周紅玲　陳石　鄭云云

摘要 概述了低溫脅迫下寒害凍害導(dǎo)致的香蕉形態(tài)結(jié)構(gòu)與生理生化變化，以及細胞工程、抗寒基因工程方面的研究進展，以供參考。

關(guān)鍵詞 香蕉；凍害；寒害；生理生化；抗寒細胞工程；抗寒基因工程；研究進展

中圖分類號 S663 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）04-0057-02

香蕉是芭蕉科（Musaceae）芭蕉屬（Musa）植物，是世界第二大水果和第四大糧食作物，全球共有136個國家和地區(qū)種植。我國香蕉主要分布于廣東、廣西、福建、海南、云南等省，貴州、四川等地也有少量栽培。寒害、凍害是影響我國香蕉生產(chǎn)最主要的自然災(zāi)害之一，輕則株殘減產(chǎn)，重則株死失收。寒害、凍害對香蕉影響的研究，首先是其形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的一般性描述，其次是其生理生化變化和生理調(diào)節(jié)機制，然后發(fā)展到細胞分子水平。

1 寒害凍害對香蕉形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

1.1 形態(tài)的變化

低溫脅迫下，香蕉葉片最易遭受低溫寒害，首先轉(zhuǎn)黃，出現(xiàn)水漬狀斑點；然后逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)楹诤稚?，軟化枯死；若溫度進一步降低產(chǎn)生凍害，香蕉葉柄及假莖則出現(xiàn)濃黃褐色水漬斑，直至腐爛死亡。這些表觀癥狀是判斷香蕉是否受到寒害凍害影響的最直觀的參考指標。林日榮、凌興漢、Shmueli E.等有關(guān)于香蕉植株冷害癥狀的觀察報告[1-3]。雷朝云等[4]根據(jù)香蕉葉片和假莖受害程度，將香蕉寒害依次劃分等級。

1.2 葉片組織結(jié)構(gòu)的變化

Shmueli E.等報道了冷害對葉片組織結(jié)構(gòu)的影響，并從香蕉葉片組織結(jié)構(gòu)及其蒸騰特點等方面研究香蕉的冷害機理。國內(nèi)也有研究報道，香蕉葉片組織細胞結(jié)構(gòu)緊密度（CCTR或CTR）和疏松度（SR或PR）與其抗寒力有關(guān)，緊密度越大，疏松度越小，則抗寒力越強，并得出與實際相符的抗寒力大小順序，具有品種特異性和穩(wěn)定性[5-7]。

2 寒害、凍害對香蕉生理生化的影響

2.1 相對電導(dǎo)率

受低溫等逆境脅迫時，植物細胞原生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)被破壞，細胞膜的選擇透性改變或喪失，導(dǎo)致細胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲，外滲物質(zhì)中約20%是K+，80%是葡萄糖、氨基酸及低聚糖類等[8]。因此，可通過測定香蕉細胞組織浸出液的電導(dǎo)率，推測其耐寒能力[9]。一般使用相對電導(dǎo)率[6，10-11]來衡量香蕉的耐寒力，電導(dǎo)率越大，耐寒力越弱。相對電導(dǎo)率法測定的耐寒力程度與其田間表現(xiàn)吻合。

2.2 丙二醛（MDA）含量

逆境脅迫會引發(fā)或加劇植物膜脂過氧化反應(yīng)。膜脂過氧化產(chǎn)生的中間產(chǎn)物自由基和最終產(chǎn)物丙二醛（MDA）都會對生物膜造成嚴重的損傷[12]，降低膜脂流動性，增大質(zhì)膜透性[13-14]。測定丙二醛含量可以評價質(zhì)膜受損程度。丙二醛的含量與植物抗寒能力的大小呈反相關(guān)，丙二醛含量越高，植物的抗寒性越弱，反之，則越強。越冬期間香蕉植株內(nèi)MDA含量呈上升趨勢，臺灣蕉MDA含量明顯高于柴蕉[15]。在越冬期，經(jīng)多效唑（PP333）、脫落酸（ABA）、氯化膽堿（CC）等處理[15-17]，香蕉MDA含量均明顯下降，一定程度上提高了香蕉的抗寒性。

