吳韻雅+楊葳+劉敏敏+楊碩+歐陽波

摘 要：番茄褪綠病毒（ToCV）病近幾年來在我國各地相繼暴發(fā)，北方產(chǎn)區(qū)染病情況尤為嚴重。對山東壽光蔬菜種業(yè)集團示范園內(nèi)采集回的27個番茄品種的樣品進行RT-PCR檢測，結(jié)果表明，其中23個品種感染了ToCV；之后對這23個樣品進行實時熒光定量PCR檢測，分析病毒的CP基因的相對表達量，結(jié)果表明，感染品種中ToCV含量存在明顯差異；進一步對樣品的葉綠素含量進行了檢測，結(jié)果表明，較難通過葉綠素含量高低判斷ToCV的感染程度。

關(guān)鍵詞：番茄褪綠病毒；PCR；實時熒光定量PCR；葉綠素

番茄是我國和全球最重要的蔬菜作物之一。近年來，番茄褪綠病毒（Tomato Chlorosis Virus，ToCV）病對我國番茄產(chǎn)業(yè)形成了潛在的威脅。2012年，北京首次出現(xiàn)該病毒病發(fā)生的報道，隨后在膠東半島、天津、河北等地也相繼暴發(fā)了ToCV[1～3]，目前該病毒病已經(jīng)在山東省廣泛蔓延，使得番茄產(chǎn)量大幅度下降，造成了巨大的經(jīng)濟損失。

ToCV屬長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病毒屬（Crinivirus），該病毒巨大，由2條超過8 kb的RNA鏈組成。ToCV不能由種子、汁液等途徑進行傳播，只能由銀葉粉虱（Bemisia argentifolii）、煙粉虱（B. tabaci）、紋翅粉虱（Trialeurodes abutilonea）、溫室白粉虱（T. vaporariorum）傳播，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一一個可以由2個屬的粉虱作為傳播媒介的植物病毒[4，5]。在我國，煙粉虱是ToCV的主要傳播媒介。1998年，美國佛羅里達州報道發(fā)現(xiàn)ToCV[6]。之后，ToCV相繼在美洲、歐洲、亞洲以及中東等多個國家和地區(qū)蔓延。ToCV不但能侵染番茄，還可以侵染馬鈴薯、甜椒等其他的園藝作物[7]，為害極大。

ToCV在侵染番茄后有較長的潛伏期，一般情況下3～4周內(nèi)不會表現(xiàn)出明顯癥狀，因此難以發(fā)現(xiàn)植株已經(jīng)染病[8]。而且發(fā)病初期的典型癥狀與缺素癥極其相似，容易混淆，具體表現(xiàn)為葉脈間失綠，葉片變厚，但葉脈仍為綠色；發(fā)病中期，葉片從邊緣向中間壞死；發(fā)病后期，整個植株病死，嚴重影響果實的

質(zhì)量。

目前，對于ToCV的鑒定和檢測，主要運用血清學(xué)方法[9]和分子生物學(xué)方法[10，11]。分子生物學(xué)技術(shù)中，PCR技術(shù)操作簡便、靈敏度高，因此被廣泛使用。在PCR技術(shù)上發(fā)展起來的實時熒光定量PCR更是可以高效、快速地鑒別包括ToCV在內(nèi)的任何植物病毒[12]。

山東壽光是“中國蔬菜之鄉(xiāng)”，山東壽光蔬菜種業(yè)集團示范園是山東有代表性的示范園區(qū)之一。2015年示范園種植有800多個品種，當年的示范種植中許多番茄品種出現(xiàn)了葉片皺縮卷曲、邊緣黃化等明顯的病毒病癥狀，疑似感染了ToCV。為了確認ToCV的感染情況，從該示范園中取樣，通過RT-PCR檢測ToCV的外殼蛋白基因CP，分析ToCV的感染情況，進一步通過實時熒光定量PCR檢測確定染病品種中CP基因的相對表達量，與此同時還測定了樣品中葉綠素含量，以分析ToCV感染程度與葉綠素含量之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗 材料

