黃榮榮，黃金鳳*，尋知慶，林森煜，李秀英，杜偉鋒

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州511447）

固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物油中6種酚類環(huán)境激素

黃榮榮，黃金鳳*，尋知慶，林森煜，李秀英，杜偉鋒

（廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院，廣東廣州511447）

建立了一種簡單、快速測定植物油中6種酚類環(huán)境激素（雙酚A、雙酚B、雙酚F、4-壬基酚、4-n-壬基酚、辛基酚）的固相萃取凈化-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。樣品加入同位素內(nèi)標(biāo)后，經(jīng)正己烷溶解，Carb/NH2固相萃取柱凈化，高效液相色譜分離，串聯(lián)四極桿電噴霧離子源負(fù)模式及多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測。雙酚A等6種環(huán)境激素在0.40～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.994；方法的檢出限為0.4～0.8 μg/kg，定量限為1.2～2.4 μg/kg；平均回收率為87.9%～98.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.37%～11.00%。該方法具有凈化效果好、定量準(zhǔn)確、靈敏快速的特點，適用于植物油中雙酚A等6種環(huán)境激素的定量分析檢測。

植物油；雙酚A；壬基酚；辛基酚；固相萃??；高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法

近年來，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)快速發(fā)展的同時，人類給環(huán)境帶去了一些生物機體以外的激素，這類激素被稱為環(huán)境激素[1-3]，如雙酚A、雙酚B、雙酚F、4-壬基酚、4-n-壬基酚、辛基酚就屬于常見的酚類環(huán)境激素，它們具有與雌激素類似的作用，能導(dǎo)致人體內(nèi)分泌失調(diào)。研究表明，攝入體內(nèi)的壬基酚可使精子數(shù)量減少，影響生物體正常的生殖和發(fā)育，而且壬基酚可在生物體內(nèi)不斷蓄積，即使每次攝入的濃度很低，也具有相當(dāng)?shù)奈：π?；辛基酚和壬基酚也可能?dǎo)致雌性性早熟和雄性精子數(shù)量減少及質(zhì)量下降等病癥[4-7]。由于雙酚A、壬基酚等在生產(chǎn)生活中的廣泛使用，已在食品中檢測到了它們的存在，極大地影響了食品安全[8-9]。因此，許多國家都對雙酚A、壬基酚的使用進(jìn)行了規(guī)定。此外，還設(shè)定了化妝品中、高分子材料中的雙酚A的檢測方法，但食品中雙酚A和壬基酚等的檢測方法仍未健全，只是適用于部分食品基質(zhì)（如魚肉、罐頭等）。

目前，國內(nèi)外對于此類環(huán)境激素的研究主要方法有液相色譜法[10-11]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12-13]，毛細(xì)管電泳法[14]、氣相色譜法[15]等。但是這些方法主要都是針對其他基質(zhì)的（如飲用水、紡織品、涂料等），基于植物油基質(zhì)的處理方法，還是比較少見。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[16]相對一般的液相色譜法來說，由于該方法不僅利用保留時間來進(jìn)行定性，還利用兩對特征離子對的響應(yīng)比例來對目標(biāo)物進(jìn)一步定性定量，所以相對其他方法來說液質(zhì)聯(lián)用法具有更明顯的優(yōu)勢。本實驗建立了高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography tamdem mass spectrometry，HPLCMC/MC）法測定植物油中雙酚A、壬基酚和辛基酚等酚類環(huán)境激素的分析方法，具有準(zhǔn)確度、靈敏度高的特點，滿足了植物油中相關(guān)物質(zhì)的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

6種化合物標(biāo)準(zhǔn)品：雙酚A（bisphenol A，BPA）、雙酚B（bisphenol B，BPB）、雙酚F（bisphenol F，BPF）、4-壬基酚（4-nonylphenol，4-NP）、4-n-壬基酚（4-n-nonylphenol，4-n-NP）、辛基酚（octylphenol，OP）（純度均＞98%），內(nèi)標(biāo)物4-n-壬基酚-d4（4-n-NP-d4）：德國Dr.Ehrenstorfer公司；內(nèi)標(biāo)物雙酚A-d4（bisphenol-A-3、3'、5、5'-d4，BPA-d4）（純度＞98%）：上海安譜科學(xué)儀器有限公司；乙腈、甲醇、丙酮、正己烷、二氯甲烷（均為色譜純）：德國Merck公司；氨水（分析純）：廣州化學(xué)試劑廠；超純水（18.2 MΩ）：實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；4000Qtrap三重四極桿質(zhì)譜儀：美國AB SCIEX公司；Milli-Q去離子水發(fā)生器：美國Millipore公司；MS3 basic漩渦混合器：德國IKA公司；Turbo LV濃縮工作站：美國Biotage公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

