郝翠翠， 梁成偉， 石 蕾

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院, 青島 266042)

尼羅紅和BODIPY熒光染料在微藻油脂含量測(cè)定中的應(yīng)用

郝翠翠， 梁成偉， 石 蕾

(青島科技大學(xué) 化工學(xué)院, 青島 266042)

面對(duì)能源危機(jī)，利用微藻生產(chǎn)生物燃料及其相關(guān)高附加值產(chǎn)品引起了人們的極大關(guān)注。微藻種類多樣，繁殖速度快，不占用耕地, 具有很高的油脂產(chǎn)量的潛能，是下一代食品、種子、化妝品和生物可再生能源最有希望的可選擇性原料。發(fā)展這種資源的主要挑戰(zhàn)是通過測(cè)定微藻中的無色油脂含量篩選富油品系，而與傳統(tǒng)質(zhì)量法檢測(cè)油脂含量相比，熒光染料法更簡(jiǎn)單便宜、容易操作。主要介紹了尼羅紅染料和BODIPY染料的特性，以及它們?cè)谖⒃逵椭瑴y(cè)定中的應(yīng)用和存在的問題。為快速準(zhǔn)確檢測(cè)微藻細(xì)胞的油脂含量，高效篩選優(yōu)良產(chǎn)油藻株提供參考建議。

尼羅紅；BODIPY；微藻；油脂染色

微藻是第3代生物能源的潛在資源，主要原因在于它們以自養(yǎng)方式生產(chǎn)、不占用農(nóng)業(yè)土地資源、可以在海水或廢水中培養(yǎng)，并且比第1代生物燃料具有更高的產(chǎn)油量[1]。但是構(gòu)建產(chǎn)油微藻，其關(guān)鍵問題在于建立精確、簡(jiǎn)單、可靠、可重復(fù)的油脂數(shù)量及質(zhì)量測(cè)定方法。微藻中油脂的存在形式主要是三酰甘油以及中性油脂。傳統(tǒng)的油脂測(cè)定方法需要沉重昂貴的儀器設(shè)備，并且需要專業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，例如薄層色譜法、高壓液相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法。單純的一個(gè)三酰甘油測(cè)定全過程就要花費(fèi)幾個(gè)小時(shí)，每個(gè)樣品總花費(fèi)(包括設(shè)備、人力和消費(fèi))較高。近些年來熒光染料廣泛應(yīng)用于油脂測(cè)定，與上述方法比較起來，熒光染料更簡(jiǎn)單、便宜且容易操作。目前最常用的油脂染料是尼羅紅和BODIPY505/515[2]。尼羅紅最初用于半定量技術(shù)[3]，但隨著技術(shù)的改進(jìn)，現(xiàn)已廣泛用于檢測(cè)油脂水平。氟硼熒(BODIPY)染料是一種新興的熒光染料，因其突出的優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛的應(yīng)用。本文主要介紹尼羅紅和BODIPY熒光染料作為油脂測(cè)定染料的特性、應(yīng)用和不足。

1 染色原理

1.1 染料的理化特性

尼羅紅(9-二乙胺-5-氫-苯吩噁嗪-5-一)是一種親脂性的惡嗪類熒光染料，其分子式為C20H18N2O2，分子質(zhì)量為318.37 u。作為一種疏水、變色染料，在水中具有低溶解、低熒光量的特性，能夠與脂類物質(zhì)包括蠟脂、三脂酰甘油和各種脂肪酸結(jié)合后，在激發(fā)光下發(fā)出強(qiáng)烈的金黃色熒光。

氟硼熒又稱氟化硼絡(luò)合二吡咯甲川類化合物(4,4-二氟-4-硼-3a,4a-雙氮雜-s-茚，Boron-dipyrromethene, 簡(jiǎn)稱BODIPY)，分子式為C13H15BF2N2，分子質(zhì)量為248.0817 u，能夠與細(xì)胞內(nèi)油滴結(jié)合，在激發(fā)光照射下發(fā)出綠色熒光。BODIPY在溶液或者固體中對(duì)光的穩(wěn)定性好，在光照條件下不易發(fā)生光解?；瘜W(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，水溶性差。

