]依據(jù)人群流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，長期飲酒并且飲食中碳水化合物、纖維素食物攝入較少，容易引起肝損傷。近年來研究證實(shí)[35]乙醇及飲食不當(dāng)?shù)纫蛩匾殉蔀樵摬∽C主要誘因，中醫(yī)藥治療急性肝損傷（肝郁脾虛證）療效顯著，引起國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。

如何科學(xué)研究急性肝損傷（肝郁脾虛證）的現(xiàn)代中醫(yī)病理機(jī)制、病程轉(zhuǎn)歸、療效評價(jià)，如何快速、準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)治療急性肝損傷（肝郁脾虛證）的中藥創(chuàng)新藥物，都亟待構(gòu)建一個(gè)適宜于急性肝損傷（肝郁脾虛證）現(xiàn)代中醫(yī)藥研究的病癥結(jié)合模型。目前該領(lǐng)域研究主要應(yīng)用西藥藥理學(xué)的四氯化碳、D氨基半乳糖、α柰基異硫氰酸酯、醋氨酚、異煙肼、四環(huán)素、刀豆球蛋白A、乙醇等單因素導(dǎo)致大、小鼠的急性肝損傷模型，或卡介苗+脂多糖、乙醇+高脂飼料、豬血清+四氯化碳+乙醇等多因素導(dǎo)致的急性肝損傷模型[6]，并無急性肝損傷（肝郁脾虛證）結(jié)合模型應(yīng)用。

本研究在西醫(yī)辨病、中醫(yī)辨證、以病統(tǒng)證的基礎(chǔ)上，借鑒了“從癥辨證”的中醫(yī)辨證思維，利用乙醇，高脂飼料及豬血清注射三者結(jié)合的復(fù)合誘發(fā)因素，模擬臨床發(fā)病過程中“乙醇刺激”、“飲食不當(dāng)”、“免疫損傷”等造成的體內(nèi)多維度、多層級的病理損傷過程，同時(shí)根據(jù)中醫(yī)對本病證的認(rèn)知規(guī)律，遵循“正虛不能抗御外邪從而導(dǎo)致濕熱毒邪入侵，由氣入血，進(jìn)而肝阻脾胃，臟腑功能失調(diào)，最后血脈受病，肝絡(luò)瘀阻”的病機(jī)過程，通過對“乙醇刺激”、“飲食不當(dāng)”、“免疫損傷”造模條件的優(yōu)選，制備急性肝損傷（肝郁脾虛證）大鼠動物模型，以期得到一種適宜于中藥復(fù)方活性發(fā)現(xiàn)、藥效評價(jià)、新藥研發(fā)和臨床方證相關(guān)性研究的急性肝損傷（肝郁脾虛證）動物模型。

1材料

SPF級雄性Wistar大鼠100只，體重180～220 g，健康、適齡，購自山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號SYXK（魯）20140001。實(shí)驗(yàn)動物配合飼料（鼠），生產(chǎn)許可證號SCXK（魯）20140014。

水飛薊賓葡甲胺片購自湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司（批號20140201），配制為質(zhì)量濃度0010 8 kg·L-1的溶液。

逍遙丸購自河南省宛西制藥股份有限公司（批號140109），配制為質(zhì)量濃度1296 0 kg·L-1的溶液。

食用乙醇為市售紅星二鍋頭，本實(shí)驗(yàn)用20%，10%乙醇由食用乙醇與蒸餾水稀釋而成；膽固醇購自上海源聚生物科技有限公司；豬油為市售；豬血清購自上海憶欣生物科技有限公司，批號20141214。

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT），天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST），前白蛋白（PA），總膽紅素（TBIL），總膽汁酸（TBA）等檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，批號分別為20140329，20140328，20140605，20140329，20140401。

PL303精密電子天平（瑞士梅特勒托利多儀器有限公司）；可調(diào)式移液器（上海賽默飛世爾儀器有限公司）；Multiskan Go1510全波長酶標(biāo)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；TDZ5WS臺式低速離心機(jī)[湘儀（湖南）離心機(jī)儀器有限公司]；DZKMS6電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；UV2600型紫外分光光度儀（中美合資尤尼柯有限公司）。

