女貞子中黃酮類化合物的提取工藝研究

黃新蘋++王玲++王武朝

摘要：采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)法對(duì)女貞子（Ligustrum lucidum）中黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化選擇，以料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素設(shè)計(jì)3水平正交試驗(yàn)L9（34）。根據(jù)正交分析結(jié)果，確定女貞子中黃酮類化合物在90 ℃水浴條件下料液比為1∶40（g∶mL），用30%乙醇提取100 min為最佳提取工藝，在此條件下，總黃酮提取率可達(dá)5.16%，且4個(gè)因素對(duì)提取率的影響分別為溫度>料液比>時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。

關(guān)鍵詞：女貞子（Ligustrum lucidum）；黃酮類化合物；正交試驗(yàn)；提取工藝

中圖分類號(hào)：S687；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）22-5903-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.22.044

Study on Extraction Process of Total Flavonoids in Ligustrum lucidum Fruits

HUANG Xin-ping，WANG Ling，WANG Wu-chao

（College of Chemistry and Chemical Engineering Zhengzhou Normal University，Zhengzhou 450044，China）

Abstract：The extraction process of total flavonoids from Ligustrum lucidum fruits was optimized by the method of orthogonal design experiment. The three levels orthogonal test L9（34） was designed by four factors such as the solid-to-liquid ratio，extraction time，extraction temperature，ethanol volume fraction. According to results of the orthogonal analysis，the optimum extraction process was in 90 ℃ water bath with solid-to-liquid ratio of 1∶40，with 30% ethanol extraction for 100 min. Under these conditions，the extraction rate of flavonoids could reach 5.16%，and the effects of four factors on the extraction rate were ranked as temperature>solid-to-liquid ratio>extraction time>ethanol volume fraction.

Key words： Ligustrum lucidum；flavonoids； orthogonal experiment； extraction process

女貞子（Ligustrum lucidum）為木犀科常綠喬木植物女貞的干燥成熟果實(shí)。女貞子主要含有三萜類化合物、黃酮類、裂環(huán)環(huán)烯醚萜類和對(duì)羥基苯乙醇苷類化合物等多種化學(xué)成分，具有抗炎、抑菌、降血糖、降血脂、保肝、抗血栓、抗腫瘤等多種生物活性[1，2]。本課題組一直關(guān)注女貞子的研究開發(fā)，已簡(jiǎn)要綜述了女貞子的主要化學(xué)成分及其藥理活性的研究進(jìn)展，并介紹其主要化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)與藥理活性的構(gòu)效關(guān)系[3]。黃酮類化合物是女貞子具有降脂作用的主要成分，總有效率達(dá)91.2%，對(duì)人類的腫瘤、衰老、心血管疾病的防治也具有重要意義[3]。因此開發(fā)利用女貞子中黃酮類化合物，提升女貞子的利用價(jià)值，具有較大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。本研究以女貞子為原料，利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化選擇了女貞子中總黃酮的提取工藝，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用女貞子中黃酮類化合物提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

TU-1901型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用）；HA-180MF型電子分析天平（日本日立公司）；TB-85型恒溫水?。ㄈ毡緧u津公司）；pHS-3C型酸度計(jì)（上海第二分析儀器廠）。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；女貞子購(gòu)于老百姓大藥房，由鄭州師范學(xué)院崔波教授鑒定為女貞子。試驗(yàn)所用試劑均為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 女貞子總黃酮的提取方法 女貞子用清水洗凈，風(fēng)干，放入烘箱50 ℃烘至恒重，干燥后放入干燥器中密封保存。準(zhǔn)確稱取1.0 g女貞子粉末，按照一定料液比，一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇于一定溫度的水浴提取一定時(shí)間。抽濾，濾液減壓濃縮并定容，測(cè)定濾液中總黃酮含量及提取率。

1.2.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品3.00 mg，用50%無(wú)水乙醇溶解，定容至10 mL容量瓶，搖勻，得0.3 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。分別移取一定量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度分別為0.003、0.006、0.012、0.018、0.024、0.036 mg/mL系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液。在361 nm處測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，并作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。黎彧等[4]以無(wú)水甲醇溶解定容蘆丁，最大吸收波長(zhǎng)在359 nm。考慮到甲醇污染相對(duì)較大，價(jià)格較貴，且考慮到標(biāo)準(zhǔn)曲線的試驗(yàn)條件與提取條件的一致性，本試驗(yàn)選擇50%乙醇溶解蘆丁。

1.2.3 樣品總黃酮含量的測(cè)定 精確量取樣品溶液0.5 mL置于5 mL容量瓶中，先用50%乙醇溶液進(jìn)行溶解定容。在361 nm處測(cè)定溶液吸光度，并計(jì)算提取液樣品中總黃酮含量及提取率。

總黃酮提取率=（濾液中黃酮含量/女貞子細(xì)粉的質(zhì)量）×100%

1.2.4 單因素試驗(yàn) 以粉碎度、提取溫度、提取時(shí)間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取次數(shù)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，確定正交試驗(yàn)各因素的水平。

