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      細胞檢測技術(shù)的研究進展

      2017-04-10 22:54:50高小麗
      山東化工 2017年10期
      關(guān)鍵詞:電子顯微鏡顯微鏡熒光

      高小麗

      (重慶化工職業(yè)學院,重慶 401228)

      細胞檢測技術(shù)的研究進展

      高小麗

      (重慶化工職業(yè)學院,重慶 401228)

      隨著細胞生物學的發(fā)展,細胞的檢測技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn),本文對目前常見細胞檢測技術(shù)和方法的原理、特點及應用作一個較全面的綜述。

      細胞;檢測技術(shù);應用

      細胞的研究已成為生命科學研究的核心內(nèi)容,因此,與此相應的細胞檢測技術(shù)也越來越受到人們重視,本文將對目前常見的幾種細胞檢測技術(shù)和方法做一概述。

      1 顯微鏡技術(shù)

      20世紀六十年代以來,顯微技術(shù)逐漸成為了研究細胞一個主要工具,它實現(xiàn)了從亞顯微層次甚至分子層次去研究細胞的聚集、排斥以及黏附行為,細胞的連接阻斷,細胞的免疫識別,細胞的融合以及細胞與其他物質(zhì)(如酶作用物、藥物、化合物、小分子等)的相互作用等等。接下來,本文將重點介紹幾種熒光和電子顯微鏡技術(shù)及一些化學、物理細胞檢測技術(shù)。

      1.1 熒光顯微檢測技術(shù)

      熒光顯微技術(shù)是利用紫外線照射物質(zhì),使之發(fā)出熒光,然后再在顯微鏡下觀察物體形狀或位置的一種方法,它既可以檢測細胞中某些本身可以發(fā)熒光的物質(zhì),也可以檢測本身不能發(fā)熒光但用熒光染料或熒光抗體染色后,可以發(fā)熒光的物質(zhì)。如李勤[1]等人利用熒光顯微鏡對As2O3誘導MGC-803細胞核凋亡過程中的鈣振蕩進行研究。

      后來,熒光蛋白新型標記物的出現(xiàn)了,熒光顯微鏡得到了長足的發(fā)展,一系列新型的熒光顯微檢測技術(shù)應運而生,如熒光斑點顯微鏡(FSM) ,熒光壽命成像顯微鏡(FLIM)以及基于熒光壽命測量的熒光共振能量轉(zhuǎn)移顯微鏡(FRETM)和全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRFM)等,這些技術(shù)廣泛應用于轉(zhuǎn)基因動物的研究、蛋白在活細胞內(nèi)功能定位及遷移變化、基因治療、融合標記,病原菌侵入活細胞的分子過程,單分子檢測(如細胞內(nèi)受體),胞外分泌或細胞內(nèi)吞作用的成像,細胞與基層的相互作用的形貌,進行蛋白質(zhì)動力學研究,膜離子通道研究以及相關(guān)膜的光敏劑研究,為實現(xiàn)在分子水平上進行細胞研究作出了巨大的貢獻。

      熒光顯微檢測技術(shù)作為生物物理、生物化學及臨床醫(yī)學研究的重要工具已有很大的進展,在與先進方法融合后,減少了背景熒光,增加了信號分辨率,解決了由于非均勻熒光標記所造成的不能進行的熒光結(jié)構(gòu)的動態(tài)監(jiān)測的難題,但仍然由于紫外線光源殺傷力問題,在對極微弱熒光的使用時間方面受到限制。

      1.2 激光共聚焦掃描顯微鏡

      激光共聚焦掃描顯微鏡[2](LCSM)是在熒光顯微鏡成象的基礎(chǔ)上,利用激光掃描和共聚焦光路獲得樣品的顯微圖像,可對活細胞結(jié)構(gòu)、分子、離子進行動態(tài)監(jiān)測。目前,激光共聚焦掃描顯微鏡已在形態(tài)學、分子細胞生物學、遺傳學、環(huán)境科學、生物化學、植物學、食品學、病理學領(lǐng)域得到廣泛應用,可對細胞內(nèi)鈣離子和pH值進行動態(tài)分析,可進行細胞間通訊研究和長時程觀察細胞的遷移和生長,可進行組織和細胞的定量熒光和物理化學測定等[3-5]。

      激光掃描共聚焦顯微鏡是一項全新的實驗手段和強有力的研究工具,較傳統(tǒng)顯微鏡,有著不可比擬的優(yōu)勢,如圖像高反差、高清晰度、定位準確,具有三維空間分辨能力,能夠同時獲得多重熒光和光鏡圖像,定量測定熒光信號的強度、面積、距離等指標。近年出現(xiàn)的視頻型共聚焦激光顯微鏡、4Pi共聚焦激光顯微鏡以及多光子共聚焦激光顯微鏡[6],它們與傳統(tǒng)LCSM比較,更能解決生物組織中深層物質(zhì)的層析成像問題,能進一步減少熒光背景的干擾,可以對活細胞進行更長時間的觀察。激光共聚焦顯微鏡已經(jīng)成為亞細胞層次研究細胞相互作用的強有力研究工具之一。