2方法

21適宜于動物模型評價(jià)的急性肝損傷（肝郁脾虛證）診療指標(biāo)抽提目前公認(rèn)的急性肝損傷診斷標(biāo)準(zhǔn)主要為乏力、食欲減退、惡心，體征表現(xiàn)為肝腫大并有壓痛、肝區(qū)叩擊痛，部分患者可有輕度脾腫大，血生化檢查為ALT及AST活性升高[7]。公認(rèn)的肝郁脾虛證診斷標(biāo)準(zhǔn)主要分為2部分[78]，主證：脅肋脹痛，食后腹脹或腹脹午后加重，倦怠乏力，食欲不振，大便稀溏或時(shí)溏時(shí)干；次證：惡心噯氣，煩躁易怒，時(shí)時(shí)太息，神疲懶言，舌質(zhì)淡，脈弦或弦緩脅肋作痛、腹脹食少、情緒抑郁、便溏不爽，或腹痛欲便、瀉后痛減、脈弦緩。而目前尚無公認(rèn)的中醫(yī)急性肝損傷（肝郁脾虛證）診斷標(biāo)準(zhǔn)。

本研究基于上述標(biāo)準(zhǔn)選擇 ①癥狀和體征指標(biāo)：主癥，飲食、飲水減少，舌淡、腹脹、便溏；次癥，精神不振，眼睛、耳廓和爪趾顏色變淡，毛色發(fā)黃，尾部有瘀斑，體重下降。擬建立大鼠證候積分評價(jià)量表（表1）。②肝臟病理組織學(xué)檢查可見炎細(xì)胞浸潤。③血清ALT，AST，TBA，TBIL水平升高，PA水平降低。④藥物反證療效顯著。

22造模刺激條件的優(yōu)化設(shè)計(jì)依據(jù)既往文獻(xiàn)報(bào)道[6，910]不同乙醇濃度（10%～60%）灌胃不同天數(shù)可導(dǎo)致大鼠急性肝損傷模型，也有報(bào)道連續(xù)60 d用高脂低蛋白飲食喂養(yǎng)大鼠，會對正常大鼠肝臟造成明顯的損害[11]。中醫(yī)認(rèn)為乙醇+飲食不當(dāng)所致急性肝損傷為氣、血、痰、濕相互搏結(jié)，其發(fā)病規(guī)律多為正虛不能抗御外邪從而導(dǎo)致濕熱毒邪入侵，由氣入血，進(jìn)而肝阻脾胃，臟腑功能失調(diào)，最后血脈受病，肝絡(luò)瘀阻。依據(jù)臨床證候抽提分析，本研究以大鼠一般狀況、血清ALT和AST水平、死亡情況等指標(biāo)對復(fù)合因素中的高脂低蛋白飼料及乙醇配比（表2）進(jìn)行優(yōu)化比較研究。

23動物分組及給藥雄性Wistar大鼠隨機(jī)分成正常對照組、造模2和4組（見優(yōu)化結(jié)果）、及其各自的水飛薊賓葡甲胺片和逍遙丸藥物反證組。2和4造模組及各自的藥物反證組均按10 mL·kg-1體重給藥，藥物反證組分別給予0108 g·kg-1的水飛薊賓葡甲胺片溶液和12960 g·kg-1的逍遙丸溶液，每日灌胃1次，共7 d；正常對照組飼以正常飼料和普通飲用水。

24觀察指標(biāo)與檢測方法分別在第0，1，3，5，7天觀察記錄大鼠一般狀況、癥狀體征情況及證候積分、體重、食水量、死亡情況。第8天大鼠眼眶靜脈叢取血，3 500 r·min-1離心10 min，取血清，并按照相關(guān)試劑盒說明書的操作說明，用自動生化分析儀測定血清中ALT，AST，PA，TBIL，TBA等指標(biāo)水平。取血后解剖去腦、肝、脾、胸腺組織并稱重，計(jì)算臟器指數(shù)，一部分肝組織進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察其組織形態(tài)學(xué)變化；另一部分肝組織-80 ℃保存。

25統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 115統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，正態(tài)分布資料采用單因素方差分析，非正態(tài)分布資料先轉(zhuǎn)換成正態(tài)分布再用單因素方差分析。進(jìn)行組間比較，P<005為數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)有顯著性差異。