2015年12月6日，從山東壽光市蔬菜種業(yè)集團示范園采集27個番茄品種的樣品，編號為1～27號（表1）。其中編號為2、3、27號的材料表現(xiàn)較好，無明顯疑似ToCV癥狀，而編號為1、11、23號的材料表現(xiàn)較差，其葉片明顯變黃，具有明顯的疑似ToCV癥狀。部分材料癥狀有較為明顯的分離，如編號為9、10號的植株。同時采集了顯癥明顯的9號和未顯癥狀的樣品10號，全部樣品保存在-80℃冰箱中備用。

1.2 試驗方法

①樣品總RNA的提取 采用Trizol法提取樣品的總RNA。樣品在液氮中研磨成粉，用Trizol充分提取之后離心，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管后用氯仿充分抽提，再次離心，上清液轉(zhuǎn)移至新離心管后用異丙醇沉淀RNA。得到的RNA沉淀用75%乙醇洗滌，離心、干燥后用無RNA酶的超純水溶解。提取得到的RNA樣品用甲醛變性的1%瓊脂糖凝膠快速電泳，檢測RNA的完整性，用NanoDrop測定RNA濃度。

②RT-PCR擴增 用DNase去除RNA樣品中的DNA后，進行反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng)，體系如下（20 μL）：RNA樣品2.2 μL、HiScriptII逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL、2×緩沖液10 μL、Actin基因的正向和反向引物（10 μmol/L）各0.3 μL、六堿基隨機引物5.2 μL。RT反應(yīng)在PCR儀上進行，程序如下：25℃ 5 min，50℃ 15 min，85℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄完成后得到的cDNA加入40 μL ddH2O稀釋，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

利用Actin基因的引物檢測RT反應(yīng)的質(zhì)量，利用ToCV的CP基因引物RT-ToCV檢測ToCV的存在與否。PCR擴增體系如下（15 μL）：ddH2O 10.42 μL、10×緩沖液 1.5 μL、dNTPs 1.2 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各 0.4 μL、Taq DNA聚合酶0.08 μL，模板cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸 30 s，擴增30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并利用凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果。本研究所用引物序列見表2。

③實時熒光定量PCR擴增 以上述cDNA作模板，以番茄Actin基因為內(nèi)參，利用CP基因的定量PCR引物Q-ToCP進行擴增，檢測CP基因的相對表達量。采用羅氏480實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系為（10 μL）：2×SYBR Green熒光定量PCR混合液5 μL、正向和反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL、cDNA模板 4 μL。定量PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性60 s；95℃ 10 s，57℃ 15 s，72℃ 20 s，共擴增40個循環(huán)，每次循環(huán)結(jié)束采集熒光信號；之后進行溶解曲線的采集與分析。循環(huán)閾值（Ct）由機器自動讀取。根據(jù)公式REL=Average[power（2，-CtCP）/power（2，-CtActin）]計算樣品中CP基因的相對表達量。

④葉綠素含量測定 葉綠素的提取方法如下：取0.1 g經(jīng)液氮研磨的樣品粉末于2 mL的離心管中，加入2 mL 95%丙酮-無水乙醇（2∶1）提取液。將離心管放入25℃生化培養(yǎng)箱中過夜提取直至肉眼觀察到樣品粉末變白為止。取200 μL樣品放入多功能酶標儀中，以提取液作為空白對照，測定645、663 nm波長下的吸光度。利用Arnon公式計算葉綠素含量，葉綠素總含量（mg/g）=（20.29A645+8.05A663）×v/w×1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR檢測ToCV的感染情況

將采集到的27份樣品葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA，利用Actin基因的特異引物擴增樣品以檢測cDNA的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)cDNA質(zhì)量符合RT-PCR要求。進一步利用CP基因的特異引物進行PCR擴增，結(jié)果如圖1。

從圖1可以看出，有19個樣品能擴增出CP基因的清晰條帶，4個樣品的條帶較淺，另外有4個樣品看不到條帶。從RT-PCR的結(jié)果來看，27個樣品中有23個檢測出ToCP，檢出率高達85%。

2.2 實時熒光定量PCR檢測CP基因的相對表達量

對RT-PCR中擴增出條帶的23個樣品利用實時熒光定量PCR進一步檢測ToCV病毒的CP基因的相對表達量，同時設(shè)置了田間抗性表型良好、RT-PCR中無可見條帶的27號樣品作為參照系。以Actin為內(nèi)參基因，利用ToCV的CP基因特異引物Q-ToCP-F和Q-ToCP-R對樣品cDNA進行定量PCR擴增，獲得Ct值，計算得到CP基因的相對表達量，結(jié)果見圖2。

