袁向華,周艷玲,宋清姿,脫紅梅,馬沁沁,王一丁

四川師范大學生命科學學院, 成都 610101

蚯蚓吞食過程中土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性的變化特征

袁向華,周艷玲,宋清姿,脫紅梅,馬沁沁,王一丁*

四川師范大學生命科學學院, 成都 610101

為探明土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性在蚯蚓吞食過程中的變化特征,將蚯蚓生活土壤、腸道內(nèi)容物和蚓糞視作蚯蚓吞食前、中、后階段的3種特殊生境土壤,采用純培養(yǎng)法分離純化3階段中的放線菌；克隆文庫法分析3階段中的放線菌多樣性；國標法測定吞食前、中、后土壤的基本理化性質(zhì)；并利用主成分分析與相關性分析法分析土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性的相關性。結(jié)果顯示：從生活土壤、腸道內(nèi)容物和蚓糞中分別獲得27株、15株和17株放線菌,形態(tài)、培養(yǎng)特征及16S rDNA序列鑒定生活土壤放線菌分為鏈霉菌屬、擬諾卡氏菌屬、束絲放線菌屬,腸道內(nèi)容物和蚓糞放線菌均屬鏈霉菌屬；放線菌多樣性從生活土壤、蚓糞、腸道內(nèi)容物依次遞減。生活土壤文庫含40個OTUs,分為11科,未知菌占24%,類諾卡氏菌科是優(yōu)勢菌群；腸道內(nèi)容物文庫含20個OTUs,分為6科,未知菌占3.3%,微桿菌科是優(yōu)勢菌群；蚓糞文庫含30個OTUs,分為6科,未知菌占11.7%,鏈霉菌科是優(yōu)勢菌群。3種土壤全磷含量無顯著差異,生活土壤其余理化含量均最低,腸道內(nèi)容物速效氮含量最高,蚓糞的有機質(zhì)、全氮、鉀及有效磷、鉀含量最高。主成分分析和相關性分析顯示：蚯蚓吞食過程中,土壤有效磷、全氮、全鉀、速效鉀和有機質(zhì)含量對放線菌多樣性影響較大,其中全氮、有效磷與放線菌多樣性顯著負相關,相關系數(shù)分別為-0.998、-1,從而為明確蚯蚓、土壤與放線菌的相互關系提供了理論依據(jù)。

放線菌；多樣性；蚯蚓；土壤理化性質(zhì)；純培養(yǎng)；16S rDNA克隆文庫；主成分分析；相關性

隨著環(huán)境破壞的加劇,人們對土壤生態(tài)環(huán)境的保護意識日益增強,探究土壤與生物間的相互關系顯得尤為重要。蚯蚓是土壤中的主要動物類群,通過吞食作用破碎土壤,并利用腸道內(nèi)的活性酶降解土壤有機物,使土壤肥效增加[1- 2]。放線菌作為微生物活性物質(zhì)的主要生產(chǎn)者[3],為宿主提供活性物質(zhì),在蚯蚓吞食土壤過程中主要負責腐殖酸的形成[4],對土壤肥力及質(zhì)量的改善至關重要。

蚯蚓對土壤肥力的改良主要通過吞食作用完成,含有大量微生物的土壤經(jīng)蚯蚓的吞食作用進入腸道,再以蚓糞形式排出,可將腸道內(nèi)容物、蚓糞視作特殊生境下的土壤[5]。土壤理化性質(zhì)是表征土壤肥力質(zhì)量的重要指標[6],有報道指出蚯蚓吞食過程中土壤理化性質(zhì)及土壤放線菌數(shù)量均發(fā)生改變[7- 9],但放線菌多樣性變化特征及兩者之間的相關性未見報道。探明蚯蚓吞食過程中土壤放線菌多樣性與土壤理化性質(zhì)的變化特征及相關性,可揭示該過程中放線菌多樣性變化與土壤理化性質(zhì)的動態(tài)關系,為土壤的生物修復提供理論依據(jù)。本研究將蚯蚓生活土壤、腸道內(nèi)容物及蚓糞視作蚯蚓吞食作用的前、中、后階段,分離純化3個階段中的放線菌,采用克隆文庫法分析3個階段中放線菌的多樣性,并探究土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性的變化特征,為闡明蚯蚓、土壤理化性質(zhì)、放線菌多樣性的相關性提供理論依據(jù),對環(huán)境保護、土壤生態(tài)維護具有重要應用價值。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及處理