1.2 染料的光譜特性

尼羅紅作為原位標(biāo)記物在疏水環(huán)境中顯示出高的熒光量特性[4]。然而，尼羅紅的光譜特性對(duì)環(huán)境的極性高度敏感[5]，當(dāng)環(huán)境極性降低時(shí)發(fā)射峰值發(fā)生藍(lán)移[6]。尼羅紅的這一特征可能源于分子活躍偶極時(shí)的巨大改變。有研究表明，短激發(fā)波長(zhǎng)(450～500 nm)和金/黃色發(fā)射波長(zhǎng)(≤580 nm)適于檢測(cè)高疏水環(huán)境，如中性油脂(三酰甘油)；而長(zhǎng)激發(fā)波長(zhǎng)(515～560 nm)和紅色發(fā)射波長(zhǎng)(≥590 nm)適合檢測(cè)從細(xì)胞膜內(nèi)磷脂反應(yīng)來的極性油脂[4]。

與尼羅紅不同的是，BODIPY505/515對(duì)環(huán)境的極性不敏感[7]，它具有高的熒光量子產(chǎn)率，高的摩爾消光系數(shù)，良好的光穩(wěn)定性[8]。并且，研究已經(jīng)表明了這種染料對(duì)油脂滴具有很強(qiáng)的專一性[2]。當(dāng)被藍(lán)色激發(fā)光(450～490 nm)激發(fā)，BODIPY505/515具有在515～530 nm范圍內(nèi)變化的綠色發(fā)射峰值[7,9]。

1.3 染料滲入微藻

尼羅紅滲入微藻是染料從細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)到油脂滴的一系列過程。首先是染料進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)膜(1～2 s)的快速附著和分離，接著是從細(xì)胞質(zhì)膜到油脂滴轉(zhuǎn)運(yùn)的緩慢過程(30 s～2 min)。主要衰減因素是染料與胞漿細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組分的相互作用[10]。熒光染料和染定動(dòng)力學(xué)依賴于微藻種類和油滴的形狀及數(shù)量。相反，BODIPY505/515染料與油滴組合非?？欤?yàn)樗哂懈咚?油分離系數(shù)，從而更容易透過細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜[12]。續(xù)流方法可以在添加染料前后連續(xù)記錄數(shù)據(jù)，這種方法可以觀察到染料快速滲入到微藻如微擬球藻、鹽藻等細(xì)胞內(nèi)，檢測(cè)到最大熒光值時(shí)不到1 min[9]。

目前，尼羅紅在油脂滴中的位置并不清楚，Mukherjee[11]通過對(duì)尼羅紅熒光能量轉(zhuǎn)移和紅邊激發(fā)轉(zhuǎn)變等實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，指出尼羅紅最可能位于運(yùn)動(dòng)限制膜區(qū)域的水/油交界面處。不同的是，Pick等[10]研究認(rèn)為尼羅紅深嵌于油滴的脂質(zhì)核心。然而，BODIPY505/515作為一種新型熒光染料，可以特異性地作用于中性脂組成的油滴，使得油滴可以被檢測(cè)，但其具體作用機(jī)制仍不清楚，有待研究。

2 油脂染定中存在的問題

與傳統(tǒng)方法相比，熒光染料法的優(yōu)點(diǎn)是：不需要破壞細(xì)胞、所需樣品量少、快速靈敏。與尼羅紅相比，BODIPY505/515熒光染料法的優(yōu)點(diǎn)是放射光譜較窄，有利于共焦成像，并且它只對(duì)脂類和葉綠體染色而不對(duì)細(xì)胞質(zhì)染色[13]。但是，尼羅紅和BODIPY505/515熒光染料法在實(shí)際應(yīng)用中也存在許多不足之處。主要問題是：染料滲入細(xì)胞困難、葉綠素和背景熒光的干擾、熒光衰退、絕對(duì)定量不可行等。

