李 遠(yuǎn)，肖文海，陳 靜，廖 娟，劉北忠*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶402160;2.重慶市大足區(qū)中醫(yī)院，重慶402360)

基于RGD多肽摻雜聚吡咯－銦錫氧化物的仿生微電極構(gòu)建及用于細(xì)胞生物學(xué)行為的電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)*

李 遠(yuǎn)1，肖文海2，陳 靜1，廖 娟1，劉北忠1*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶402160;2.重慶市大足區(qū)中醫(yī)院，重慶402360)

電化學(xué)阻抗檢測(cè);RGD多肽;聚吡咯;銦錫氧化物;細(xì)胞增殖;細(xì)胞毒性

體外細(xì)胞行為學(xué)信息分析是細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制研究及藥物細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的重要手段。細(xì)胞阻抗生物傳感器是一類(lèi)以電化學(xué)阻抗譜為探測(cè)手段，分析傳感電極表面培養(yǎng)/固定的活細(xì)胞自身或?qū)ν獯碳ろ憫?yīng)行為學(xué)信息的新型生物傳感器［1］。由于電化學(xué)阻抗譜技術(shù)具有無(wú)侵襲性、定性和定量相結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)，因此細(xì)胞阻抗生物傳感器能夠無(wú)標(biāo)記、定量分析細(xì)胞粘附、增殖和凋亡等生物學(xué)行為［2－4］，從而廣泛用于藥物篩選［5］及細(xì)胞生理病理機(jī)制［6］等研究領(lǐng)域。在細(xì)胞阻抗生物傳感器研究中，具有仿生功能的傳感電極表面使細(xì)胞維持正常生理功能是確保傳感器準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)，因此構(gòu)建具有良好仿生性能的傳感電極是細(xì)胞阻抗傳感器研究的關(guān)鍵。

當(dāng)前，細(xì)胞阻抗傳感器傳感電極常采用生物相容性較差的惰性金屬材質(zhì)，如金［7］、鉑［8］和玻碳電極［9］。采用新型生物相容性材料修飾是改善電極細(xì)胞生物相容性，促進(jìn)細(xì)胞粘附和維持細(xì)胞活性的重要途徑之一［10］。其中，導(dǎo)電聚合物聚吡咯由于具有本征導(dǎo)電、原位合成、表面性質(zhì)可控、良好的生物相容和穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)，因此具有作為細(xì)胞電化學(xué)生物傳感器電極修飾材料的潛力［11］。例如，Ding等在ITO電極表面修飾了碳納米管摻雜聚吡咯納米復(fù)合物，結(jié)果顯示修飾的聚吡咯納米復(fù)合物不但支持細(xì)胞粘附和增殖，而且通過(guò)電化學(xué)阻抗技術(shù)實(shí)現(xiàn)ECA－109細(xì)胞粘附和增殖檢測(cè)［12］;Ateh等通過(guò)硫酸皮膚素?fù)诫s聚吡咯修飾金電極以改善電極阻抗特征和生物相容性，以此實(shí)現(xiàn)了低濃度的角質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞增殖行為的檢測(cè)［13］。最近，我們將氧化石墨烯摻雜的聚吡咯膜通過(guò)電化學(xué)聚合方式修飾在ITO微電極表面顯著改善了電極的電化學(xué)穩(wěn)定性和生物相容性，并通過(guò)電化學(xué)阻抗譜技術(shù)解析了A549細(xì)胞增殖行為學(xué)信息［14］。