研究樣地位于四川省成都市青白江區(qū)大同鎮(zhèn)某耕地(30°41′33"N,104°13′37"E),屬亞熱帶季風性濕潤氣候,土壤類型為水稻土類,采取水旱輪作方式,種植作物為水稻、油菜、萵筍等。

采用S形布點法[10]于0—20 cm采集耕層土壤,視該土壤為蚯蚓生活土壤,并收集蚯蚓,經(jīng)鑒定,該種蚯蚓為白頸環(huán)毛蚓(Pheretimacalifornica)。將土壤混勻并分為3部分,分別用于測定土壤理化性質(zhì)、提取土壤總DNA和收集新鮮蚓糞,新鮮蚓糞收集方法參考Haynes等[11]的方法。所有樣品收集后迅速帶回實驗室進行實驗。

除凈蚯蚓體表泥土后,75%乙醇體表滅菌、無菌水漂洗3次,解剖獲得腸道內(nèi)容物后混勻。

1.2 基本理化性質(zhì)測定

除去蚯蚓生活土壤、腸道內(nèi)容物及蚓糞中的雜物,自然風干后碾磨過直徑2 mm和0.15 mm篩,按國標法測定樣品的基本理化性質(zhì)[10],每個指標3個重復,SPSS 18.0對基本理化性質(zhì)進行顯著性檢驗。

1.3 可培養(yǎng)放線菌的分離、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.3.1 可培養(yǎng)放線菌的分離、鑒定

制備3種樣品的水溶液,40℃、140 r/min震蕩30 min,每個樣品3個平行,參照史學群的優(yōu)化方法分離、純化放線菌[12],按阮繼生的方法鑒定、合并相同菌株[13]。

1.3.2 可培養(yǎng)放線菌16S rDNA序列測定

酶法提取菌體總DNA,以細菌16S rRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1540R(5′-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′)[14]進行16S rDNA PCR擴增,擴增體系：12.5 μL 2×PCR Mix；引物各1 μL；DNA 0.5 μL；雙蒸水10 μL,反應程序：94℃預變性30 s,94℃變性10 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,30個循環(huán),72℃延伸10 min[15]。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后送上海生物工程技術公司測序。

1.3.3 可培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過BLAST程序選取與所得16S rDNA序列相近的模式菌株基因序列,用MEGA 5.0根據(jù)N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,自舉值為1000[16],Acidimicrobiumferrooxidans(U75647.1)作外群。

1.4 放線菌16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建

1.4.1 放線菌16S rDNA的擴增、純化

SoilGen DNA Kit提取總DNA并作為模板,放線菌16S rRNA基因特異性引物F243(5′-GGATGAGCCCGCGGCCTA-3′)；R513(5′-CGGCCGCGGCTGCTGGCACGTA-3′)[17]擴增3種樣品的放線菌16S rDNA,PCR體系及程序參照韓俊的方法[18],產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后再純化。

1.4.2 放線菌16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建及陽性克隆篩選

16S rDNA連至pMD19-T載體上(TaKaRa),連接體系：pMD19-T Vector 1.0 μL, SolutionⅠ5.0 μL,Template 4.0 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α,藍白斑篩選后[19]隨機挑取陽性克隆送成都擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.5 免培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

在線去除16S rDNA中的載體序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/vecscreen/)、嵌合體(Chimeria)[20](http://comp-bio.anu.edu.au/bellerophon/bellerophon.pl),Clustal-X比對序列(multiple alignment)[21],BioEdit 7.0分析比對結(jié)果的相似性[22],將相似性≥97.0%的序列劃為同一操作分類單元(Operational taxonomic unit,OTU)[23],剔除非放線菌OTU,從每個OTU中選一條序列按上文方法構(gòu)建進化樹。

1.6 放線菌多樣性分析、多樣性與理化性質(zhì)的相關性分析

采用SPADE(Species prediction and diversity estimation)(http://chao.stat.nthu.edu.tw/softwareCE.html.)通過Estimated sample coverage、Species richness 、Shannon Index、Simpson Index指數(shù)評估文庫中放線菌的多樣性,用Analytic Rarefaction version(http://strata.uga.edu/software/index.html)繪制稀釋性曲線[24],Office Excel 2003統(tǒng)計并處理數(shù)據(jù),SPSS 18.0進行理化性質(zhì)主成分分析及理化性質(zhì)與放線菌多樣性的相關性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本理化性質(zhì)的分析