1)一些微藻細(xì)胞壁太厚，這就阻止尼羅紅染料有效地滲入細(xì)胞染定油脂[10,13-15]。相反的，BODIPY505/515在滲透時(shí)可能更有效，最近研究[12]指出它能滲入所有細(xì)胞，即使細(xì)胞壁很厚。

2)尼羅紅并非專門結(jié)合油滴，發(fā)射熒光的轉(zhuǎn)變也可歸因于含疏水域(低密度蛋白質(zhì))的特定蛋白質(zhì)或其它含疏水域的非油細(xì)胞組分[4,7]，這一特征會(huì)影響染料的油脂測(cè)定量。另外，高色素內(nèi)含物濃度也可能影響油脂誘導(dǎo)的尼羅紅熒光量。例如，在綠藻中發(fā)現(xiàn)的高含量葉綠素(干重的1%～4%)會(huì)增加背景熒光量，從而阻礙尼羅紅可靠定量油脂[15]。

3)在用熒光染料測(cè)定微藻內(nèi)油脂含量的過程中，還存在熒光衰退(電子由激發(fā)態(tài)轉(zhuǎn)為穩(wěn)態(tài)時(shí)的非放射性衰退)的問題。其一，細(xì)胞和染料濃度的變化能影響油脂內(nèi)含物量的可靠估計(jì)，導(dǎo)致大程度熒光度的損失。這種衰退與多種過程有關(guān)，包括：激發(fā)態(tài)反應(yīng)、能量轉(zhuǎn)移、分子芳香環(huán)的二聚以及碰撞衰退[4]。其二，尼羅紅和BODIPY505/515熒光染料經(jīng)常在二甲基亞砜水溶液中備用，因?yàn)檫@是滲入細(xì)胞膜最有效的一種方法[12]。然而，有報(bào)道稱當(dāng)使用高濃度丙酮和二甲基亞砜時(shí)存在熒光減弱和大量細(xì)胞衰亡的問題[7]。Cirulis等[7]研究表示1 %～2 %的丙酮可保證細(xì)胞量增加和熒光信號(hào)的增強(qiáng)，然而，低濃度的二甲基亞砜還是會(huì)降低BODIPY505/515熒光強(qiáng)度及增加細(xì)胞衰亡量。

4)三酰甘油熒光染料技術(shù)的主要缺點(diǎn)是不能實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量。為解決這個(gè)問題，一些研究者建議使用三油精等同物(TO)作為油脂標(biāo)準(zhǔn)，借助三油精的標(biāo)準(zhǔn)曲線以絕對(duì)定量油脂[2]。另一種解決方法，是將不同量的標(biāo)準(zhǔn)物加入到微藻細(xì)胞中以測(cè)定油脂濃度。然而，標(biāo)準(zhǔn)物使用產(chǎn)生的問題是沒有一個(gè)穩(wěn)定的、可重復(fù)性好的解決方案，并且，這種方法僅適用于特定物種如硅藻和甲藻，并不適用于熒光燃料不易滲入的其它的厚壁微藻物種[16]。

3 尼羅紅和BODIPY在微藻油脂測(cè)定中的應(yīng)用

3.1 染料應(yīng)用領(lǐng)域

尼羅紅熒光染料是一種旨在通過與脂類物質(zhì)的結(jié)合繼而發(fā)出熒光檢測(cè)信號(hào)的脂溶性染料，可以快速、敏感地定量測(cè)定活體細(xì)胞內(nèi)脂類成分。根據(jù)不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)，尼羅紅染料可以染定不同的疏水分子。適用于各種細(xì)胞包括細(xì)菌細(xì)胞，也用于蛋白質(zhì)電泳染色。例如，尼羅紅能染定人血漿中的膽固醇[4]，可研究與SDS結(jié)合的蛋白質(zhì)的疏水性質(zhì)[17]，研究細(xì)胞膜的雙分子層結(jié)構(gòu)[18]和酶作用機(jī)制[19]。尼羅紅也成功用于染定細(xì)胞內(nèi)中性油脂，如檢測(cè)酵母菌[20]、真菌[21]中的三酰甘油和膽固醇酯。目前，尼羅紅更多地是用來染定微藻總脂和測(cè)定微藻中的中性油脂含量。