6種化合物用甲醇溶解，配成單標(biāo)儲備液，再用甲醇配成10 mg/L混標(biāo)儲備液。臨用時用甲醇稀釋成所需濃度的工作液，每個濃度工作液均含50 μg/L BPA-d4和4-n-NP-d4內(nèi)標(biāo)物。

內(nèi)標(biāo)物BPA-d4，4-n-NP-d4用甲醇配制，并用逐級稀釋成1 mg/L的內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.2 樣品處理方法

準(zhǔn)確稱取1.0 g（精確至0.01 g）植物油，加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作液，混勻，然后加入5 mL正己烷，渦旋1 min，充分混勻。將所得溶液通過已用6 mL正己烷活化平衡好的Carb/NH2固相萃取小柱，然后用6 mL正己烷淋洗，再用6 mL甲醇+丙酮（1∶1，V/V）淋洗，最后用9 mL甲醇+二氯甲烷（3∶7，V/V）洗脫，洗脫液于60℃氮吹至干后，用1mL甲醇溶解，過0.22μm尼龍膜，待測定。

1.3.3 儀器條件

色譜條件：MerckRP-18e色譜柱（50mm×4.6mm，5μm）；流動相：A為甲醇，B為0.05%氨水；流速：0.5 mL/min（梯度洗脫程序見表1）；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：30℃。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子模式（electrospray ionization， ESI）；電噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度：500℃；霧化氣：50 psi；輔助氣：60 psi；氣簾氣：20 psi；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；6種化合物和同位素內(nèi)標(biāo)的監(jiān)測離子對（m/z）及去簇電壓、碰撞電壓等參數(shù)見表2，每個離子對的駐留時間均為50 ms。

表2 6種化合物的質(zhì)譜MRM模式優(yōu)化參數(shù)Table 2 Optimized parameters of six compounds of mass spectrum MRM mode

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

雙酚A等目標(biāo)物結(jié)構(gòu)上的酚羥基在質(zhì)譜電離時易失去質(zhì)子，故多采用負(fù)離子模式進(jìn)行檢測。采用注射泵直接進(jìn)樣方式，以5 μL/min流速將100 μg/L雙酚A等化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入電噴霧離子源中，獲得6種目標(biāo)化合物的分子離子峰，以該離子峰為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到碎片離子信息，選擇豐度較高的兩個碎片離子為定性、定量離子，并對各個離子對的質(zhì)譜參數(shù)（如去簇電壓、碰撞能等）進(jìn)行優(yōu)化，使儀器的靈敏度、穩(wěn)定性和分離效率均處于最佳狀態(tài)。

2.2 流動相的選擇

在分離測定雙酚A等環(huán)境激素的研究中，多采用乙腈、甲醇、水、0.05%氨水為流動相。本實驗研究了流動相對雙酚A等的分離效果，結(jié)果見圖1。

圖1 流動相對6種化合物的影響Fig.1 Effect of mobile phases on six compounds

經(jīng)反復(fù)試驗，結(jié)果表明（如圖1）采用甲醇/0.05%氨水的梯度洗脫程序，對6種目標(biāo)物均有更高的響應(yīng)，其中對4-NP、4-n-NP、OP的響應(yīng)有著明顯的提高。

2.3 色譜柱的選擇

比較了實驗室常用的色譜柱YMC-PackODS-A、Merck RP-18e的分離效果，由于2種色譜柱的耐酸堿性不同，實驗中分別采用甲醇/水，甲醇/0.05%氨水為流動相。結(jié)果見圖2。

圖2 色譜柱對6種化合物的影響Fig.2 Effect of chromatographic columns on six compounds

由圖2可知，使用Merck RP-18e時，4-NP、4-n-NP、OP的響應(yīng)明顯大于使用YMC-Pack ODS-A色譜柱時的響應(yīng)。這不僅是因為柱效因素導(dǎo)致的，還與甲醇/0.05%氨水能夠更有效地離子化有關(guān)。因此，選擇Merck RP-18e色譜柱進(jìn)行分離。