由表1可知,3種樣品的pH均接近中性,腸道內(nèi)容物pH略低；腸道內(nèi)容物和蚓糞中的全氮、鉀和速效鉀含量相差不明顯,但均顯著高于蚯蚓生活土壤,腸道內(nèi)容物和蚓糞中的速效鉀含量尤為偏高,分別為0.52 g/kg和0.53 g/kg,是生活土壤的1.4倍；有機質(zhì)和速效磷含量在生活土壤、腸道內(nèi)容物和蚓糞中依次遞增,其中腸道內(nèi)容物和蚓糞中的速效磷含量分別是生活土壤的3.6和1.7倍；3種樣品的全磷含量無明顯差異；速效氮含量在腸道內(nèi)容物、蚓糞和生活土壤中依次遞減。

表1 3種樣品的基本理化性質(zhì)

數(shù)據(jù)為平均值±標準差(n=3).同列數(shù)據(jù)后標注的不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2 可培養(yǎng)放線菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

圖1 生活土壤中可培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The phylogenetic tree of culturable actinobacteria from living soil

可培養(yǎng)放線菌16S rDNA系統(tǒng)進化樹顯示,蚯蚓生活土壤中的27株放線菌(圖1),分布于3個屬：鏈霉菌屬Streptomyces(25株),擬諾卡氏菌屬Nocardiopsis(1株),束絲放線菌屬Actinosynnema(1株)。從腸道內(nèi)容物和蚓糞分別獲得15株和17株放線菌(圖2, 圖3),均為鏈霉菌Streptomyces。其中T23、T26、T28是生活土壤和蚓糞的共有菌株,S4、S5、S10是生活土壤和腸道內(nèi)容物的共有菌株,F5、F25是腸道內(nèi)容物與蚓糞的共有菌株。綜上可知,蚯蚓吞食作用使可培養(yǎng)放線菌的種類及數(shù)量降低；鏈霉菌在蚯蚓吞食土壤的3個階段中均是優(yōu)勢菌；鏈霉菌是土壤中分布最廣、數(shù)量最多的放線菌[25]。

2.3 克隆文庫的構(gòu)建

放線菌16S rRNA基因特異性引物擴增片段約為270bp,與預計片段大小一致,經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、檢驗后,用平板保存。

圖2 腸道內(nèi)容物中可培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 The phylogenetic tree of culturable actinobacteria from intestinal soil

2.4 文庫中操作分類單元分析

281條陽性克隆序列經(jīng)檢驗未發(fā)現(xiàn)嵌合體(Chimeria),蚯蚓生活土壤、腸道內(nèi)容物、蚓糞克隆文庫中分別含有40、20、30個OTUs(表2)。

2.5 文庫中放線菌多樣性分析

放線菌多樣性分析結(jié)果如表2：蚯蚓生活土壤、腸道內(nèi)容物、蚓糞克隆文庫的覆蓋率(C)分別為20.0%、80.3%和66.7%；物種豐富度(Species richness)分別為256.0、44.0和44.5；Shannon指數(shù)(Shannon Index)分別為5.279、2.658和3.789；Simpson指數(shù)(Simpson Index)分別為0.02815、0.18785和0.05037。

表2 3種樣品中放線菌16S rDNA文庫克隆數(shù)和多樣性指數(shù)

腸道內(nèi)容物克隆文庫覆蓋率最高,該文庫涵蓋腸道內(nèi)容物中80.3%的放線菌,生活土壤和蚓糞克隆文庫包含相應環(huán)境中20.0%和66.7%的放線菌。物種豐度是評估環(huán)境中放線菌種類數(shù)的一個重要指標,對比豐富度指數(shù)可知,生活土壤中放線菌種類最多,幾乎是腸道內(nèi)容物和蚓糞中放線菌種類的5.8倍。香農(nóng)指數(shù)越大說明放線菌的多樣性越高,物種豐度和香農(nóng)指數(shù)的一致性共同表明,生活土壤放線菌的多樣性最高,蚓糞放線菌的多樣性居中,腸道內(nèi)容物放線菌的多樣性最低。辛普森指數(shù)越大則均勻度越高,可見腸道內(nèi)容物放線菌的均勻度最高,蚓糞次之,生活土壤放線菌的均勻度最低。

圖3 蚓糞中可培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of culturable actinobacteria from earthworm feces