BODIPY染料已被應(yīng)用于現(xiàn)代生物、化學(xué)分析檢測(cè)和光電材料科學(xué)等領(lǐng)域。BODIPY染料對(duì)pH值和極性環(huán)境相對(duì)敏感，通過對(duì)其結(jié)構(gòu)做出簡(jiǎn)單修飾，將產(chǎn)生具有不同最大發(fā)射波長(zhǎng)和激發(fā)波長(zhǎng)的染料，可能很好地調(diào)整染料的熒光特征。因此，BODIPY熒光染料也用于標(biāo)記蛋白質(zhì)、DNA、脂肪酸、磷脂、膽固醇、膽甾醇和磷脂質(zhì)[2]。近年來，BODIPY505/515染料在染定微藻中的油脂微囊[8]方面的應(yīng)用越來越廣泛。

3.2 樣品處理

在使用熒光染料對(duì)微藻中的油脂滴檢測(cè)之前，通常要對(duì)微藻樣品進(jìn)行處理，以提高染料的通透性，盡量解決熒光染料在油脂染定中存在的問題。常用的方法有化學(xué)方法和物理方法。

3.2.1 化學(xué)方法

化學(xué)處理方法主要是有機(jī)溶劑處理法，例如二甲基亞砜、乙醇、丙酮、異丙醇及EDTA[22]等。其中，二甲基亞砜(Dimethysulfoxide，簡(jiǎn)稱DMSO)最為常用，因?yàn)樗芘c細(xì)胞膜發(fā)生交互作用，并且具有抗寒特性，這就有利于大分子、熒光油脂和接合的熒光染料滲入到活的細(xì)胞和組織中。例如，邴欣等[23]在測(cè)布朗葡萄藻油脂含量時(shí)，通過前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DMSO用量對(duì)油脂含量測(cè)定影響較大。DMSO用量過低會(huì)導(dǎo)致染色不完全，而過高時(shí)DMSO會(huì)與尼羅紅結(jié)合，增強(qiáng)尼羅紅自身熒光，綜上選擇DMSO最佳體積分?jǐn)?shù)為8 %。劉亞男等[24]在使用BODIPY505/515測(cè)定藻細(xì)胞中的油脂含量時(shí)，表明DMSO體積分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)扁藻的染色效果有所加強(qiáng)，隨著DMSO濃度的增加，熒光強(qiáng)度也相應(yīng)地增加，當(dāng)DMSO的量從0.1 %增加到2 %時(shí)，相應(yīng)的熒光強(qiáng)度從375增加到446，當(dāng)DMSO體積分?jǐn)?shù)增加到5%時(shí)，熒光強(qiáng)度更是增加到了474，比0.1%時(shí)增加了100。

3.2.2 物理方法

在油脂染料滲入不順時(shí)，也可以使用物理方法處理。常用方法有以下幾種：

1)把微藻細(xì)胞放入液氮中進(jìn)行機(jī)械碾磨，可以避免溶劑和去垢劑的使用，從而避免細(xì)胞破壞、油滴破壞和高背景熒光[10,25]。

2)微波輔助染定法，有利于提高藻類細(xì)胞和染料分子之間的碰撞和運(yùn)動(dòng)速度，并且有利于染料分子滲入細(xì)胞[14]。例如，Chen等[14]采用二甲基亞砜和微波光照處理相結(jié)合的方法，通過測(cè)試幾個(gè)微波持續(xù)期，發(fā)現(xiàn)使用微波輔助法測(cè)定出的富油藻類的油脂含量與重力分析法測(cè)定出的油脂含量一致。同時(shí)，Chen等[14]也指出由于微波爐(尤其是家用微波爐)的輻射分布不均勻，可能存在可靠性和可重復(fù)性差的問題，所以建議多次重復(fù)操作。