      1.3 電子顯微技術(shù)

      電子顯微鏡是人類迄今為止進行細胞亞微結(jié)構(gòu)觀察中最用力的工具。在光學顯微鏡下無法看清小于0.2nm的顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu),電子顯微鏡能看清這些結(jié)構(gòu)。它是用高速電子束代替了照明光線,當電子束照射樣品時,由于樣品不同部位對入射電子具有不同散射度,而形成不同的電子密度的高度放大圖像,最后顯示在熒光屏上或記錄在照相感光膠片上,經(jīng)過不斷的改進,目前電子顯微鏡的分辨率最高可達0.08 nm,實現(xiàn)了原子尺度上觀察物質(zhì)結(jié)構(gòu)的理想。

      目前透射電子顯微鏡(TEM)和掃描電子顯微鏡(SEM)[7]以及80年代以后出現(xiàn)的掃面透射電子顯微鏡在生物學領(lǐng)域通常是被用于研究細胞內(nèi)部的細微、超細微結(jié)構(gòu),提供立體的、原子級、分子級、單細胞級分辨率的圖像和表面拓撲信息,以及形態(tài)分析、毒理分析、藥物作用靶點分析和細胞微結(jié)構(gòu)分析等重要的有用信息[8]。蔣爭凡等人[9]在透射電子顯微鏡和掃描電子顯微鏡下觀察到經(jīng)細胞色素C誘導的小鼠肝細胞細胞核的凋亡形態(tài)-染色質(zhì)的凝集及趨邊化。

      電子顯微鏡的分辨率雖然比起光學顯微鏡有了顯著的提高,但電子顯微鏡必須在真空的條件下進行觀察,對生物大分子還須進行梯度脫水、染色、臨界點干燥、噴涂導體物質(zhì)等前處理工作,故無法實現(xiàn)在接近天然條件和生理條件下實時地、原位地、現(xiàn)場地研究生物樣品的單原子、單分子和單細胞成像。

      1.4 掃描探針顯微鏡技術(shù)

      掃描探針顯微技術(shù)[10]是用來探索表面性質(zhì)的儀器家族,其測量的特征尺寸可以從原子間距到100μm之間變化,至1986以后,相繼出現(xiàn)了很多新型掃描探針顯微鏡,主要有原子力顯微鏡(/AFM) 光子掃描隧道顯微鏡(STP),掃描離子電導顯微鏡(STCM)等,以原子力顯微鏡(AFM)為代表的SFM,它的工作原理是利用一個對力非常敏感的微量臂和探針,與樣品表面接觸,產(chǎn)生極其微弱的作用力,使微量臂變形,通過捕捉這個形變信號,來而獲得物質(zhì)的表面形貌結(jié)構(gòu)信息的一種方法。AFM因其納米級的空間分辨率、超高靈敏度和免標記以及可在溶液下工作等獨特優(yōu)勢, AFM成為細胞生物學的重要研究手段,過去的數(shù)十年中,研究人員利用AFM在細胞超微形貌成像和機械特性測量方面開展了廣泛的應用研究,可以對活體細胞、細菌、細胞中肌動蛋白的動態(tài)過程,細胞膜的精細結(jié)構(gòu)等進行觀察研究[11]。

      2 常用的生物學方法

      2.1 MTT法

      MTT-四甲基偶氮唑鹽比色法,是90年代發(fā)展起來的一種測定細胞相對活力和細胞相對數(shù)的生物學方法,其原理是細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶可以使外援性的MTT還原為難溶性FTT甲,一種藍紫色結(jié)晶物,并沉積在細胞中,而死亡的細胞無此功能,經(jīng)酶標儀或分光光度計以570 nm比色,測定各孔的吸光度值A(chǔ),它在一定程度上反映了細胞的生存能力,并可以檢測出OD值與細胞增值數(shù)目呈直線關(guān)系。這種方法重復性好,簡單易行,已被研究者們作為一種輔助方法廣泛地應用于細胞、藥物、大分子甚至物理輻射等物質(zhì)與細胞相互作用后的細胞存活率和細胞增值情況。但如要進行驗證或深入研究還需要輔助其他的方法。

      2.2 流式細胞技術(shù)

      流式細胞技術(shù)(FCM)[12]是當代最先進的細胞定量分析技術(shù),在液流中,處理過的細胞逐個通過聚集的光源,進而快速測量這些細胞的光散射、熒光和光吸收等信號而達到測定細胞的化學性質(zhì)、物理性質(zhì)和生物學特性的目的。它可以高速分析上萬個細胞,并能同時從一個細胞中測得多個參數(shù),與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比,具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點,在醫(yī)學和生物學領(lǐng)域有著廣泛應用。陳陽等人[13]以羅丹明123作為熒光指示劑,利用耐藥HR-20活細胞篩選逆轉(zhuǎn)耐藥性的藥物, 建立了一種精確度較高、穩(wěn)定性較好、有效的高通量藥物篩選方法。