稀釋性曲線顯示(圖4),腸道內(nèi)容物克隆文庫的曲線已呈平緩,蚓糞克隆文庫的曲線趨于平緩,而生活土壤克隆文庫的曲線幾乎呈直線。據(jù)Kemp[26]等的理論可知,腸道內(nèi)容物克隆文庫基本涵蓋蚯蚓腸道內(nèi)容物所有種類的放線菌,蚓糞克隆文庫涵蓋蚓糞中大多數(shù)種類的放線菌,但生活土壤克隆文庫只涵蓋蚯蚓生活土壤中少數(shù)種類的放線菌。這一結(jié)果映證蚯蚓吞食作用使土壤放線菌的多樣性降低,放線菌的多樣性在生活土壤、蚓糞和腸道內(nèi)容物中依次遞減,生活土壤中有更豐富的放線菌資源。

圖4 3種樣品中不可培養(yǎng)放線菌的稀釋性曲線 Fig.4 Rarefaction curve of unculturable actinobacteria at 3 soil samples

2.6 免培養(yǎng)放線菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

免培養(yǎng)放線菌的系統(tǒng)進化樹顯示,蚯蚓生活土壤克隆文庫含有40個OTUs(45個克隆子),其中11個OTUs(11個克隆子)屬未知放線菌,1個OTU(1個克隆子)屬于酸微菌目中的酸微菌科(Acidimicrobiaceae),28個OTUs(33個克隆子)分布于放線菌目的10個科(圖5),分別為假諾卡氏菌科(Pseudonocardiaceae)、類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、放線菌科(Actinomycetaceae)、小單孢菌科(Micromonosporaceae)、分支桿菌科(Mycobacteriaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、冢村氏菌科(Tsukamurellaceae)、動球菌科(Kineococcaceae)。諾卡氏菌科含7個克隆子(15.6%),是生活土壤中的優(yōu)勢放線菌群,類諾卡氏菌科和鏈霉菌科分別含6個(13%)和5個克隆子(11%),是豐度中等菌群,微桿菌科、冢村氏菌科和動球菌科各含1個克隆子(2%)。

腸道內(nèi)容物克隆文庫含有20個OTUs(61個克隆子),其中2個OTUs屬未知放線菌(2個克隆子),18個OTUs(59個克隆子)分布于放線菌目的6個科(圖6),分別是類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、分支桿菌科(Mycobacteriaceae)和小單孢菌科(Micromonosporaceae)。微桿菌科含48個克隆子(79%),是腸道內(nèi)容物中的優(yōu)勢放線菌群,諾卡氏菌科含4個克隆子(6.6%),是豐度中等菌群,分支桿菌科含1個克隆子(1.6%),余下3科各含2個克隆子(3.3%)。

蚓糞克隆文庫含有30個OTUs(51個克隆子),其中5個OTUs屬未知放線菌(6個克隆子),25個OTUs分布于放線菌目的6個科(圖7),分別是類諾卡氏菌科(Nocardioidaceae)、鏈霉菌科(Streptomycetaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、微桿菌科(Microbacteriaceae)、分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)和糖霉菌科(Glycomycetaceae)。鏈霉菌科含15個克隆子(29%),是蚓糞中的優(yōu)勢放線菌群,微桿菌科含13個克隆子(25.5%),是豐度中等菌群,糖霉菌科僅含1個克隆子(2%)。

綜上可知,蚯蚓生活土壤(吞食前)中,放線菌多樣性最高,未知放線菌數(shù)量最多；土壤經(jīng)吞食作用進入蚯蚓腸道(吞食中)導致放線菌多樣性降至最低,未知放線菌數(shù)量驟減；土壤以蚓糞(吞食后)形式排出,放線菌多樣性回升,未知放線菌數(shù)量明顯增加。此外,3個階段中優(yōu)勢菌群也有明顯波動,諾卡氏菌科、微桿菌科和鏈霉菌科分別是吞食前、中、后期的優(yōu)勢菌群,且諾卡氏菌科在3個階段均有廣泛分布。

圖5 生活土壤16S rDNA克隆文庫序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 The phylogenetic tree structured by 16S rDNA clone library from living soil

圖6 腸道內(nèi)容物16S rDNA克隆文庫序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 The phylogenetic tree structured by 16S rDNA clone library from intestinal soil

圖7 蚓糞16S rDNA克隆文庫序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 The phylogenetic tree structured by 16S rDNA clone library from earthworm feces