2.3 酶活性

逆境脅迫下植物出現(xiàn)的傷害可能涉及到活性氧的毒害作用，植物體通過酶促和非酶促2類防御系統(tǒng)來保護其機體免受傷害[18-19]。SOD、POD、CAT等保護酶都屬于活性氧清除劑，測定這幾種酶的活力可以評價機體受活性氧毒害程度。植物體內(nèi)所含的SOD、POD、CAT等越多，越能有效地清除植物體內(nèi)活性氧的積累，則由活性氧引起的傷害就越小，耐寒力就越強。越冬期間低溫脅迫引起香蕉保護酶SOD、CAT、POD活性呈下降趨勢，其中香蕉保護酶（SOD、CAT、POD）的活性下降幅度比柴蕉大[15，20]，且它們的變化與幼苗抗冷性的提高存在著明顯的相關(guān)性[21-22]?？箟难幔ˋSA）、谷胱甘肽（GSH）等屬于非酶系統(tǒng)。香蕉在冷害過程中，葉片中抗壞血酸含量明顯下降，大蕉葉片中的抗壞血酸含量一直高于香蕉且降幅很小[22]。生產(chǎn)上通過噴施多效唑（PP333）[20，23]、甜菜堿（BT）和殼聚糖（CTS）[24-25]、氯化膽堿（CC）[17]、水楊酸（SA）[26-27]、過氧化氫（H2O2）[28]、Ca2+ [29]、硝酸鑭[10]可以提高香蕉保護酶SOD、POD和CAT的活性，降低葉片細胞的膜脂過氧化程度，降低質(zhì)膜透性等增強香蕉的抗冷性。

3 抗寒細胞工程方面的研究進展

3.1 原生質(zhì)體培養(yǎng)

以單個原生質(zhì)體進行準確的遺傳操作，易于進行轉(zhuǎn)化體的篩選和分析，避免嵌合現(xiàn)象；轉(zhuǎn)化后形成的愈傷組織可進行早期篩選且再生植株往往是純合體，且在遺傳上易穩(wěn)定。原生質(zhì)體作為受體系統(tǒng)進行遺傳操作廣泛應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化研究。最早是Bakry[30]從香蕉花序愈傷組織中成功分離出活的原生質(zhì)體。Cronauer等[31-33]也進行了關(guān)于獲得原生質(zhì)體的報道，但是產(chǎn)量很低且不能進行細胞分裂。Assani等[34]認為由葉肉細胞和愈傷組織起源的原生質(zhì)體無法分裂，而細胞懸浮系起源的原生質(zhì)體產(chǎn)量最高、可再生成完整植株；Megia等[35]和Panis等[36]由煮食蕉“Bluggoe”（ABB）多芽體途徑誘導(dǎo)獲得的優(yōu)良胚性懸浮細胞系制備高質(zhì)量的原生質(zhì)體，采用高密度培養(yǎng)及看護培養(yǎng)方法，通過胚狀體發(fā)生方式直接形成完整植株，是香蕉原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)的重要進步。Matsumoto、肖望、Assani等同樣應(yīng)用看護培養(yǎng)方法成功獲得香蕉再生植株[34，37-41]。目前，成功進行原生質(zhì)體培養(yǎng)的香蕉品種共有12個（AA、AAB、ABB、BB），為香蕉體細胞雜交和基因轉(zhuǎn)化提供新途徑。

