崔麗霞，張志軍，李曉君，李會珍

（中北大學化工與環(huán)境學院，山西太原030051）

花青素提取、分離純化技術(shù)研究進展

崔麗霞，張志軍*，李曉君，李會珍

（中北大學化工與環(huán)境學院，山西太原030051）

花青素是水溶性天然色素，具有重要的營養(yǎng)價值和藥用價值，在食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)有著巨大的潛力。綜述花青素的溶劑浸提法和輔助提取法等提取方法，膜分離法、柱層析法、高效液相色譜法和高速逆流色譜法等純化方法，總結(jié)各種方法的優(yōu)勢和不足，為花青素的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和深入研究提供參考。

花青素；提取；純化

Abstract：Anthocyanins which are water-soluble natural colorants and possess significant nutritional and pharmaceutical values，have great potential in food，cosmetics and medicine industries.The extraction methods，such as solvent extraction and the assisted extraction，and the purification methods，such as membrane separation，column chromatograph，high performance liquid chromatograph and high speed counter current chromatograph were reviewed.The advantages and disadvantages of various methods were summarized.The paper provided a reference for industrial development and further study of anthocyanins.

Key words：anthocyanins；extraction；purification

花青素是水溶性天然色素，屬黃酮類化合物，存在于植物細胞的液泡中，能隨液泡pH值變化呈現(xiàn)出不同顏色。在食品工業(yè)，合成色素的安全性備受質(zhì)疑，而天然植物色素花青素副作用小、安全性高、著色艷麗，廣受好評。在歐洲、日本、美國等國家，天然來源的花青素被廣泛應(yīng)用在食品和飲料中[1]?；ㄇ嗨氐牧硪粋€顯著特征是具有抗氧化、抗癌、降血糖、降血脂、保護心血管等多種生物活性[2-4]，還具有防止體重增加，保護視力等功能[5-6]，因此研究者對花青素的開發(fā)和研究越來越感興趣。提取純化方法關(guān)系到花青素的活性研究及結(jié)構(gòu)鑒定，進而關(guān)系到花青素產(chǎn)品的開發(fā)，因此本文對國內(nèi)外花青素提取和純化方法進行了系統(tǒng)的綜述，旨在為花青素進一步研究奠定基礎(chǔ)，為花青素的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 花青素的提取

花青素的提取方法主要包括兩類：溶劑浸提法和輔助提取法。其中，溶劑浸提法是傳統(tǒng)的提取方法，目前仍然被各實驗室所用。隨著科技的發(fā)展，以提取率高、條件溫和、溶劑用量少和環(huán)境友好等為直接目標，出現(xiàn)了超聲波輔助提取法，微波輔助提取、酶輔助提取法、雙水相萃取法、高壓脈沖電場法和超臨界流體萃取等提取方法。

1.1 溶劑浸提法

溶劑浸提法是指將植物材料干燥粉碎或新鮮材料破碎后直接加入溶劑浸提。為了避免細胞內(nèi)花青素不被降解，某些學者也采用液氮研磨或冷凍干燥（-80℃）的方法來處理植物材料[7-8]。適宜的提取條件為4℃避光浸提1 d～2 d，或50℃～70℃攪拌浸提1 h～2 h。提取溶劑包括水、乙醇、甲醇、丙酮或者幾種溶劑的混合溶液。幾種提取溶劑的提取效率不同，水提法提取率低，雜質(zhì)含量高；乙醇無毒，且提取率高，是常用的提取溶劑；甲醇和丙酮有毒，限制了它們的應(yīng)用，但實驗室的基礎(chǔ)研究并不受此限制。由于花青素在酸性條件下穩(wěn)定，在提取時為了防止花青素降解，通常加入一定量的有機酸或無機酸，甲酸、乙酸、三氟乙酸、檸檬酸、鹽酸等較為常用[9]，硫酸、硝酸也有報道[10]。該法操作簡單，不足之處是提取時間長，效率低，常與各種輔助提取手段結(jié)合使用。