2.7 土壤基本理化因子的主成分分析

蚯蚓吞食過程中,土壤各理化性質(zhì)共同影響放線菌多樣性,因而選擇主成分分析法進行多元統(tǒng)計分析,利用降維思想找出主要影響因子。根據(jù)主成分分析原理,當累積方差貢獻率大于85%時可基本反映系統(tǒng)的變異信息。對8個土壤基本理化因子進行主成分分析,結(jié)果(表3)顯示8個土壤基本理化因子可分為2個成分,特征根均大于1。主成分1中全氮、有效磷、全鉀、速效鉀、有機質(zhì)載荷量均超過0.900,說明主成分1為全氮、有效磷、鉀素和有機質(zhì)的綜合因子,其中全氮、有效磷的載荷量在主成分1中最大；主成分2中全磷、速效氮、pH載荷量較大,其中全磷的載荷量最大。主成分1貢獻率為78.835%,主成分2的貢獻率為21.465%,主成分1貢獻率最大,說明全氮、有效磷、全鉀、速效鉀和有機質(zhì)對蚯蚓吞食過程中放線菌多樣性變化起主要作用。

表3 主成分(PCA)的因子載荷量、特征根與貢獻率

2.8 土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性的相關性分析

根據(jù)主成分分析結(jié)果,分析理化性質(zhì)與多樣性的相關性,結(jié)果如表4所示,可知放線菌的物種豐富度與土壤有效磷含量呈顯著負相關性,相關系數(shù)為-0.998；與土壤全氮含量呈極顯著負相關性,相關系數(shù)為-1,可知土壤有效磷和全氮含量升高使土壤放線菌物種數(shù)降低。另外pH、有機質(zhì)、速效氮、速效鉀、全鉀等含量均與放線菌多樣性具有深刻的相關性,說明蚯蚓吞食土壤過程中,土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性相互影響。

3 討論

3.1 土壤理化性質(zhì)的變化

本研究發(fā)現(xiàn),蚯蚓生活土壤(吞食前)各理化指標含量均偏低,腸道內(nèi)容物(吞食中)速效氮含量最高,蚓糞(吞食后)的有機質(zhì)、全氮、全鉀、有效磷、速效鉀含量均最高,說明蚯蚓吞食土壤使土壤有效成分明顯增加,能顯著增強土壤肥力,可將蚓糞作為優(yōu)質(zhì)有機肥應用于土壤改良培肥與作物增產(chǎn)[27]。土壤理化性質(zhì)的主成分分析及其與放線菌多樣性的相關性發(fā)現(xiàn),在蚯蚓吞食土壤過程中,土壤的全氮、有效磷含量可能與放線菌多樣性密切相關。可見,土壤肥力增加除受到蚯蚓胃的物理破碎、腸道礦化作用影響外[28- 30],還受到腸道放線菌種類的影響。

表4 3種樣品放線菌多樣性指數(shù)與土壤理化性質(zhì)相關性分析

*兩者之間在P<0.05水平上顯著相關；**兩者之間在P<0.01水平上極顯著相關

3.2 放線菌多樣性的變化

本研究純培養(yǎng)法和免培養(yǎng)法均證實,放線菌的多樣性在生活土壤(吞食前)、蚓糞(吞食后)和腸道內(nèi)容物(吞食中)中依次遞減。原因可能是土壤進入?yún)捬醐h(huán)境導致放線菌多樣性降低[31]；同時,蚯蚓依靠吞食大量富含微生物的土壤顆粒維持生存[32],吞食過程中腸道內(nèi)的纖維素酶、蛋白酶和磷酸酶可能會使土壤中部分敏感微生物減少[33- 34]；并且通過克隆文庫法發(fā)現(xiàn),生活土壤中少量存在的微桿菌科(Microbacteriaceae)在腸道內(nèi)容物中為絕對優(yōu)勢放線菌,而生活土壤和腸道內(nèi)容物中少量存在的鏈霉菌屬(Streptomycetaceae)在糞便中為優(yōu)勢放線菌,推測土壤中部分放線菌在腸道中大量擴增,導致腸道內(nèi)容物和蚓糞放線菌多樣性降低。蚓糞放線菌多樣性略高于腸道內(nèi)容物,可能因新鮮蚓糞所處的有氧環(huán)境導致放線菌多樣性回升。本研究中放線菌多樣性的變化趨勢與Furlong等[9]通過克隆文庫法進行研究的結(jié)果一致。Parthasarati等人通過可培養(yǎng)法所得結(jié)果與本研究不一致[4],可能由于蚯蚓種類及培養(yǎng)基不同造成[35]。