聚吡咯作為生物相容性電極修飾材料的另一個(gè)重要特性是摻雜劑選擇。在吡咯電聚合過(guò)程中，摻雜劑帶負(fù)電荷的陰離子作為帶正電荷聚吡咯骨架的電荷平衡電子與聚吡咯相結(jié)合形成聚吡咯/摻雜劑復(fù)合物。摻雜劑除常見(jiàn)的化學(xué)分子外，一些具有活性的生物大分子也能作為聚吡咯摻雜劑，形成的聚吡咯/生物分子復(fù)合物能夠與活細(xì)胞發(fā)生相互作用，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為［15－17］。例如，作為摻雜劑固定在聚吡咯表面的生物活性物質(zhì)透明質(zhì)酸能夠維持活性達(dá)幾天，并促進(jìn)體內(nèi)血管形成［15］。層粘連蛋白內(nèi)的多肽功能片段CDPGYGSR作為摻雜劑制備的聚吡咯修飾Michigan神經(jīng)記錄電極能夠促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞在電極表面和周邊生長(zhǎng)［16］，不同的多肽功能片段CDPGYGSR和RNIAEIIKDIA作為摻雜劑制備的聚吡咯能夠?qū)ε囵B(yǎng)在其表面的原代神經(jīng)元細(xì)胞生物學(xué)行為產(chǎn)生不同的影響［17］。

另一個(gè)方面，在體內(nèi)環(huán)境下，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)緊密結(jié)合，細(xì)胞外基質(zhì)不但作為細(xì)胞生長(zhǎng)的支架，而且調(diào)控細(xì)胞生物學(xué)行為。其中，細(xì)胞外基質(zhì)中粘附性蛋白內(nèi)包含的Arg-Gly-Asp(RGD)模體被證實(shí)是細(xì)胞能夠識(shí)別的最小多肽序列，因此RGD模體在生物材料表面的固定修飾成為一種改善材料生物相容性，提高仿生性能的通用策略［18］。目前研究已報(bào)道通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合［19－20］和親和性多肽序列連接器途徑［21］實(shí)現(xiàn)RGD模體在PPy表面固定。然而，以含RGD模體多肽作為摻雜劑通過(guò)電化學(xué)共聚合途徑制備生物活性聚吡咯復(fù)合膜的研究未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以含RGD模體多肽分子作為吡咯電聚合的摻雜劑，通過(guò)更為簡(jiǎn)單的一步法電化學(xué)聚合方式在ITO微電極表面修飾PPy/RGD復(fù)合膜獲得PPy/ RGD-ITO微電極。選擇ITO玻璃作為基底電極是由于其優(yōu)良的導(dǎo)電性和透光性，能夠?qū)崿F(xiàn)吡咯電聚合、電化學(xué)阻抗分析及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。隨后，對(duì)制備PPy/RGD復(fù)合膜的表面物理性能、組成成分及細(xì)胞生物相容性進(jìn)行了系統(tǒng)表征。最后，以PPy/ RGD-ITO微電極作為傳感電極，通過(guò)電化學(xué)阻抗譜技術(shù)對(duì)電極表面A549細(xì)胞增殖和天然抗腫瘤小分子重樓皂苷I的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1 材料與方法

1.1 ITO微電極加工及RGD/PPy復(fù)合膜電聚合和表征

ITO微電極加工采用課題組前期發(fā)展的感光干膜－ITO微電極工藝［22］，簡(jiǎn)要流程如下:將感光層厚度為35 μm的一層感光干膜(HQ－6100，長(zhǎng)興化學(xué)工業(yè)股份有限公司)通過(guò)覆膜機(jī)(100℃)壓貼ITO導(dǎo)電玻璃(珠海凱為光電科技有限公司)導(dǎo)電面，透過(guò)掩膜膠片對(duì)感光干膜紫外光照射30 s，30℃條件下用1%碳酸鈉溶液對(duì)感光干膜顯影5 min，使未經(jīng)紫外光照射區(qū)域的感光干膜溶解露出ITO微電極(電極直徑為1.0 mm)，去離子水沖洗2次，60℃烘干，紫外照射60 s使感光膠完全固化。