3結(jié)果

31造模條件確認(rèn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，除模型4組，其余3組大鼠均出現(xiàn)死亡，死亡率模型1組最高，ALT及AST值模型1組最大，模型4組最小，優(yōu)化結(jié)果表現(xiàn)為模型4組大鼠最好，其次為模型2組，再次為模型3組，最差是模型1組（表3）。因此，為符合臨床該病特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)選擇既有臨床證候診斷指標(biāo)，又有臨床表現(xiàn)程度的2和4組作為模型組。

32造模對大鼠日食量及日水量的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型2組與4組在給藥后日食量與日水量均下降。與正常對照組比較，各模型組日食量在第7天差異顯著（P<005）（表4）；日水量在第3天均出現(xiàn)了顯著性差異（P<001），第7天復(fù)合因素模型組差異性極顯著（P<0001）（表5）；食水量指標(biāo)變化及藥物反證結(jié)果提示，造模7 d動物出現(xiàn)急性肝損傷（肝郁脾虛證）的證候表現(xiàn)。

33造模對大鼠擬臨床證候積分的影響實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠一般活動正常，毛色光亮、眼睛有神，未見糞尿的異常改變。2個(gè)模型組呈現(xiàn)不同程度的大鼠行為倦怠、欠活潑，舌淡，腹部腫脹，耳廓和爪趾顏色變淡，毛色發(fā)黃，尾部少許瘀斑等；部分大鼠出現(xiàn)便溏現(xiàn)象，模型2組大鼠疾病情況最為嚴(yán)重，且出現(xiàn)死亡情況（圖1）。模型2組、4組與正常組進(jìn)行比較，其中醫(yī)證候積分在第3天均出現(xiàn)顯著性差異（P<005或P<001），到第7天復(fù)合因素模型組差異性極顯著（P<0001）（表6）。證候積分變化及藥物反證結(jié)果提示，造模7 d動物出現(xiàn)急性肝損傷（肝郁脾虛證）的證候表現(xiàn)。

34造模對大鼠體重的影響實(shí)驗(yàn)期間，正常對照組大鼠健康狀況良好，靈活好動、反應(yīng)敏捷、毛發(fā)光澤、飲食糞便正常、體重持續(xù)增加，無死亡；模型2組大鼠健康狀況一般，較為慵懶，飲食糞便正常，體重持續(xù)增加，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)死亡2只，第7天，與正常對照組比較，體重差異性極顯著（P<0001）；模型4組大鼠健康狀況一般，較為慵懶，飲食糞便正常，體重持續(xù)增加，無死亡，與正常對照組比較，無顯著性差異（表7）。大鼠體重變化及藥物反證結(jié)果提示，造模7 d動物出現(xiàn)急性肝損傷（肝郁脾虛證）的證候表現(xiàn)。

35造模對大鼠臟器系數(shù)的影響與正常對照組比較，其他各組的臟器系數(shù)均有不同程度的升高；模型2組大鼠出現(xiàn)肝臟腫大，肝系數(shù)升高，胸腺系數(shù)及脾系數(shù)升高，均呈現(xiàn)極顯著的差異性（P<0001），模型4組也出現(xiàn)肝臟腫大，肝系數(shù)升高，胸腺系數(shù)及脾系數(shù)升高，具有顯著性差異（P<001）（表8）。

36造模對大鼠血相關(guān)指標(biāo)的影響正常組大鼠各血肝功指標(biāo)水平均在正常范圍內(nèi)。與正常組比較，各模型組及陽性藥組在給藥后7 d血清ALT，AST，TBA，TBIL水平升高，PA水平降低；與模型2組比較，模型4組血清中ALT，TBIL水平偏低，具有顯著性差異（P<005），AST水平偏低，具有顯著性差異（P<005或P<001），而TBA和PA無顯著性差異（表9）。

37造模對大鼠肝組織形態(tài)的影響造模對大鼠的肝臟組織Riddit分析病理分級結(jié)果顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)清晰完好，肝細(xì)胞未見明顯變性、壞死，肝竇未見明顯淤血擴(kuò)張；模型2組部分肝細(xì)胞嗜酸性脂肪變，部分壞死，匯管區(qū)及間質(zhì)慢性炎細(xì)胞浸潤（P<0001），模型4組部分肝細(xì)胞嗜酸性變，匯管區(qū)慢性炎細(xì)胞浸潤（P<001）（表10）。對用復(fù)合因素造模7 d后大鼠的肝組織病理改變進(jìn)行觀察（圖2）。