3)建立電場(chǎng)，可以提高并加速分子向微藻細(xì)胞內(nèi)部的轉(zhuǎn)運(yùn)。例如，Su等[26]在3個(gè)電場(chǎng)強(qiáng)度(0、500、1000和2000 V/cm)下用尼羅紅對(duì)小球藻和螺旋藻進(jìn)行了染定實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果顯示，加入電場(chǎng)10 s后尼羅紅出現(xiàn)高的熒光強(qiáng)度和低的不確定性。

4)利用微藻凍干技術(shù)可以去除環(huán)境對(duì)熒光染定的負(fù)面效應(yīng)。例如，Huang等[3]就以幾種小球藻的凍干藻粉為原料進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

3.3 染料在微藻油脂測(cè)定中的應(yīng)用

特定的條件下，用熒光染料法測(cè)定的油脂含量與傳統(tǒng)的重量分析法存在著緊密的聯(lián)系[27]，因此，目前熒光染料在微藻油脂含量測(cè)定中得到廣泛應(yīng)用。

現(xiàn)在國(guó)內(nèi)外已有很多研究者利用尼羅紅熒光染料法測(cè)定了微藻中的油脂含量，在激發(fā)波長(zhǎng)為488～525 nm和發(fā)射波長(zhǎng)為570～600 nm范圍內(nèi)，可用于染定微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂[6]。例如，張敬鍵等[28]采用尼羅紅熒光染料法測(cè)定斜生柵藻細(xì)胞中的油脂含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此法與傳統(tǒng)重量分析法測(cè)定的結(jié)果顯著相關(guān)(R2=0.9258)，最佳染色條件為：染色前微波處理40 s，二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)1%，尼羅紅最終質(zhì)量濃度1.5 μg/mL，染色時(shí)間5 min，染色溫度40℃。王海濤等[29]以湛江等鞭金藻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，優(yōu)化尼羅紅染色條件：二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)為2 %、尼羅紅質(zhì)量濃度為1.00 μg/mL、細(xì)胞密度為1.0×106個(gè)/mL，激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為580 nm，優(yōu)化時(shí)間為10 min。熒光強(qiáng)度與中性脂含量的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9468。 邴欣等[23]通過探索染色前處理和優(yōu)化染色條件，用尼羅紅熒光染料法對(duì)布朗葡萄藻內(nèi)油脂進(jìn)行了染色。染色操作為，超聲波處理3 min，離心10 min，DMSO體積分?jǐn)?shù)為8 %，D750 nm為0.16，40 ℃水浴10 min，激發(fā)波長(zhǎng)520 nm，在550～700 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)射光譜，油脂發(fā)射峰值在570～580 nm左右。Storms等[30]用尼羅紅染料簡(jiǎn)單而快速地測(cè)定了小球藻中性油脂的含量，在染色之前用乙醇，溫和的溶劑滲透細(xì)胞，并且使用96微孔板在熒光強(qiáng)度測(cè)定過程中增加樣本容量，結(jié)果熒光量與油脂含量有很高的相關(guān)性。Talebi等[31]用尼羅紅染料對(duì)杜氏鹽藻進(jìn)行染色，用DMSO處理，細(xì)胞在37℃光照下保存10 min，選擇激發(fā)波長(zhǎng)為486 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為570 nm。