1.2 輔助提取法

1.2.1 超聲波輔助提取法

超聲能量產(chǎn)生強烈的空化效應(yīng)加速了溶劑對植物組織的滲透，提高了溶質(zhì)的浸出效率。目前，該法被廣泛應(yīng)用于植物多酚、多糖等生物活性物質(zhì)的提取。在超聲波提取過程中，超聲功率、時間、溫度等在適合的范圍內(nèi)能提高花青素的提取率，需要研究這些因素的單獨和協(xié)同作用對結(jié)果的影響，從而優(yōu)化出最佳方案。Rodrigues等[11]通過響應(yīng)面法優(yōu)化了巴西嘉寶果皮的超聲輔助提取工藝，最適合的提取工藝為：乙醇體積分數(shù) 46%，pH1，料液比 1∶20（g/mL），在此條件下，花色苷提取率為4.8 mg/g干重。Ivanovic等[12]研究了超聲輔助法提取黑莓花青素，在一定的超聲功率（60 W）下，隨著超聲提取時間（15 min～30 min）的延長和提取溫度（25℃～40℃）的升高，花青素的提取率和提取物的抗氧化活性也隨之升高。與傳統(tǒng)的提取方法相比，超聲波提取法能降低提取溫度，避免高溫對花青素的降解，縮短提取時間，同時該法具有設(shè)備簡單，操作方便的特點。此法使用大量的有機溶劑，需要對有機溶劑進行有效回收，另外由于有機溶劑具有易燃性，因此在放大生產(chǎn)中必須考慮設(shè)備的安全性。

1.2.2 微波輔助提取法

微波輔助提取法是利用微波加熱來促進溶劑的萃取速度和效率的方法。Liazid等[13]采用微波提取法從葡萄皮中提取花青素，提取工藝為微波功率500 W，提取溫度100℃，甲醇體積分數(shù)40%，相對于傳統(tǒng)的溶劑浸提法，提取時間從5 h縮短至5 min，同時發(fā)現(xiàn)提取物種的3種?；ㄇ嗨卦趥鹘y(tǒng)提取法的提取物中并不存在。賈士芳等[14]比較了熱水浸提、直接酸解、超聲波和微波輔助4種提取方法對紫玉米穗軸花青素提取結(jié)果的影響，4種方法的提取時間分別為720、360、40、7 min；提取溫度分別為 65、60、50、40 ℃；花青素得率分別為7.85%、12.11%、18.42%、16.78%，表明超聲波和微波法有顯著的優(yōu)勢，尤其是微波提取法，提取時間只有7 min，而提取率與超聲波法相差不大。該法具有操作簡單，提取時間短，有效成分得率高的優(yōu)勢。但是該法同超聲波輔助提取法一樣使用大量的有機溶劑，因此提取過程要加強安全管理。

1.2.3 酶輔助提取法

在提取溶劑中加入一定量的酶對植物細胞進行破壁，有利于目標產(chǎn)物的溶出。張慢等[15]等優(yōu)化了酶-超聲波輔助法提取紫薯花青素的條件，結(jié)果表明，當纖維素酶添加劑量為54 U/mL時，該法與傳統(tǒng)的有機溶劑浸提法相比花青素得率提高了2.73倍，提取時間縮短了75%。Segade等[16]在提取溶劑中添加纖維素酶、多聚半乳糖醛酸酶，果膠酶等對葡萄皮細胞進行軟化，結(jié)果縮短了浸提時間，受到酶的劑量和葡萄品種的影響，花青素得率比對照提高8%～15%。此法作用條件溫和，提取率高，不足之處是在處理結(jié)束后，酶的回收和再利用造成了困難，從而增加了提取成本。

1.2.4 雙水相萃取法

雙水相萃取法利用短鏈醇（乙醇、甲醇和異丙醇）和無機鹽（如磷酸鹽和硫酸鹽）形成穩(wěn)定的、可調(diào)的雙水相體系統(tǒng)，給目標產(chǎn)物提供了一個溫和無毒的環(huán)境。這種方法在提取的同時，對樣品有初步純化的作用。Wu等[17]利用乙醇-NaH2PO4雙水相系統(tǒng)提取葡萄汁中的花青素，最優(yōu)條件為NaH2PO4質(zhì)量分數(shù)28%，乙醇體積分數(shù)25%，提取溫度25℃，提取時間1 h，在此條件下花青素回收率達到99%以上，同時除去75%的多糖。Liu等[18]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了紫薯花青素的提取條件，當料液比 1∶45（g/mL），（NH4）2SO4質(zhì)量分數(shù)22%，乙醇體積分數(shù)25%，pH3.3時，花青素得率為90.02%。此法在接近室溫的條件下操作，條件溫和，活性物質(zhì)損失少，同時易于放大操作，比較適合工業(yè)化的應(yīng)用，但是此法相分離時間長，單次分離效率不高等限制了其工業(yè)化的應(yīng)用。另外，此法中廢鹽水的后續(xù)處理比較困難。