      3 其他方法

      3.1 毛細管電泳法

      毛細管電泳(CE)是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力的新型液相分離檢測技術(shù),因其樣品用量少、分析速度快的特點,廣泛應用于單細胞內(nèi)多種組分的分離和測定。Ewing,Jorgenson 和Sweedler 研究組開創(chuàng)性地將毛細管電泳用于非哺乳動物神經(jīng)細胞分析。Frederic 等用CE-LIF測量鼠腦中兒茶酚胺和氨基酸的含量。

      3.2 細胞傳感器法

      細胞傳感器技術(shù)[32]利用活細胞作為研究對象,使之與電極或其他信號元件結(jié)合,定性定量地檢測細胞的基本功能信息。它可以監(jiān)測單個活細胞的生理功能,也可以通過捕捉細胞代謝產(chǎn)生的電子轉(zhuǎn)化成電信號來確定細胞濃度大小,如在芯片上通過培養(yǎng)吸收了已知cDNA,利用生物芯片探針雜交檢測原理,便可檢測激動劑或抑制劑對細胞內(nèi)部的基因表達的影響。

      4 展望

      目前,可用于細胞以及細胞相互作用分析高靈敏分析檢測方法已有許多,應用領(lǐng)域不斷擴大。但是實時、在線、原位、活體分析細胞技術(shù)還有待進一步發(fā)展和研究,實現(xiàn)細胞的分析要建立在未受任何外界條件影響的情況下的真實有效的分析。此外,結(jié)合多個學科,研制新型分析儀器,發(fā)展各種檢測技術(shù)的聯(lián)用,實現(xiàn)在分子水平上研究細胞內(nèi)的各種化學反應如蛋白-蛋白、核酸-核酸反應等,讓人類從細胞水平、分子水平上研究生命活動的本質(zhì),從而為生命科學提供更好和更多的有用信息。

      [1] 李 勤,馬 瑜,俞 信,等.數(shù)字化高靈敏度熒光顯微鏡在As2O3誘導MGC-803細胞核凋亡產(chǎn)生鈣振蕩研究中的應用[J].生命科學儀器,2004,2(3):18-21.

      [2] EGGER M D. The development of confocal microscopy[J].TINS,1989, l2: 11.

      [3] 李 葉,黃華平,林培群.激光掃描共聚焦顯微鏡[J].實驗室研究與探索,2015,34(7):262-265.

      [4] 楊子賢,王洪星,易小平.激光掃描共聚焦顯微鏡在生物科學研究中的應用[J].熱帶生物學報,2013,4(1):99-104.

      [5] 郭喆霏,成曉嵐,羅宇燕,等.激光共聚焦顯微鏡分析載蛋白微球的結(jié)構(gòu)及藥物分布[J].中國醫(yī)院藥學雜志,2015,35(15):1381-1384.

      [6] 許險峰,徐錫金,霍 霞.共聚焦激光掃描顯微鏡技術(shù)[J].激光生物學報,2003,12(2):156-160.

      [7] Li Maohua,Yang Yanqing,Bin Huang. State Key Laboratory of Solidification Processing, Northwestern Polytechnical University;Beijing Institute of Aeronautical Materials[J].Transactions of Nonferrous Metals Society of China,2014(10):45-48.

      [8] 楊志遠,楊水金. 掃描電子顯微鏡在無機材料表征中的應用[J].湖北師范學院學報:自然科學版,2015,35(4):56-63.

      [9] 蔣爭凡,卞 婕,翟中和.非細胞體系誘導小鼠肝細胞核凋亡的超微觀察[J].電子顯微學報,1998(4):22-27.

      [10] 趙清亮,王景賀,李 旦,等.掃描探針顯微鏡的最新技術(shù)進展及應用[J].傳感技術(shù)學報,1999,12(4):321-326.

      [11] 梁 艷,李 晨, Mariska,等. 單個腺病毒顆粒的原子力顯微鏡液相成像及樣品制備方法[J].病毒學報,2015,31(6):601-606.

      [12] 周 麗,周振英. 流式細胞儀研制的技術(shù)進展[J].現(xiàn)代醫(yī)學儀器與應用.2003,15(1):11-17.

      [13] 陳 陽,徐 榕, 司書毅 ,等. 流式細胞儀高通量藥物篩選技術(shù)的建立和應用[J].齊魯藥事,2011,30(1):1-2.

      (本文文獻格式:高小麗.細胞檢測技術(shù)的研究進展[J].山東化工,2017,46(10):87-88,91.)

      The Research Progress of Cell Detection Technology

      GaoXiaoli

      (Chongqing Chemical Industry Vocational College,400020,China)

      With the development of cell Biology, it appears that more and more techniques and methods are applied to studying cells. The main principles, characteristics and application of these techniques and methods are roundly reviewed in this paper.

      cell;techniques and methods;application

      2017-03-31

      高小麗(1979—),女,四川樂山人,講師,碩士,從事生物傳感器研究。

      Q939.4

      A

      1008-021X(2017)10-0087-02

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