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CS315電化學(xué)工作站(武漢科思特儀器有限公司)上進(jìn)行，采用三電極系統(tǒng)，在實(shí)驗(yàn)室自制的電化學(xué)小池裝置中進(jìn)行。電化學(xué)小池裝置設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)［22］，電化學(xué)小池裝置含4個(gè)獨(dú)立的電化學(xué)測(cè)量小池單元，每個(gè)小池單元直徑為8 mm，體積為500 μL。三電極系統(tǒng)以位于測(cè)量小池單元底部的ITO微電極為工作電極，Ag/AgCl絲為參比電極(直徑:0.5 mm，長(zhǎng)度:10 mm)，鉑絲為輔助電極(直徑:1.0 mm，長(zhǎng)度:10 mm)，電化學(xué)小池裝置和三電極系統(tǒng)的照片圖 1(a)所示。含 RGD模體的多肽序列GRGDSP由北京中科亞光生物科技有限公司合成。PPy/RGD復(fù)合膜在ITO微電極上聚合采用恒電位法。聚合溶液由去離子水配置(＞18 MΩ)，含0.1 mol/L吡咯單體和1.0 mg/mL GRGDSP多肽，聚合前抽真空5 min去除聚合溶液中溶解的氧氣。聚合電壓設(shè)置為0.7 V(vs.Ag/AgCl)。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，聚合電量設(shè)置為0.8 mC，能夠在ITO微電極上形成均勻穩(wěn)定的PPy/RGD復(fù)合膜，復(fù)合膜厚度通過(guò)理論計(jì)算約為209 nm［23］。作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)以1.0 mg/mL的有機(jī)分子聚4－苯乙烯磺酸鈉(PSS，Sigma Aldrich)作為摻雜劑，在ITO微電極上聚合相同厚度的PSS/PPy膜。聚吡咯模拓?fù)湫蚊埠痛植诙仍谠恿︼@微鏡(Veeco MultimodeⅧ，布魯克公司，瑞士)輕敲模式測(cè)量，通過(guò)Nanoscopy analysis軟件(布魯克公司，瑞士)分析，濕潤(rùn)性采用SDC－200光學(xué)接觸角測(cè)量?jī)x(晟鼎，中國(guó))表征，組成成分通過(guò)Magna－IR 750傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)(尼高力，美國(guó))表征。

1.2 細(xì)胞生物相容性研究

人肺癌上皮細(xì)胞株A549由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存培養(yǎng)。PPy/RGD復(fù)合膜的細(xì)胞相容性通過(guò)A549細(xì)胞粘附、鋪展與增殖進(jìn)行評(píng)價(jià)。為便于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，首先按照上述相同聚合參數(shù)在直徑為6 mm的ITO電極上聚合相同厚度PPy/RGD復(fù)合膜(聚合電量為28.7 mC)，70%乙醇浸泡5 min消毒，無(wú)菌去離子水沖洗，干燥待用。將100 μL A549細(xì)胞懸液(5.0×104cells/mL)接種在含PPy/ RGD復(fù)合膜測(cè)量小池內(nèi)，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃，5% CO2)靜置2 h，細(xì)胞在小池底部PPy/RGD膜的粘附形態(tài)通過(guò)倒置光學(xué)顯微鏡(IX71，奧林巴斯)觀察，CCD相機(jī)拍照;A549細(xì)胞接種在PPy/RGD膜表面培養(yǎng)12 h待細(xì)胞完全鋪展，PBS沖洗1次后用4%多聚甲醛溶液室溫固定10 min，細(xì)胞鋪展的三維形態(tài)學(xué)通過(guò)VK－150形狀測(cè)量激光顯微鏡(基恩士，日本)觀察;同時(shí)，細(xì)胞粘附力強(qiáng)度通過(guò)細(xì)胞沖洗實(shí)驗(yàn)量化。流程如下:A549細(xì)胞在PPy/RGD膜表面培養(yǎng)12 h，用2 μmol/L Calcein AM(Molecular probes公司，美國(guó))對(duì)細(xì)胞熒光染色拍照，隨后用新鮮培養(yǎng)液充分沖洗PPy/RGD膜表面去除未粘附和弱粘附細(xì)胞，拍照。細(xì)胞粘附強(qiáng)度通過(guò)計(jì)算沖洗前后相同大小視野下殘留細(xì)胞數(shù)比值進(jìn)行量化。細(xì)胞鋪展和粘附實(shí)驗(yàn)以裸ITO電極和PSS/PPy作為對(duì)照。