1.2.5 高壓脈沖電場法

高壓脈沖電場產(chǎn)生的電脈沖破壞細胞膜，導致細胞膜形成暫時（可逆）或永久性（不可逆）的孔，從而加速了細胞內(nèi)容物的釋放，電場強度是影響提取物濃度的重要因素。Puértolas等[19]等將高壓脈沖電場應(yīng)用于紫薯花青素的提取研究，預(yù)處理工藝為電場強度3.4 kV/cm，處理時間105 μs，在此條件下顯著的提高了花青素的提取率；進一步比較發(fā)現(xiàn)，水作為提取溶劑，處理組的花青素得率為65.8 mg/100 g鮮重，而96%乙醇作為提取溶劑，未處理組的花青素得率為63.9 mg/100 g鮮重，這表明高壓脈沖電場法極大的減少了有機溶劑的使用。López-Giral等[20]利用高壓脈沖電場法提取葡萄皮中的酚類化合物，產(chǎn)品的色度，花青素和多酚含量均高于對照組，但提高幅度與葡萄品種有關(guān)，應(yīng)針對植物材料不同，選擇最佳的處理條件。該法最大特點是處理時間短，所需有機溶劑少，環(huán)境友好，然而此法需要在短時間內(nèi)產(chǎn)生強的高壓電場，對設(shè)備要求較高。

1.2.6 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取是以高壓、高密度的超臨界狀態(tài)流體為溶劑，從原料中萃取所需要的組分，然后采用升溫、降壓或二者兼用的方法，將溶劑與所萃取的組分進行分離的一門新型工藝。該過程以CO2為萃取劑，通過混合改性劑水、乙醇、甲醇或丙酮來提取花青素等極性成分。Paes等[21]對超臨界CO2提取藍莓果渣花青素的工藝進行了研究，萃取溫度40℃，萃取壓力20 MPa，溶劑流速10 mL/min，添加5%水和5%乙醇，其產(chǎn)量，抗氧化性，多酚含量和花青素含量為最優(yōu)。該法具有明顯的提取優(yōu)勢，首先，CO2為萃取劑，具有無色、無味、無毒、不易燃、安全和高性價比的特點；同時，該法提取溫度低，減少了生物活性物質(zhì)的降解；另外，該法顯著減少了有機溶劑的使用，是一種環(huán)境友好的提取技術(shù)，因此在生物活性物質(zhì)的提取方面受到很高的重視。雖然涉及到大型設(shè)備和安裝成本，但從長期利益分析，符合綠色環(huán)保的現(xiàn)代工業(yè)提取概念，發(fā)展?jié)摿薮蟆?/p>

2 花青素的分離純化

花青素粗提物中含有大量的糖類、有機酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等，不僅含量低，色價低，而且容易吸潮，在實際應(yīng)用中會產(chǎn)生大量的沉淀，也不能滿足活性研究及結(jié)構(gòu)鑒定的需要，因此需建立經(jīng)濟有效的純化方法來消除雜質(zhì)。目前，花青素的分離純化方法主要包括以下幾種。

2.1 膜分離法

膜分離法是以選擇性透過膜為分離介質(zhì)，利用膜對混合物各組分滲透性能的差異實現(xiàn)分離、提純或濃縮的技術(shù)。常用的膜分離法有微濾、超濾、納濾、反滲透和電滲析。徐貞貞等[22]研究了不同的膜分離法對花青素粗提液的濃縮效果，結(jié)果表明無機陶瓷膜超濾+納濾膜，和無機陶瓷膜超濾+反滲透兩種集成膜處理工藝均可得到品質(zhì)優(yōu)越的花青素濃縮液。Husson等[23]采用電滲析膜裝置，在膜裝置上施加電場，導致花青素在電場遷移，從而有效富集花青素。膜分離法無需加熱，能夠保留天然產(chǎn)物的生物活性。然而，隨著分離時間的延長，造成膜的污染和堵塞，因此在使用中需要適當增加膜的使用面積，或多種膜分離方法串聯(lián)使用，并對膜進行定期清洗，以增加膜的使用壽命。

2.2 柱層析法

柱層析法又稱柱色譜法，是根據(jù)樣品混合物中各組分在固定相和流動相中分配系數(shù)的不同，從而進行分離的一種方法。根據(jù)填充基質(zhì)和樣品分配交換原理的不同，可分為大孔樹脂柱、硅膠柱、聚酰胺柱、凝膠柱和離子交換柱。大孔樹脂具有操作簡單、可再生和成本低的特點，是純化花青素的主要方法。目前市場上有不同類型的大孔樹脂，滿足了不同的純化需要。胡曉梅等[24]比較了10種大孔樹脂對越橘花青素的純化效果，結(jié)果表明DM21樹脂為具有較好的吸附和解析能力，為純化越橘花青素的最佳樹脂，經(jīng)HPLC檢測，純化后的花青素含量為36%，產(chǎn)品純度完全符合歐洲標準。本實驗室利用AB-8樹脂純化紫蘇花青素，純度為5.437%，是純化前的7.269倍[25]。