目前，BODIPY505/515也廣泛應(yīng)用于微藻中油脂含量的測(cè)定。例如，劉亞男等[24]通過測(cè)定BODIPY505/515染色的不同種屬微藻的熒光強(qiáng)度，得出微藻油脂含量與熒光強(qiáng)度呈線性相關(guān)(R2=0.9764)，應(yīng)用該關(guān)系計(jì)算其油脂含量，與重量分析法測(cè)定的結(jié)果相比沒有顯著差異。結(jié)果表明：BODIPY505/515的最佳染色條件為二甲基亞砜(DMSO)體積分?jǐn)?shù)2%，BODIPY505/515最終質(zhì)量濃度0.25 μg/mL，染色時(shí)間30 min，染色溫度35℃。Xu等[32]在進(jìn)行亞心形扁藻油脂微囊測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)了BODIPY505/515和重力分析間的相互關(guān)系(R2=0.93)。Brennan等[9]使用了BODIPY 505/515熒光增強(qiáng)法測(cè)定杜氏鹽藻等微藻細(xì)胞內(nèi)的油脂含量，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微藻產(chǎn)油全過程的監(jiān)測(cè)，可以用來確定微藻油脂的最佳采收期。實(shí)驗(yàn)用兩溶劑(DMSO和甘油)進(jìn)行預(yù)處理，優(yōu)化4個(gè)染定參數(shù)(分析時(shí)間、染色溫度、染料濃度和藻細(xì)胞濃度)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)熒光量顯著提高約800倍。Kim等[33]研究了北極衣藻在低溫條件下的生長(zhǎng)和油脂含量變化，其中的一個(gè)步驟是通過BODIPY505/515染色和熒光顯微鏡實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)的可視化。Cabanelas等[34]檢測(cè)綠球藻細(xì)胞油脂時(shí)，采用最佳濃度為0.4 μg/mL的BODIPY505/515染料，0.1%的二甲基亞砜或0.35%的乙醇。

4 展望

面對(duì)世界能源危機(jī)、溫室氣體排放量持續(xù)增加的問題，急需尋找環(huán)境友好型的可再生能源。經(jīng)過研究和發(fā)展，微藻在油脂含量，培養(yǎng)選地等多方面有突出的優(yōu)勢(shì)，微藻生物燃料成為取代化石燃料的最主要的可持續(xù)發(fā)展再生能源[35]。

尼羅紅作為一個(gè)微藻油脂探針的研究已經(jīng)進(jìn)行多年，也開始了解其作用機(jī)制，然而BODIPY505/515是一種新分子，依然缺乏其詳細(xì)資料。這就需要完善理論研究，確定產(chǎn)油微藻油脂積累的規(guī)律和機(jī)制，在理論的指導(dǎo)下對(duì)熒光染料進(jìn)行優(yōu)化，考慮設(shè)計(jì)合成性能更優(yōu)越的BODIPY染料。

熒光染料法可以簡(jiǎn)便、直觀、快速地檢測(cè)微藻中油脂的相對(duì)含量，但很難進(jìn)行絕對(duì)定量。但是由于此方法方便快捷，因此常作為一種初級(jí)的產(chǎn)油微藻篩選方法。面對(duì)發(fā)現(xiàn)研究新能源的迫切要求，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確地檢測(cè)微藻細(xì)胞的油脂含量，高效篩選優(yōu)良產(chǎn)油藻株，已成為重中之重。使用熒光染料染定微藻細(xì)胞中油脂滴的優(yōu)點(diǎn)依然是有可能實(shí)現(xiàn)高通量定量分析。Holger等[36]已經(jīng)提出一個(gè)自動(dòng)化高通量絕對(duì)定量細(xì)胞內(nèi)油脂的方案。未來，這些染料有可能成為高級(jí)生物技術(shù)工具的應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，并參與提高生物油和種子油產(chǎn)量的預(yù)備步驟，但仍然需要發(fā)現(xiàn)其他的方法來改善微藻候選品的高通量檢測(cè)，以備各種應(yīng)用所需。

[1]WIJFFELS R H, BARBOSA M J. An outlook on microalgal biofuels[J]. Science, 2010, 329(5993): 796-799.

[2]RUMIN J, BONNEFOND H, SAINT-JEAN B, et al. The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae[J]. Biotechnology for Biofuels, 2015, 8:42

[3]HUANG G H, CHEN G, CHEN F. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence[J]. Biomass and Bioenergy, 2009, 33(10):1386-1392.

[4]GREENSPAN P, FOWLER S D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, Nile red[J]. Journal of Lipid Research, 1985, 26(7):781-789.

[5]GHONEIM N. Photophysics of Nile red in solution: steady state spectroscopy[J]. Spectrochimica Acta Part A Molecular & Biomolecular Spectroscopy, 2000, 56(5):1003-1010.