主成分分析表明,土壤全氮、有效磷、全鉀、速效鉀和有機質(zhì)對蚯蚓吞食過程中放線菌多樣性變化影響較大；土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性的相關性分析表明土壤有效磷、全氮含量升高導致放線菌多樣性顯著降低。兩種分析均表明在蚯蚓吞食過程中放線菌多樣性受土壤理化性質(zhì)的影響。

經(jīng)克隆文庫法發(fā)現(xiàn),蚯蚓生活土壤(吞食前)、腸道內(nèi)容物(吞食中)和蚓糞(吞食后)中的放線菌主要分布在放線菌目,與Knapp等人的研究結(jié)果一致[35]。此外,蚯蚓吞食過程3個階段的優(yōu)勢菌群有明顯波動,諾卡氏菌科為吞食前優(yōu)勢菌群；微桿菌屬在吞食前僅占2%,在中期數(shù)量驟增至79%,是優(yōu)勢菌群,在后期數(shù)量驟減至25.5%,這與Huang報道的一致[36],推測微桿菌屬放線菌有助于植物性食物的分解；吞食中期鏈霉菌科分布很少,后期數(shù)量明顯增加,環(huán)毛蚓的腸道環(huán)境可能利于微桿菌科放線菌的繁殖,對鏈霉菌科放線菌的生存、繁殖有明顯的抑制作用。

純培養(yǎng)法是獲得功能放線菌的必要手段,本研究共獲得59株放線菌,鏈霉菌占96.6%,蚯蚓腸道、蚓糞兩種特殊生境中獲得的鏈霉菌可能具備更強的活性和功能。有研究報道,圖2中Streptomycesflavogriseus能產(chǎn)抗霉素[37],可見其親緣菌S2、S4、S6很可能具有產(chǎn)抗霉素的能力,有待后續(xù)研究。

綜上,本研究通過可培養(yǎng)法與克隆文庫法探明了蚯蚓吞食前、中、后階段土壤放線菌多樣性及土壤理化性質(zhì)的變化特征,主成分分析與相關性分析可知全氮、有效磷含量顯著影響放線菌多樣性；進一步完善了蚯蚓、土壤和放線菌3者間的相互關系,為動物-微生物聯(lián)合治理環(huán)境、保護土壤生態(tài)環(huán)境提供理論依據(jù)。

[1] Shan J, Liu J, Wang Y F, Yan X Y, Guo H Y, Li X Z, Ji R. Digestion and residue stabilization of bacterial and fungal cells, protein, peptidoglycan, and chitin by the geophagous earthwormMetaphireguillelmi. Soil Biology and Biochemistry, 2013, 64: 9- 17.

[2] Bernard L, Chapuis-Lardy L, Razafimbelo T, Razafindrakoto M, Pablo A L, Legname E, Poulain J, Brüls T, O′Donohue M, Brauman A, Chotte J L, Blanchart E. Endogeic earthworms shape bacterial functional communities and affect organic matter mineralization in a tropical soil. The ISME Journal, 2012, 6(1): 213- 222.

[3] 姜怡, 唐蜀昆, 張玉琴, 婁愷, 徐麗華. 放線菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì). 微生物學通報, 2007, 34(1): 188- 190.

[4] Parthasarathi K, Ranganathan L S, Anandi V, Zeyer J. Diversity of microflora in the gut and casts of tropical composting earthworms reared on different substrates. Journal of Environmental Biology, 2007, 28(1): 87- 97.

[5] Egert M, Marhan S, Wagner B, Scheu S, Friedrich M W. Molecular profiling of 16S rRNA genes reveals diet-related differences of microbial communities in soil, gut, and casts ofLumbricusterrestrisL. (Oligochaeta: Lumbricidae). FEMS Microbiology Ecology, 2004, 48(2): 187- 197.

[6] Sparling G P. Ratio of microbial biomass carbon to soil organic matter carbon as a sensitive indicator of changes in soil organic matter. Australian Journal of Soil Research, 1992, 30(2): 195- 207.

[7] Deca?ns T, Mariani L, Lavelle P. Soil surface macrofaunal communities associated with earthworm casts in grasslands of the Eastern Plains of Colombia. Applied Soil Ecology, 1999, 13(1): 87- 100.

[8] 張立宏, 許光輝. 微生物和蚯蚓的協(xié)同作用對土壤肥力影響的研究. 生態(tài)學報, 1990, 10(2): 116- 120.