1.2.5 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)女貞子黃酮類化合物的提取工藝進(jìn)行正交優(yōu)化，正交試驗(yàn)L9（34），并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，以確定最佳提取工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 粉碎度對(duì)總黃酮提取的影響 分別稱取3份5.0 g女貞子，第1份未經(jīng)加工粉碎的原果實(shí)，第2份采用傳統(tǒng)粉碎法進(jìn)行粉碎處理（200目），第3份采用超微粒粉碎技術(shù)處理（200目以下粉末），第4份采用普通研磨法進(jìn)行粉碎處理（大于200目）。用50%的乙醇按料液比為1∶10（g∶mL，下同）在80 ℃下水浴回流浸提60 min。抽濾，濾液減壓濃縮，定容。在361 nm下測(cè)定溶液吸光度。由圖2可知，原果實(shí)的提取率很低，需要對(duì)樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆鬯樘幚恚⒎鬯榧夹g(shù)與傳統(tǒng)粉碎相比，果實(shí)的提取率未明顯提高，采用傳統(tǒng)粉碎法，粉碎顆粒在200目對(duì)總黃酮的提取效果最好，后續(xù)試驗(yàn)中的女貞子樣品都采用傳統(tǒng)粉碎法進(jìn)行粉碎處理。

2.1.2 溫度對(duì)總黃酮提取的影響 分別稱取5.0 g女貞子粉末6份，在25、40、60、80、85、90、100 ℃下用50%乙醇按料液比為1∶10水浴回流浸提，每次提取60 min。抽濾，濾液減壓濃縮，定容。在361 nm下測(cè)定溶液吸光度。由圖3可知，溫度對(duì)總黃酮的提取效果有顯著影響，不同溫度條件下提取率差別很大，在85 ℃條件下提取率最高。

2.1.3 時(shí)間對(duì)總黃酮提取的影響 分別稱取5.0 g 女貞子粉末5份，用50%乙醇按料液比為1∶10在85 ℃下水浴回流提取，提取時(shí)間分別為60、80、100、120、140 min。抽濾，濾液減壓濃縮，定容。在361 nm下測(cè)定溶液吸光度。由圖4可知，時(shí)間顯著影響女貞子中總黃酮的提取率，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)其提取率不斷提高，當(dāng)達(dá)到100 min時(shí)最高，100 min以后時(shí)間持續(xù)延長(zhǎng)，提取率反而下降，故確定100 min為最佳提取時(shí)間。

2.1.4 料液比對(duì)總黃酮提取的影響 文獻(xiàn)報(bào)道中對(duì)提取所用料液比觀點(diǎn)差距較大[5-7]，因此本研究選擇覆蓋這些條件，對(duì)其進(jìn)行對(duì)比分析。分別稱取5.0 g女貞子粉末6份，以料液比1∶5、1∶9、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，用50%乙醇在85 ℃下水浴回流浸提，每次提取60 min。抽濾，濾液減壓濃縮，定容。在361 nm下測(cè)定溶液吸光度。由圖5可知，總黃酮的提取率隨溶劑的增加逐漸升高，在1∶30以后變化不大，可見料液比顯著影響女貞子總黃酮的提取率。所用溶劑太少，總黃酮成分無(wú)法充分溶出，提取率相應(yīng)偏低，但提取液太多，會(huì)增加其他成分的溶出量，影響總黃酮的提取效果，并增加后期對(duì)溶液的濃縮處理能耗和工作量，根據(jù)文獻(xiàn)[8]報(bào)道，并結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)需要[9，10]，初步選擇料液比為1∶40。

2.1.5 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)總黃酮提取的影響 稱取5.0 g女貞子粉末5份，按料液比1∶10用體積分?jǐn)?shù)分別為40%、50%、60%、70%的乙醇，85 ℃下水浴回流提取60 min。抽濾，濾液減壓濃縮，定容。在361 nm下測(cè)定溶液吸光度。由圖6可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)顯著影響總黃酮的提取率，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時(shí)，提取率最高，之后隨著體積分?jǐn)?shù)增加總黃酮的含量先降低而后增加，可能是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)地增加溶劑極性變小，使一些極性小的成分溶出，再與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合成相應(yīng)類黃酮類的衍生物從而增加總黃酮提取率，考慮的實(shí)際生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)成本，采用40%的乙醇體積分?jǐn)?shù)比較合適。

2.1.6 提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取的影響 稱取5.0 g女貞子粉末，用50%的乙醇按料液比為1∶10在85 ℃下水浴回流浸提，提取1次，過(guò)濾后加等體積溶液，依次提取第2次、第3次和第4次，每次提取60 min。抽濾，濾液減壓濃縮，定容。測(cè)定濾液中總黃酮吸光度。由圖7可知，提取第2次以后總黃酮的含量已經(jīng)很低，提取次數(shù)對(duì)總黃酮的提取率影響不大，增加提取次數(shù)對(duì)女貞子總黃酮的提取效益影響不大。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

通過(guò)對(duì)單因素試驗(yàn)考察發(fā)現(xiàn)，影響女貞子中總黃酮提取率的主要因素是料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)。以這4個(gè)因素設(shè)計(jì)3水平正交試驗(yàn)L9（34），因素水平表見表1，試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表2。由表2可知，A3B2C3D1為最優(yōu)組合，即在90 ℃條件下料液比為1∶40，用30%乙醇提取100 min為最佳提取工藝，在此條件下，總黃酮提取率可達(dá)5.16%。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)表明，影響女貞子中總黃酮提取率的主要因素是料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)，同時(shí)得出4個(gè)因素對(duì)提取率的影響分別為溫度>料液比>時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù)。考慮因素間的交互作用，以影響女貞子中總黃酮提取率的料液比、提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)這4個(gè)因素設(shè)計(jì)3水平正交試驗(yàn)L9（34），從正交分析結(jié)果可以看出，在90 ℃條件下料液比為1∶40，用30%乙醇提取100 min為最佳提取工藝，在此條件下，總黃酮提取率可達(dá)5.16%。

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