3.2 體細胞雜交

野生香蕉（AA、BB、AB）或大蕉類（AAB、ABB）存在抗病、抗寒等抗逆性基因，現(xiàn)有主栽品種（AAA、ABB、BBB等）存在與品質(zhì)有關(guān)的某些優(yōu)良基因或抗性基因?？梢酝ㄟ^原生質(zhì)體融合進行體細胞雜交獲得雜種細胞，再用低溫條件篩選出抗寒細胞系，然后對其進行培養(yǎng)誘導(dǎo)，分化出新的抗寒株系。此項技術(shù)在一定程度上克服了香蕉有性雜交困難的問題，而且在轉(zhuǎn)移多基因控制的性狀方面具有明顯的優(yōu)勢。Matsumoto等[42]采用電融合法融合了香蕉品種cv.Musa（AAB）和野生蕉cv.LiDi（AA）的原生質(zhì)體，培養(yǎng)獲得不同倍性的再生植株，但是存在頻率較低、且重復(fù)性較差的缺點。肖 望等[38-39]采用不對稱融合法，獲得了龍牙蕉和貢蕉的融合再生株。但香蕉的原生質(zhì)體融合技術(shù)尚處于探索階段。

4 抗寒基因工程的研究進展

植物抗寒性是一個數(shù)量性狀，受微效多基因控制，是植物長期適應(yīng)低溫環(huán)境而形成的一種潛在的遺傳特性?？购蚴且活愓T導(dǎo)型基因，只有受特定條件誘導(dǎo)啟動表達后，才表現(xiàn)出抗寒力[43]。香蕉基因工程研究主要集中在抗病方面，抗寒基因研究相對較少。

大多數(shù)香蕉栽培品種是三倍體，生長周期長，而且不孕，給繁殖和育種帶來一定的困難。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展為香蕉品種的改良提供了一種有效的手段。在香蕉的遺傳轉(zhuǎn)化中，高效的受體系統(tǒng)和轉(zhuǎn)化方法是外源基因成功導(dǎo)入的基礎(chǔ)。從有關(guān)報道看，香蕉轉(zhuǎn)基因受體主要為莖尖或莖微盤、懸浮細胞、原生質(zhì)體和愈傷組織。

當植物受到低溫或水分脅迫時，一些抗寒基因的啟動子被激活[44]，誘導(dǎo)抗寒調(diào)節(jié)基因表達，目前已經(jīng)克隆了許多植物抗寒相關(guān)基因[45]?？祰碌萚26-27]采用mRNA差異顯示法區(qū)分經(jīng)SA誘導(dǎo)冷處理的香蕉幼苗與未處理之間的基因差異表達，克隆低溫脅迫下SA誘導(dǎo)的顯著表達的2條差異帶（G和A），并測序發(fā)現(xiàn)G片段與大豆在冷脅迫下2個高表達基因片段的部分序列有92%的同源性。Santos[46]分析了香蕉在低溫下的表達序列標簽。

目前，在香蕉基因轉(zhuǎn)化上取得成功的方法主要有電激法、基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等3種方法。并且在AAA、AAB和ABB基因型香蕉上轉(zhuǎn)化均獲得成功，但幾乎都是抗病基因的轉(zhuǎn)化。香蕉抗寒基因轉(zhuǎn)化方面研究很少。劉德斌[47]利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)將在BR誘導(dǎo)下低溫脅迫的香蕉幼苗中特異表達的香蕉rbcS-mc基因通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草植株。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化頻率更高、重復(fù)性更好的香蕉遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，如農(nóng)桿菌和基因槍結(jié)合法、離心輔助農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、真空滲透技術(shù)等。這些新技術(shù)新方法的出現(xiàn)，必將推動香蕉產(chǎn)業(yè)的高速發(fā)展。

5 問題與展望

香蕉原產(chǎn)于熱帶地區(qū)，遺傳特性決定其抗寒能力較差。雖然在香蕉抗寒生理的研究上取得了很好的成績，但在抗寒機理（蛋白質(zhì)、DNA），尤其是分子遺傳特性等方面的研究還很少。植物的抗寒性是一種積累性的多基因控制的性狀，通過分子技術(shù)克隆香蕉的抗寒基因并通過基因工程手段來提高香蕉的抗寒性方面的研究還較少。冷信號如何傳遞、各種抗寒基因如何發(fā)揮抗寒活性等問題尚需深入研究。另外，在進行植物抗寒基因工程研究的同時仍需加強基礎(chǔ)研究，尋找抗寒主基因，推動抗寒轉(zhuǎn)基因育種發(fā)展。

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