A549細(xì)胞在PPy/RGD膜界面上的增殖行為通過(guò)WST－8實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)。流程如下:100 μL A549細(xì)胞懸液(2.0×104cells/mL)分別接種在含PPy/RGD膜和PPy/PSS膜的測(cè)量小池內(nèi)，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h和48 h，隨后加入10 μL WST－8分析液(碧云天生物技術(shù)公司)，輕搖混勻，37℃孵育1 h，分別取測(cè)量小池內(nèi)溶液 100 μL，多功能酶標(biāo)儀(Varioskan，Thermo Scientific)測(cè)定溶液在450 nm的吸光度，以650 nm作為參考波長(zhǎng)，溶液吸光值與細(xì)胞數(shù)量和活性成正比關(guān)系。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)96孔板聚苯乙烯表面作為對(duì)照。

1.3 細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性電化學(xué)阻抗測(cè)量分析

將100 μL的A549細(xì)胞懸液以濃度為2.0×104cells/mL加入含PPy/RGD-ITO微電極的測(cè)量小池內(nèi)，室溫下靜置30 min使細(xì)胞均勻沉降到微電極表面后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)2 h、24 h和48 h后將測(cè)量小池裝置取出，PBS沖洗電極去掉死細(xì)胞及未粘附細(xì)胞。同時(shí)，將100 μL的A549細(xì)胞加載到含PPy/PSS-ITO微電極的測(cè)量小池作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照，將空白細(xì)胞培養(yǎng)液加載含PPy/RGD-ITO微電極的測(cè)量小池作為空白對(duì)照。隨后，在測(cè)量小池內(nèi)加入500 μL 0.01 mol/L PBS作為支持電解質(zhì)，將鉑絲對(duì)電極和Ag/AgCl參比電極插入測(cè)量小池進(jìn)行電化學(xué)阻抗譜測(cè)量。電化學(xué)阻抗譜測(cè)量在開(kāi)路電壓下對(duì)傳感電極施加幅值為10 mV的正弦波交流檢測(cè)信號(hào)，檢測(cè)信號(hào)掃描頻率范圍為1 Hz～105Hz，阻抗譜測(cè)量數(shù)據(jù)用ZView 2.0軟件建立等效電路后擬合分析。

為進(jìn)行天然抗癌藥物重樓皂苷I對(duì)A549細(xì)胞的細(xì)胞毒性量化分析，首先按上述相同方法將100 μL A549細(xì)胞(1.0×105cells/mL)接種在PPy/RGDITO微電極上培養(yǎng)24 h，隨后將接種了細(xì)胞的微電極分為兩組，以加入100 μL不同濃度重樓皂苷I溶液的電極作為實(shí)驗(yàn)組，加入不含重樓皂苷I的細(xì)胞培養(yǎng)液的電極作為對(duì)照組，孵育12 h后測(cè)量實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組電極系統(tǒng)的電化學(xué)阻抗譜，細(xì)胞毒性定義為:(1－Zt/Zc)×100%，其中Zt為實(shí)驗(yàn)組電極阻抗譜上阻抗改變最大值，Zc為對(duì)照組阻抗值。作為比較，重樓皂苷I對(duì)A549細(xì)胞細(xì)胞毒性通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和傳統(tǒng)96孔板的WST－8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)試，WST－8實(shí)驗(yàn)測(cè)量的細(xì)胞毒性定義為:(1－ODt/ODc) ×100%。其中，ODt為實(shí)驗(yàn)組溶液在450 nm的吸光度，而ODc為對(duì)照組溶液在450 nm的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 PPy/RGD-ITO微電極加工和表征