[9] Furlong M A, Singleton D R, Coleman D C, Whitman W B. Molecular and culture-based analyses of prokaryotic communities from an agricultural soil and the burrows and casts of the earthwormLumbricusrubellus. Applied and Environmental Microbiology, 2002, 68(3): 1265- 1279.

[10] 劉光崧. 土壤理化分析與剖面描述. 北京: 中國標準出版社, 1996.

[11] Haynes R J, Fraser P M. A comparison of aggregate stability and biological activity in earthworm casts and uningested soil as affected by amendment with wheat or lucerne straw. European Journal of Soil Science, 1998, 49(4): 629- 636.

[12] 史學群, 宋海超, 劉柱. 海南省土壤拮抗放線菌分離方法初探. 中國農(nóng)學通報, 2006, 22(10): 431- 435.

[13] 阮繼生. 放線菌快速鑒定與系統(tǒng)分類. 北京: 科學出版社, 2011.

[14] 蔣國彪, 馬沁沁, 方志軒, 雍彬, 劉欣林, 王一丁. 一株高效溶磷小麥內(nèi)生菌的篩選與鑒定. 四川師范大學學報: 自然科學版, 2012, 35(1): 122- 126.

[15] 宋清姿, 王一丁, 周艷玲, 馬沁沁, 袁向華. 耕作土壤中蚯蚓腸道可培養(yǎng)放線菌的多樣性研究. 四川師范大學學報: 自然科學版, 2016, 39(2): 284- 288.

[16] Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28(10): 2731- 2739.

[17] Wu J T, Wang L, Ma F, Yang J X, Li S Y, Li Z. Effects of vegetative-periodic-induced rhizosphere variation on the uptake and translocation of metals inPhragmitesaustralis(Cav.) Trin ex. Steudel growing in the Sun Island Wetland. Ecotoxicology, 2013, 22(4): 608- 618.

[18] 韓俊, 劉海軍, 原志敏, 姚俊. 石油污染土壤可培養(yǎng)放線菌遺傳多樣性分析. 環(huán)境科學與技術, 2014, 37(3): 32- 36.

[19] 馮鴿, 許姍姍, 王超, 嚴立恩, 張璇, 李靜. 黃河三角洲濱海濕地非培養(yǎng)放線菌多樣性. 微生物學通報, 2013, 40(9): 1570- 1579.

[20] Huber T, Faulkner G, Hugenholtz P. Bellerophon: a program to detect chimeric sequences in multiple sequence alignments. Bioinformatics, 2004, 20(14): 2317- 2319.

[21] Thompson J D, Gibson T J, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins D G. The CLUSTAL-X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research, 1997, 25(24): 4876- 4882.

[22] Hall T A. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, 1999, 41: 95- 98.

[23] Stach J E M, Maldonado L A, Masson D G, Ward A C, Goodfellow M, Bull A T. Statistical approaches for estimating actinobacterial diversity in marine sediments. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69(10): 6189- 6200.

[24] 謝晴宜, 屈直, 馬海霞, 洪葵. 克隆文庫分析紅樹林土壤中放線菌的多樣性. 熱帶作物學報, 2012, 32(8): 1466- 1470.

[25] 徐麗華, 楊宇容, 姜成林. 云南土壤放線菌生態(tài)分布的研究. 微生物學報, 1996, 36(3): 220- 226.

[26] Kemp P F, Aller J Y. Bacterial diversity in aquatic and other environments: what 16S rDNA libraries can tell us. FEMS Microbiology Ecology, 2004, 47(2): 161- 177.

[27] 崔玉珍, 牛明芬. 蚯蚓糞對土壤的培肥作用及草莓產(chǎn)量和品質(zhì)的影響. 土壤通報, 1998, 29(4): 156- 157.

[28] Elvira C, Sampedro L, Benítez E, Nogales R. Vermicomposting of sludges from paper mill and dairy industries withEiseniaandrei: a pilot-scale study. Bioresource Technology, 1998, 63(3): 205- 211.

[29] Parthasarathi K, Ranganathan L S. Longevity of microbial and enzyme activity and their influence on NPK content in pressmud vermicasts. European Journal of Soil Biology, 1999, 35(3): 107- 113.

[30] Carpenter D, Hodson M E, Eggleton P, Kirk C. Earthworm induced mineral weathering: preliminary results. European Journal of Soil Biology, 2007, 43(S1): S176-S183.

[32] Bohlen P J, Scheu S, Hale C M, McLean M A, Migge S, Groffman P M, Parkinson D. Non-native invasive earthworms as agents of change in northern temperate forests. Frontiers in Ecology and the Environment, 2004, 2(8): 427- 435.