2.4 固相萃取柱的選擇

本實驗選用實驗室常用的固相萃取柱，有HLB、C18、WAX、MAX、Carb/NH2等固相萃取柱。HLB是通用型的固相萃取柱，可用于酸性、中性和堿性化合物的凈化；C18固相萃取柱用于凈化非極性或極性較低的化合物；WAX和MAX是陰離子交換固相萃取柱，用于凈化離子型的化合物；Carb/NH2固相萃取柱，可去除固醇類化合物，同時可通過弱陰離子交換（水溶液）達(dá)到保留作用，當(dāng)用在非極性溶液中（如正己烷），能與帶有-OH、-NH或-SH的官能團(tuán)形成氫鍵。本實驗針對各個固相萃取柱的性質(zhì)，通過相應(yīng)的前處理，對目標(biāo)物進(jìn)行回收率實驗。采用5種固相萃取柱時，目標(biāo)物的回收率對比結(jié)果見圖3。

圖3 不同固相萃取柱對6種目標(biāo)物的回收率比較Fig.3 Comparison of recovery rates of six compounds with different solid phase extraction columns

由圖3可知，Carb/NH2固相萃取柱的回收率最好，所以采用固相萃取柱Carb/NH2。

2.5 線性范圍與檢出限

向空白樣品中添加一系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液（其線性范圍見表3），在本實驗條件下，進(jìn)行HPLC-MS/MS分析。其中BPA、4-n-NP用內(nèi)標(biāo)法計算，以目標(biāo)物定量離子峰面積（A）和內(nèi)標(biāo)物的色譜峰面積Ai的比值y對相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性回歸分析。BPB、BPF、4-NP、OP用外標(biāo)法計算，以目標(biāo)物定量離子峰面積（A）對相應(yīng)的目標(biāo)物質(zhì)量濃度（x，μg/L）進(jìn)行線性回歸分析。得到6種目標(biāo)物的線性方程。根據(jù)儀器的檢出限（limitofdetection，LOD，S/N=3）及定量限（limit of quantitation，LOQ，S/N=10），結(jié)合樣品的前處理過程，計算得到方法檢出限和方法定量限，結(jié)果見表3。

表3 6種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of six compounds

由表3可知，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.994，表明5種目標(biāo)物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；方法檢出限和定量限分別在0.4～0.8 μg/kg和1.2～2.4 μg/kg之間，表明方法具有較高的靈敏度。

2.6 方法回收率與精密度

為驗證方法的準(zhǔn)確度，按本實驗方法對陰性樣品進(jìn)行了回收率和精密度試驗。稱取空白樣品18份，每份1.0 g（精確至0.01 g），分為6組，分別定量加入6種目標(biāo)物，按試樣處理方法處理后進(jìn)行測定，結(jié)果見表4。

由表4可知，目標(biāo)物在各自添加濃度范圍內(nèi)，平均回收率為87.9%～98.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為4.37%～11.00%（n=6）。

表4 空白樣品中6種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率及精密度Table 4 Adding standard recoveries and precision degree for six compounds in blank sample

2.7 實際樣品的測定

采用本方法對從市場購買的50份植物油進(jìn)行分析，其中11個樣品檢出4-NP，含量在5.81～185 μg/kg；所有樣品均未檢出其余5種目標(biāo)化合物。由此可見，植物油中主要殘留著4-NP。

3 結(jié)論

對于植物油中的雙酚A等6種環(huán)境激素，尚未有國標(biāo)檢測方法。本文建立了固相萃取提取凈化、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測、內(nèi)標(biāo)法定量的方法來測定植物油中的6種環(huán)境激素。結(jié)果表明，6種環(huán)境激素在0.40～200 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均＞0.994；方法的檢出限為0.4～0.8 μg/kg，定量限為1.2～2.4 μg/kg；平均回收率為87.9%～98.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.37%～11.00%。該方法具有前處理簡單，凈化效果好、定量準(zhǔn)確、靈敏度高的特點，可為測定植物油中的雙酚A等環(huán)境激素殘留量的檢測提供方法參考。

[1]張萍，梁高道.環(huán)境激素對人類健康的危害及監(jiān)測方法[J].公共衛(wèi)生與預(yù)防醫(yī)學(xué)，2005，16（6）：63-65.

[2]李瑞霞.環(huán)境雌激素對動物的影響與對策[J].四川動物，2006，25（3）：673-676.

[3]趙美萍，李元宗，常文保.酚類環(huán)境雌激素的分析研究進(jìn)展[J].分析化學(xué)，2003，31（1）：103-109.

[4]郭金蓮，任慕蘭.壬基酚對成年雌性SD大鼠生殖功能的影響[J].東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2007，26（4）：287-290.

[5]李暉，楊曉燕，陳容.環(huán)境雌激素辛基酚和壬基酚對雌性大鼠生殖系統(tǒng)的損傷作用[J].新疆醫(yī)學(xué)，2008，38（10）：5-9.