PPy/RGD復(fù)合膜在ITO微電極表面電聚合采用電化學(xué)恒電位技術(shù)，該技術(shù)一方面可通過(guò)設(shè)置聚合電量控制聚合PPy膜的厚度，另一方面可通過(guò)監(jiān)測(cè)聚合過(guò)程中電流－時(shí)間曲線分析PPy聚合動(dòng)力學(xué)過(guò)程［24］。PPy/RGD和PPy/PSS在+0.7 V(vs.Ag/ AgCl)聚合電壓下監(jiān)測(cè)的電流－時(shí)間曲線如圖1(b)所示。結(jié)果顯示，隨著聚合時(shí)間延長(zhǎng)，聚合電流值逐漸增大，該結(jié)果說(shuō)明聚合的PPy膜具有優(yōu)良的導(dǎo)電性，聚吡咯在電極表面不斷沉積增大了電極活性面積［25］。此外，PPy/RGD聚合電流值小于PPy/PSS聚合電流值，其原因推測(cè)與RGD多肽分子的不良導(dǎo)電性和弱電解質(zhì)特征有關(guān)。因此，在聚合相同電量情況下，PPy/RGD比PPy/PSS需要更長(zhǎng)的聚合時(shí)間。在本研究中，由于聚合溶液只含 Py單體和RGD多肽，因此聚合溶液中呈負(fù)電荷的RGD分子作為吡咯電聚合過(guò)程中唯一摻雜劑平衡PPy骨架上的正電荷，從而形成PPy/RGD復(fù)合膜。如果聚合溶液只含Py單體，施加+0.7 V聚合電壓則無(wú)電流產(chǎn)生，說(shuō)明PPy未能發(fā)生電聚合，提示RGD多肽分子是Py電聚合必須的唯一摻雜劑并參與形成PPy/RGD復(fù)合膜?？瞻譏TO微電極、PPy/RGD-ITO微電極和PPy/PSS-ITO微電極放大圖像如圖1(b)插圖所示，說(shuō)明在ITO微電極表面成功制備出PPy/ RGD復(fù)合物，且PPy/RGD膜與PPy/PSS膜在ITO微電極表面均勻分布，顏色呈灰褐色。

圖1 PPy/RGD-ITO微電極制備

PPy/RGD復(fù)合膜的制備進(jìn)一步通過(guò)FTIR進(jìn)行確認(rèn)。圖2為PPy/PSS和PPy/RGD膜的FTIR光譜。其中，PPy/PSS的 FTIR光譜上 1 548 cm－1，1 458 cm－1及1 046 cm－1波數(shù)的吸收峰為PPy環(huán)上的C—C，C—N和C—H的伸縮振動(dòng)吸收峰［26］。與PPy/PSS相比，PPy/RGD膜 FTIR上明顯增加了1 290 cm－1吸收峰，該波數(shù)吸收峰對(duì)應(yīng)了RGD多肽的酰胺Ⅱ的特征峰［27］，該結(jié)果提示RGD多肽分子成功地?fù)诫s進(jìn)PPy膜內(nèi)形成PPy/RGD復(fù)合膜。

表面拓?fù)湫蚊病⒋植诙群蜐駶?rùn)性是生物材料重要參數(shù)，影響著生物材料的細(xì)胞生物相容性。圖3為電聚合PPy表面AFM二維圖像和三維圖像。結(jié)果顯示PPy/PSS和PPy/RGD膜由直徑約為50 nm的粒子串聯(lián)而成，呈結(jié)節(jié)狀油菜花結(jié)構(gòu)，與文獻(xiàn)報(bào)道的電化學(xué)聚合PPy表面拓?fù)湫蚊步Y(jié)果相似［28］。

圖2 PPy/PSS和PPy/RGD膜的FTIR光譜

根據(jù)AFM圖像分析結(jié)果顯示，PPy/PSS膜表面粗糙度Ra為(23.4±1.22)nm(n=3)，PPy/RGD膜表面粗糙度Ra為(5.24±0.8)nm(n=3)，說(shuō)明兩種PPy膜均具有低粗糙度(＜100 nm)表面，有利于粘附細(xì)胞的固定和增殖［29］。此外，在相同的電聚合條件下，PPy/RGD膜比PPy/PSS膜具有更緊湊和粗糙度更低的表面，其原因還不清楚，推測(cè)與RGD多肽空間結(jié)構(gòu)、電荷分布及RGD多肽與聚吡咯骨架相互作用有關(guān)。PPy膜的濕潤(rùn)性通過(guò)采用5 μL去離子水的座滴法分析，結(jié)果顯示PPy/RGD膜的靜態(tài)接觸角為(48.6±0.5)°(n=3)，略為高于PPy/PSS膜的靜態(tài)接觸角為(32.6±0.8)°(n=3)，但PPy/RGD膜仍呈現(xiàn)足夠的親水性能促進(jìn)細(xì)胞粘度和增殖［30］。