[33] Tiunov A V, Scheu S. Microfungal communities in soil, litter and casts ofLumbricusterrestrisL. (Lumbricidae): a laboratory experiment. Applied Soil Ecology, 2000, 14(1): 17- 26.

[34] Scheu S, Schlitt N, Tiunov A V, Newington J E, Jones H T. Effects of the presence and community composition of earthworms on microbial community functioning. Oecologia, 2002, 133(2): 254- 260.

[35] Knapp B A, Podmirseg S M, Seeber J, Meyer E, Insam H. Diet-related composition of the gut microbiota ofLumbricusrubellusas revealed by a molecular fingerprinting technique and cloning. Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41(11): 2299- 2307.

[36] Huang K, Li F S, Wei Y F, Fu X Y, Chen X M. Effects of earthworms on physicochemical properties and microbial profiles during vermicomposting of fresh fruit and vegetable wastes. Bioresource Technology, 2014, 170: 45- 52.

[37] Carlson S, Tanouye U, Omarsdottir S, Murphy B T. Phylum-specific regulation of resistomycin production in aStreptomycessp. via microbial coculture. Journal of Natural Products, 2015, 78(3): 381- 387.

Variations of soil physical-chemical properties and the diversity of actinomycetes during the process of swallowing of earthworms

YUAN Xianghua, ZHOU Yanling, SONG Qingzi, TUO Hongmei, MA Qinqin, WANG Yiding*

CollegeofLifeScience,SichuanNormalUniversity,Chengdu610101,China

The aim of the present study is to explore the dynamics of the diversity of actinomycetes and physical and chemical properties of soil during the process of swallowing of earthworms. Surrounding living soil of earthworms, intestinal contents, and earthworm feces acted as the special habitat soils of prophase, metaphase, and anaphase during the process. The pure culture method was used to separate and purify actinomycetes from the three phases, and a clone library was constructed to analyze the diversity of actinomycetes. The soil physical-chemical properties in three phases were determined according to the national standard. The correlation of physical-chemical properties of soil and the diversity of actinomycete was analyzed by using the principal component analysis and the correlation analysis. Results showed that 27, 15, and 17 actinomycetes were separated from living soil, intestinal contents, and earthworm feces, respectively. Morphological analysis and 16S rDNA sequencing showed that actinomycetes from living soil belonged toActinosynnema,Streptomyces, andNocardiopsis, whereas those separated from the intestinal contents and feces belonged toStreptomyces. The diversity of actinomycetes declined in relation to living soil, feces, and intestinal contents. Clone libraries of living soil, intestinal contents, and feces had 40, 20, and 30 operational taxonomic units (OTUs) divided into 11, 6, and 6 families; 24%, 3.3%, and 11.7% were unknown bacterium. The dominant actinomycetes were Nocardioidaceae, Microbacteriaceae, and Streptomycetaceae, respectively. There was no significant difference of total P content between the three phases. The physical and chemical properties of living soil were the lowest. The intestinal contents had the most contents of available N, whereas feces had the most contents of organic matter, total N and K, and available P. The principal component analysis and the correlation analysis showed that available P, total N, total P, available P, and organic matter content of the soil had a great influence on the diversity of actinomycetes. There was a negative relationship between the content of available P, total N, and actinomycete diversity in the process of swallowing of earthworms, whereas the coefficient was -0.998 and -1, respectively. The present study provided a theoretical basis for further research on the relationship among earthworms, soil, and actinomycetes.

actinomycetes; diversity; earthworm; physical-chemical properties of soil; cultivation; library of 16S rDNA clone; principal components analysis; correlation

四川省教育廳省級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201510636068); 四川省高校重點實驗室開發(fā)項目(SCYZ201408)

2016- 06- 21;

2016- 11- 10

10.5846/stxb201606211204

*通訊作者Corresponding author.E-mail: lemonlyty@sohu.com

袁向華,周艷玲,宋清姿,脫紅梅,馬沁沁,王一丁.蚯蚓吞食過程中土壤理化性質(zhì)與放線菌多樣性的變化特征.生態(tài)學報,2017,37(4):1199- 1210.

Yuan X H, Zhou Y L, Song Q Z, Tuo H M, Ma Q Q, Wang Y D.Variations of soil physical-chemical properties and the diversity of actinomycetes during the process of swallowing of earthworms.Acta Ecologica Sinica,2017,37(4):1199- 1210.