[6]KORTNER T M,VANG S H,ARUKWE A.Modulation of salmon ovarian steroidogenesis and growth factor responses by the xenoestrogen 4-nonylphenol[J].Chemosphere,2009,77(7):989-998.

[7]BROTONS J A,OLEA-SERRANO M F,VILLALOBOS M,et al.Xenoestrogens released from lacquer coatings in food cans[J].Environ Health Perspect,1995,103(6):608-612.

[8]GUENTHER K,HEINKE V,THIELE B,et al.Endocrine disrupting nonylphenols are ubiquitous in food[J].Environ Sci Technol,2002,36 (8):1676-1680.

[9]BONEFELD-JORGENSEN E C,LONG M,HOFMEISTER M V,et al. Endocrine-disrupting potential of bisphenol A,bisphenol A dimethacrylate,4-n-nonylphenol,and 4-n-octylphenolin vitro:new data and a brief review[J].Environ Health Perspect,2007,115:69-76.

[10]劉付建，郭新東，翁乙斌，等.QuEChERS/超高效液相色譜法測定水性涂料中5種酚和酚類衍生物[J].分析測試學(xué)報，2014，33（3）：329-333.

[11]ZHOU Q,GAO Y,XIE G.Determination of bisphenol A,4-n-nonylphenol,and 4-tert-octylphenol by temperature-controlled ionic liquid dispersive liquid-phase microextraction combined with high performance liquid chromatography-fluorescence detector[J].Talanta,2011,85: 1598-1602.

[12]ASIMAKOPOULOSAG,THOMAIDISN S.Bisphenol A,4-t-octylphenol,and 4-nonylphenol determination in serum by hybrid solid phase extraction-precipitation technology technique tailored to liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B,2015,1 (986-987):85-93.

[13]INOUE K,KAWAGUCHI M,OKADA F,et al.Measurement of 4-nonylphenol and 4-tert-octylphenol in human urine by column-switching liquid chromatography-mass spectrometry[J].Anal Chim Acta,2003, 486:41-50.

[14]BABAY P A,GETTAR R T,SILVA M F,et al.Separation of nonylpenol ethoxylates and nontlpjenol by non-aqueous capillary electrophoresis[J]. J Chromatogr A,2006,1116(12):277-285.

[15]張洛紅，杜婷，鐘佳宇.新型毛細(xì)管內(nèi)固相萃取-氣相色譜法檢測紡織品中烷基酚類物質(zhì)[J].色譜，2015，33（10）：1065-1070.

[16]何敏恒，李秀英，曾令浩，等.同位素稀釋-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蜂蜜中泛酸含量[J].中國釀造，2015，34（4）：157-160.

Determination of six phenol environmental hormones in plant oil by solid-phase extraction coupled with HPLC-MS/MS

HUANG Rongrong,HUANG Jinfeng*,XUN Zhiqing,LIN Senyu,LI Xiuying,DU Weifeng
(Guangzhou Quality Supervision and Testing Institute,Guangzhou 511447,China)

A simple and quick analysis method was established for the determination of six phenol environmental hormones(bisphenol A,bisphenol B, bisphenol F,4-nonylphwnol,4-n-nonylphenol,octylphenol)in plant oil by HPLC-MS/MS and solid phase extraction(SPE).After addition of the isotope internal standard,the samples were dispersed with hexane and cleaned by Carb/NH2solid phase extraction column,and then analyzed by HPLC-MS/MS in the multiple reaction monitoring(MRM)mode.Under the optimal experimental conditions,the calibration curves of six phenol environmental hormones were linear in the range of 0.40-50.0 μg/L with correlation coefficients more than 0.994.The limits of detection and the limits of qualification of the method were 0.4-0.8 μg/kg and 1.2-2.4 μg/kg,respectively.The mean recovery rate of six phenol environmental hormones were 87.9%-98.0%combining with the relative standard deviation ranging from 4.37%-11.00%.The method was suitable for the identification and quantification of six phenol environmental hormones in plant oil due to its simplicity and accuracy.

plant oil;bisphenol A;4-nonylphwnol;octylphenol;solid phase extraction;HPLC-MS/MS

O657.7

0254-5071（2017）03-0178-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.036

2016-12-05

黃榮榮（1986-），女，工程師，本科，研究方向為食品及相關(guān)產(chǎn)品檢測。

*通訊作者：黃金鳳（1979-），女，高級工程師，碩士，研究方向為食品及食品相關(guān)產(chǎn)品安全檢測、儀器分析技術(shù)。