[6]COOKSEY K E, GUCKERT J B, WILLIAMS S A, et al. Fluorometric determination of the neutral lipid content of microalgal cells using Nile red[J]. Journal of Microbiological Methods, 1987, 6(6):333-345.

[7]CIRULIS J T, STRASSER B C, SCOTT J A, et al. Optimization of staining conditions for microalgae with three lipophilic dyes to reduce precipitation and fluorescence variability[J]. Cytometry A, 2012, 81(7):618-626.

[8]GOVENDER T, RAMANNA L, RAWAT I, et al. BODIPY staining, an alternative to the Nile Red fluorescence method for the evaluation of intracellular lipids in microalgae[J]. Bioresource Technology, 2012, 114(2):507-511.

[9]BRENNAN L, BLANCO FERN NDEZ A, MOSTAERT A S, et al. Enhancement of BODIPY505/515 lipid fluorescence method for applications in biofuel directed microalgae production[J]. Journal of Microbiological Methods, 2012, 90(2):137-143.

[10]PICK U, RACHUTIN-ZALOGIN T. Kinetic anomalies in the interactions of Nile red with microalgae[J]. Journal of Microbiological Methods, 2012, 88(2):189-196.

[11]MUKHERJEE S, RAGHURAMAN H, CHATTOPADHYAY A. Membrane localization and dynamics of Nile Red: effect of cholesterol[J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2007, 1768(1):59-66.

[12]COOPER M S, HARDIN W R, PETERSEN T W, et al. Visualizing "green oil"in live algal cells[J]. Journal of Bioscience & Bioengineering, 2010, 109(2):198-201.

[13]MUTANDA T, RAMESH D, KARTHIKEYAN S, et al. Bioprospecting for hyper-lipid producing microalgal strains for sustainable biofuel production[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(1):57-70.

[14]CHEN W, SOMMERFELD M, HU Q. Microwave-assisted Nile red method forinvivoquantification of neutral lipids in microalgae[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(1):135-141.

[15]CHEN W, ZHANG C, SONG L, et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 77(1):41-47.

[16]BERTOZZINI E, GALLUZZI L, PENNA A, et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red[J]. Journal of Microbiolical Methods, 2011, 87(1):17-23.

[17]DABAN J R. Fluorescent labeling of proteins with Nile red and 2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone: Physicochemical basis and application to the rapid staining of sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels and Western blots[J]. Electrophoresis, 2001, 22(5): 874-880.

[18]SINGH G, CHAMBERLIN A C, ZHEKOVA H R, et al. Two-dimensional potentials of mean force of Nile Red in intact and damaged model bilayers. Application to calculations of fluorescence spectra [J]. Journal of Chemical Theory & Computation, 2016, 12(1):7-28.

[19]BISHT M, KUMAR A, VENKATESU P. Analysis of the driving force that rule the stability of lysozyme in alkylammonium-based ionic liquids[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 81:1074-1081.

[20]SHI S, JI H, SIEWERS V, et al. Improved production of fatty acids bySaccharomycescerevisiaethrough screening a cDNA library from the oleaginous yeastYarrowialipolytica[J]. Fems Yeast Research, 2016,16(1)：fov108.

[21]蔣曉艷, 王婉玉, 鐘 敏, 等. 裂殖壺菌胞內(nèi)油脂尼羅紅熒光染色快速檢測(cè)方法的研究[J]. 中國(guó)油脂, 2016, 41(1):51-55.

[22]WONG D M, NGUYEN T T N, FRANZ A K. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) enhances intracellular lipid staining with Nile red in microalgaeTetraselmissuecica[J]. Algal Research, 2014, 5:158-163.

[23]邴 欣，宋 琪，劉 雙，等. 尼羅紅-熒光光譜法測(cè)定布朗葡萄藻油脂含量的方法研究[J]. 中國(guó)油脂, 2015, 40(2):85-89.

[24]劉亞男，姚長(zhǎng)洪，周建男，等. 使用BODIPY熒光染料快速測(cè)定微藻油脂含量方法[J]. 生物加工過程, 2013, 11(6):68-72.