圖3 不同摻雜PPy膜AFM圖像

2.2 PPy/RGD膜細(xì)胞生物相容性評(píng)價(jià)

貼壁細(xì)胞在體外培養(yǎng)環(huán)境下其增殖行為常分為3個(gè)階段，即細(xì)胞在適宜基底表面發(fā)生粘附、鋪展和增殖。因此，本研究以人肺癌上皮細(xì)胞株A549為模型，以細(xì)胞鋪展、粘附與增殖行為對(duì)PPy/RGD復(fù)合物細(xì)胞生物相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。圖4(a)為A549細(xì)胞接種在PPy/RGD膜、PPy/PSS膜和裸ITO電極表面2 h后相差顯微圖。從該圖可見(jiàn)，PPy/RGD膜和PPy/PSS膜表面大部分A549細(xì)胞完成粘附并伸出偽足開(kāi)始鋪展，而裸ITO電極上粘附細(xì)胞大部分保持圓形。此外，PPy/RGD膜和PPy/PSS膜間鋪展的A549細(xì)胞比例無(wú)明顯差異，說(shuō)明電聚合的PPy膜可促進(jìn)A549細(xì)胞粘附，為細(xì)胞下一步鋪展增殖提供良好的生物界面。A549細(xì)胞接種在不同基底表面12 h后細(xì)胞鋪展三維形態(tài)圖和圖4(b)，結(jié)果顯示3種基底表面上A549細(xì)胞均呈鋪展?fàn)顟B(tài)，且伸出偽足，提示3種基底表面均支持細(xì)胞鋪展。但相比裸ITO和PPy/PSS膜基底表面細(xì)胞的相對(duì)圓形三維形態(tài)，PPy/RGD膜上細(xì)胞呈伸長(zhǎng)三維鋪展形態(tài)，提示PPy/RGD膜具有最好的細(xì)胞粘附鋪展能力。進(jìn)一步，A549細(xì)胞與基底表面的粘附強(qiáng)度通過(guò)細(xì)胞沖洗實(shí)驗(yàn)進(jìn)行量化，不同基底表面沖洗后殘留細(xì)胞熒光圖如圖4(c)所示。結(jié)果顯示PPy/RGD膜上A549細(xì)胞殘留率(88.2±5.6)(n=3)，高于PPy/ PSS膜上A549細(xì)胞殘留率(72.6±8.4)(n=3)和裸ITO表面A549細(xì)胞殘留率(48.6±12.8)(n=3)，說(shuō)明PPy/RGD在電極表面的修飾可進(jìn)一步改善細(xì)胞粘附固定能力。

圖4 PPy膜生物相容性

A549細(xì)胞在不同基底的增殖活性通過(guò)WST－8實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分析。圖5為培養(yǎng)在PPy/RGD膜、PPy/ PSS和聚苯乙烯表面24 h和48 h時(shí)A549細(xì)胞相對(duì)活性。結(jié)果顯示培養(yǎng)在兩類(lèi)PPy膜上的細(xì)胞相對(duì)增殖率均高于聚苯乙烯基底，說(shuō)明PPy膜表面有利于細(xì)胞增殖，該結(jié)果與上述細(xì)胞粘附和鋪展實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合，同時(shí)與其他文獻(xiàn)報(bào)道［11，31］的結(jié)果吻合。此外，PPy/RGD膜上A549細(xì)胞增殖率高于PPy/PSS膜，說(shuō)明PPy/RGD膜具有最優(yōu)的促進(jìn)A549細(xì)胞增殖的能力。除此之外，我們實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPy/RGD膜還支持人血管內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926、人膀胱癌細(xì)胞株T24及人前列腺細(xì)胞株P(guān)C－3的增殖(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未給出)，進(jìn)一步說(shuō)明制備的PPy/RGD復(fù)合膜的生物相容性具有細(xì)胞類(lèi)型普適性。