從圖2可以看出，CP的相對表達量在11號樣品中最高，表明其感染程度最嚴重。根據(jù)CP基因的表達量高低排序，其中9、23、20、1、6、18、19、7、21、15、24號樣品明顯感染了不同程度的ToCV；22號樣品相對表達量最低，感染程度最輕；其余樣品CP基因的表達量均較低，包括作為參照的27號樣品。

2.3 葉綠素含量

從圖3可以看出，樣品中葉綠素含量差異較大。15號樣品的葉綠素含量最高，為0.818 mg/g，13號和4號樣品次之；1號樣品的葉綠素含量最低，為0.063 mg/g， 5號和12號等樣品的葉綠素含量也很低。結(jié)合圖2、3結(jié)果可看出，僅憑葉綠素含量無法判斷ToCV的感染程度。

3 討論與結(jié)論

ToCV的鑒定技術(shù)主要包括表型鑒定、血清學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，其中實時熒光定量PCR技術(shù)[12]和反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測技術(shù)[3]是目前較為高效、快速、準確的鑒定方法。本研究從山東壽光蔬菜種業(yè)集團示范園采集27個番茄品種的樣品，通過RT-PCR檢測確定染病品種多達23個，比率為85%。從這個結(jié)果可以推測當前生產(chǎn)上的絕大部分番茄品種對ToCV是感病的。進一步對RT-PCR檢測判斷為明顯染病的品種進行實時熒光定量PCR，檢測CP基因的相對表達量，其中有12個品種CP基因相對表達量較高，如11、23號樣品，可以判斷其感染程度較為嚴重，推斷這些品種對ToCV的抗性較差，在ToCV暴發(fā)的地區(qū)不宜推廣或者要做好嚴格的防控措施。盡管2、3、12、27號樣品在RT-PCR檢測中沒有擴增出CP基因的條帶，表現(xiàn)為未受ToCV感染，但由于缺乏嚴格的接種鑒定，尚不能推斷這些品種對ToCV具有抗性。實際上，以27號樣品作為參照進行實時熒光定量PCR檢測時，仍然能夠檢測到熒光信號，即表明仍然有ToCV感染的跡象。從這里也可以看出，實時熒光定量PCR比傳統(tǒng)的RT-PCR更為靈敏?？傊?，對未檢測到明顯ToCV感染的品種，可以進一步進行多茬多點觀察。

通過測定樣品中葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，無論是檢測為感染了ToCV還是沒有感染ToCV的品種，葉綠素含量有高有低，表現(xiàn)出明顯的品種差異。同時，感病品種中，較難通過葉綠素含量高低判斷ToCV的感染程度。

在ToCV的防控方面，由于現(xiàn)在沒有抗病商業(yè)品種可以選擇，可以優(yōu)先選擇在發(fā)病條件下表現(xiàn)良好、分子檢測CP基因含量低的耐病品種。同時，對病原的傳播進行嚴格的防控，包括采用防蟲網(wǎng)、粘蟲板和殺蟲劑嚴防粉虱，嚴禁從病區(qū)調(diào)運種苗等。此外，對疑似感染了ToCV的苗子，及時進行拔除處理，并對生產(chǎn)田進行抗病毒防治。

當然，防治病蟲害的根本辦法是種植抗性優(yōu)良的品種，并配合正確的田間管理。因此，培育抗番茄褪綠病毒的優(yōu)良品種應(yīng)該作為育種家們未來重點研究的課題。

隨著煙粉虱在全世界范圍內(nèi)的大規(guī)模擴散，由煙粉虱傳播的病毒病日趨嚴重。由煙粉虱傳播的ToCV在世界范圍內(nèi)相繼暴發(fā)，也在我國山東省多個地區(qū)發(fā)生并且造成嚴重為害。建立嚴格的防控體系和盡快選育出抗病品種是當前重要的任務(wù)。目前，西班牙科學(xué)家已從野生番茄中鑒定出2份抗褪綠病毒的番茄材料[13]，盡快將其中的抗性基因轉(zhuǎn)育到栽培品種中是將來一段時間的重要研發(fā)目標。

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