[25]周文俊，鄭 立，韓笑天，等. 基于尼羅紅染色分析金藻總脂動(dòng)態(tài)積累[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2014, 38(2):312-319.

[26]SU L C, HSU Y H, WANG H Y. Enhanced labeling of microalgae cellular lipids by application of an electric field generated by alternating current[J]. Bioresource Technology, 2012, 111:323-327.

[27]BALDUYCK L, VERYSER C, GOIRIS K, et al. Optimization of a Nile Red method for rapid lipid determination in autotrophic, marine microalgae is species dependent[J]. Journal of Microbiological Methods, 2015, 118:152-158.

[28]張敬鍵，呂雪娟，李愛芬，等. 微藻細(xì)胞油脂含量的快速檢測(cè)方法[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2012, 32(1):64-72.

[29]王海濤，劉亞男，曹旭鵬，等. 尼羅紅熒光法快速檢測(cè)培養(yǎng)過成中湛江等鞭金藻的中性脂[J]. 生物加工過程, 2014, 12(6):78-83.

[30]STORMS Z J, CAMERON E, DE LA HOZ SIEGLER H, et al. A simple and rapid protocol for measuring neutral lipids in algal cells using fluorescence[J]. Journal of Visualized Experiments, 2014(87):e51441.

[31]TALEBI A F, TOHIDFAR M, DERAZMAHALLEH S M M, et al. Biochemical modulation of lipid pathway in microalgaeDunaliellasp. for biodiesel production[J]. Biomed Res Int, 2015:597198.

[32]XU D, GAO Z, LI F, et al. Detection and quantitation of lipid in the microalgaTetraselmissubcordiformis(Wille) Butcher with BODIPY505/515 staining[J]. Bioresource Technology, 2013, 127:386-390.

[33]KIM E J, JUNG W, LIM S, et al. Growth and lipid content at low temperature of Arctic algaChlamydomonassp. KNM0029C[J]. Bioprocess & Biosystems Engineering, 2015, 39(1):151-157.

[34]CABANELAS I T, VAN DER ZWART M, KLEINEGRIS D M, et al. Rapid method to screen and sort lipid accumulating microalgae[J]. Bioresource Technology, 2015, 184:47-52.

[35]MEDIPALLY S R, YUSOFF F M, BANERJEE S, et al. Microalgae as sustainable renewable energy feedstock for biofuel production[J]. Biomed Research International, 2015:519513.

[36]MORSCHETT H, WIECHERT W, OLDIGES M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production[J]. Microbial Cell Factories, 2015, 15:34.

The use of fluorescent Nile red and BODIPY for lipid measurement in microalgae

HAO Cui-cui, LIANG Cheng-wei, SHI Lei

(College of Chemical Engineering, Qingdao University of Science and Technology, Qingdao 266042, China)

In the face of energy crisis, using microalgae to produce biofuel and high value-added products has attracted great attention. Microalgae constitute a diverse group of microorganisms with advantages like fast and efficient growth. In addition, they do not compete for arable land and offer very high lipid yield potential. Microalgae are currently considered as the most promising alternative sources for the next generation of food, feed, cosmetics and renewable energy in the form of biofuel. Major challenges for the development of this resource are to select lipid-rich strains using high-throughput staining for neutral lipid content in microalgae species. Compared with traditional quality method, the fluorescent staining method is simpler, cheaper and easier to operate. In this article, the properties of fluorescent Nile red and BODIPY and the use of fluorescent for lipid measurement in microalgae were summarized.

Nile red; BODIPY; microalgae; lipid-staining

2016-04-15；

2016-05-03

國(guó)家自然科學(xué)基金(31000135)

郝翠翠，碩士，研究方向?yàn)橹参锘蚬こ?，E-mail：291538667@qq.com

梁成偉，副教授，研究方向?yàn)樵孱惿飳W(xué)，E-mail：liangchw117@126.com

Q949.93

A

2095-1736(2017)01-0070-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.01.070