4討論

急性肝損傷最早由《內(nèi)經(jīng)》描述，如《素問·六元正氣大論篇》載：“濕熱相搏，民病黃癉”，且《諸病源候論》的以下原文可證，“脾胃有熱，谷氣郁蒸，因?yàn)闊岫舅?，故猝然發(fā)黃”，“發(fā)汗不解，溫毒氣郁結(jié)在胃，小便為之不利，故變成黃，身如橘色”，“嶺南中瘴氣，土人連歷不瘥，變成此病不須治也”，“黃病者，是熱人脾胃，熱氣蘊(yùn)積，與谷氣相搏，蒸發(fā)于外，故皮膚系黃?！?此或是傷寒，或時(shí)行，或瘟病，皆由熱不時(shí)解，所以入胃也”。對上述認(rèn)識歸納總結(jié)后主要表現(xiàn)為：毒邪是致病的基本因素，正虛是發(fā)病和邪氣滯留的關(guān)鍵，血瘀是病證的主要特點(diǎn)[12]。本實(shí)驗(yàn)的造模方法中，致病因素乙醇屬中醫(yī)“濕毒”范疇，酒毒內(nèi)侵、肝膽濕熱；高脂屬“血瘀”范疇，脾胃失調(diào)，肝膽不利；豬血清刺激屬“本虛”范疇，素體正虛且感受濕邪，濕阻中焦，進(jìn)而導(dǎo)致肝氣郁滯，形成急性肝損傷（肝郁脾虛證）。

本研究在對急性肝損傷及肝郁脾虛證臨床證候表現(xiàn)統(tǒng)計(jì)分析基礎(chǔ)上制訂中醫(yī)證候積分評價(jià)量表，通過觀察大鼠死亡情況、血清生化指標(biāo)、肝組織病理情況，同時(shí)采用治療肝郁脾虛證的經(jīng)典名方逍遙丸及治療急性肝損傷的常用藥物水飛薊賓葡甲胺片，經(jīng)過中藥及西藥反證急性肝損傷（肝郁脾虛證）病證結(jié)合動物模型，觀察藥物改善指標(biāo)變化的靈敏度，以確定模型建立成功與否。

結(jié)果顯示，本研究建立的急性肝損傷（肝郁脾虛證）病證結(jié)合動物模型，體征變化情況與擬定診斷標(biāo)準(zhǔn)基本一致，肝臟病理學(xué)改變主要體現(xiàn)在肝細(xì)胞嗜酸性變，匯管區(qū)慢性炎細(xì)胞浸潤，血中指標(biāo)ALT，AST，TBA，TBIL水平升高和PA水平降低；模型2組死亡率達(dá)20%，藥物反證組無死亡，而模型4組無死亡，藥物反證組亦無死亡，可能與常規(guī)高脂低蛋白飼料中豬油含量過高有關(guān)，加之豬血清及乙醇的共同刺激，導(dǎo)致造模過度，引起大鼠死亡。與模型組比較，各藥物反證組大鼠ALT，AST，TBA，TBIL水平降低，PA水平升高，肝組織中炎癥反應(yīng)減少，嗜酸性變降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；比較兩藥物反證組的血相關(guān)指標(biāo)值及病理變化程度，可發(fā)現(xiàn)逍遙丸組對模型的改善程度優(yōu)于水飛薊賓葡甲胺片組。通過上述分析結(jié)果，可發(fā)現(xiàn)優(yōu)化后的模型4組成活率高、耗時(shí)短，且與臨床上急性肝損傷（肝郁脾虛證）患者的發(fā)病原因，證候特點(diǎn)較為貼切，適用于該類藥物的后期研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在考察高脂及乙醇2個(gè)因素對模型影響的基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化高脂飼料配比，建立了一個(gè)成活率高、耗時(shí)短，且與臨床急性肝損傷（肝郁脾虛證）典型證候變化相適應(yīng)的大鼠模型，為后期應(yīng)用于中藥復(fù)方活性發(fā)現(xiàn)、藥效評價(jià)、新藥研發(fā)和臨床方證相關(guān)性研究奠定基礎(chǔ)。

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[責(zé)任編輯馬超一]