大孔樹脂與其它柱層析法串聯(lián)使用，能獲得更高純度的花青素產(chǎn)品。Yang等[26]利用大孔樹脂AB-8和凝膠柱Sephadex LH-20純化樹莓花青素，矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-槐糖苷的純度分別為95.52%和94.76%。Kang等[27]串聯(lián)使用離子交換大孔樹脂XAD-7，硅膠RP-18和凝膠柱Sephadex LH-20，結(jié)合液質(zhì)及核磁分析，純化并鑒定了紫蘇葉提取物中的多種花青素和酚類化合物。

2.3 高效液相色譜

高效液相色譜分離的產(chǎn)品具有純度高、回收率高且分離效率高的優(yōu)點，并具有較大的樣品處理能力，被廣泛應(yīng)用在花青素的分離、富集和純化。由于花青素在酸性條件下穩(wěn)定，應(yīng)使用耐酸性強的色譜材料。Wang等[28]串聯(lián)使用 Amberlite XAD-7HP、Sephadex LH-20和半制備液相色譜法相結(jié)合的方法，從野生藍莓得到3個單體花青素錦葵色素-3-O-葡萄糖苷，牽牛色素-3-O-葡萄糖苷，飛燕草色素-3-O-葡萄糖苷，純度分別為97.7%，99.3%和95.4%。Chorfa等[29]首先用固相萃取柱硅膠C-18和DSC-SCX陽離子交換樹脂對野生藍莓花青素進行純化，然后通過制備液相色譜法分級分離，LC-MS和NMR進行結(jié)構(gòu)鑒定，主要花青素包括飛燕草素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷，矢車菊素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷，芍藥色素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷，錦葵色素-3-半乳糖苷和葡萄糖苷的純度幾乎高達100%。

2.4 高速逆流色譜

高速逆流色譜是一種液-液色譜分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的固體支持基質(zhì)相比，具有能夠減少吸附損失和樣品失活，避免溶質(zhì)峰的污染和拖尾，樣品回收率高的優(yōu)點，已經(jīng)應(yīng)用在天然產(chǎn)物的分離與純化領(lǐng)域，該方法的重點在于兩相溶劑體系的優(yōu)化。Chen等[30]首先利用AB-8樹脂初步純化金銀花花青素，然后應(yīng)用叔丁基甲基醚/正丁醇/乙腈/水/三氟乙酸組成的兩相溶劑體系（2∶2∶1∶5∶0.01，體積比），從100 mg金銀花花青素粗提物中，得到了22.8 mg純度為98.1%的矢車菊素-3-葡萄糖苷。胡曉丹等[31]先后利用XAD-7樹脂和高速逆流色譜純化紫蘇花青素，丙二?；咸K寧和紫蘇寧純度分別為96.7%、97.5%。

3 總結(jié)和展望

針對以上花青素提取和純化方法的研究，歸納總結(jié)如下：提取方面，傳統(tǒng)的溶劑浸提法提取率低，耗時長，而輔助提取方法具有顯著的優(yōu)勢，尤其是高壓脈沖電場和超臨界輔助提取法具有提取率高、溶劑用量少和環(huán)境友好的特點，發(fā)展?jié)摿薮?。純化方面，需要針對純化目的來選擇純化方法，大孔樹脂法適合對花青素的前期純化，后續(xù)可以通過與其他純化方法組合使用，來獲得更高純度的產(chǎn)品。

隨著人們保健意識的提高，市場上對花青素產(chǎn)品的需求量越來越大。深入研究花青素的提取純化方法，能有效促進花青素資源的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)，滿足消費者的需要。提取和純化是一項系統(tǒng)工作，如何簡化操作、降低成本，同時獲得提取率高、回收率高和生物活性高的產(chǎn)品是一項挑戰(zhàn)性課題。在以后的工作中，一方面在現(xiàn)有的技術(shù)基礎(chǔ)上，繼續(xù)優(yōu)化提取純化工藝，積極探索和開發(fā)新技術(shù)，提高花青素的提取純化效率，為花青素的研究和應(yīng)用提供有力的技術(shù)支持。另一方面加大研究成果的轉(zhuǎn)化力度，探索花青素的標準化生產(chǎn)工藝，從而獲得質(zhì)優(yōu)價廉的花青素產(chǎn)品。

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Research Progress on Extraction，Separation and Purification of Anthocyanins

CUI Li-xia，ZHANG Zhi-jun*，LI Xiao-jun，LI Hui-zhen
（School of Chemical Engineering and Environment，North University of China，Taiyuan 030051，Shanxi，China）

2017-02-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.20.041

山西省科技廳社會發(fā)展攻關(guān)項目（201603D321031）；山西省農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目（20150311009-4）

崔麗霞（1976—），女（漢），講師，碩士，研究方向：植物有效成分提取。

*通信作者：張志軍（1973—），男（漢），博導，博士，主要從事植物資源開發(fā)與利用研究。