圖5 A549細(xì)胞相對(duì)增殖率

2.3 PPy/RGD-ITO微電極上A549細(xì)胞粘附增殖電化學(xué)阻抗檢測(cè)和分析

細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)信息電化學(xué)阻抗檢測(cè)采用了類(lèi)似電子細(xì)胞基底阻抗傳感技術(shù)ECIS(Electric Cell-Substrate Impedance Sensing)［1］。在本研究中，我們以制備的具有良好仿生性能的PPy/RGD-ITO微電極代替?zhèn)鹘y(tǒng)ECIS技術(shù)使用的金微電極作為傳感電極，對(duì)A549細(xì)胞的粘附和增殖行為學(xué)信息進(jìn)行檢測(cè)。圖6(a)為PPy/RGD-ITO微電極上接種A549細(xì)胞0 h、2 h、24 h、48 h時(shí)電極系統(tǒng)典型的電化學(xué)阻抗譜復(fù)平面圖。結(jié)果顯示A549細(xì)胞的粘附與增殖導(dǎo)致傳感電極系統(tǒng)阻抗譜高頻區(qū)域形成半圓，且隨著接種時(shí)間的增加高頻區(qū)傳荷過(guò)程控制的特征半圓直徑增大。該結(jié)果說(shuō)明A549細(xì)胞的粘附增殖導(dǎo)致電極界面上離子電荷轉(zhuǎn)移過(guò)程速度減慢和電子轉(zhuǎn)移阻抗增大，其原因與電極表面細(xì)胞質(zhì)膜的電容特征和離子導(dǎo)通性有關(guān)［13］。同時(shí)，空白對(duì)照PPy/RGD-ITO微電極在培養(yǎng)液中孵育后未出現(xiàn)傳荷控制特征半圓，如圖6(b)所示，說(shuō)明PPy/RGDITO微電極在培養(yǎng)液中具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)提示圖6(a)中半圓的形成和直徑增大是由A549細(xì)胞粘附增殖引起。

圖6 PPy/RGD-ITO微電極上A549細(xì)胞增殖行為的電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)

A549細(xì)胞的粘附增殖行為進(jìn)一步采用等效電路模型進(jìn)行量化分析。PPy/RGD-ITO微電極采用溶液電阻(Rs)和常相位元件(CPE)的串聯(lián)電路進(jìn)行擬合，該等效電路可對(duì)0 h時(shí)PPy/RGD-ITO微電極阻抗譜數(shù)據(jù)很好地?cái)M合，擬合元件值如圖6(c)所示。細(xì)胞等效電路則由一個(gè)RC并聯(lián)電路和一個(gè)R元件串聯(lián)組成［32］。因此，接種細(xì)胞后電極系統(tǒng)的等效電路模型由PPy/RGD-ITO微電極和細(xì)胞等效電路模型串聯(lián)而成，如圖6(c)所示。其中，R's解釋為細(xì)胞－電極間隙電阻，Rcell解釋為細(xì)胞－細(xì)胞間電阻，Ccell解釋為細(xì)胞質(zhì)膜的電容效應(yīng)。采用非線性最小二乘法對(duì)電化學(xué)阻抗譜數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合得到接種不同時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞等效電路各元件的擬合值變化曲線，如圖6(d)所示。結(jié)果顯示，隨著A549細(xì)胞在PPy/RGD-ITO微電極表面粘附和增殖，Ccell值在2 h～24 h逐漸增大，隨后穩(wěn)定(24 h～48 h)在8.9 nF～9.3 nF，略高于A549細(xì)胞在PPy/PSS-ITO微電極表面的7.6 nF～8.8 nF。Ccell值變化與細(xì)胞粘附增殖過(guò)程中細(xì)胞厚度降低、鋪展面積增大、細(xì)胞離子通道數(shù)量和開(kāi)閉有關(guān)［33］。A549細(xì)胞在PPy/RGDITO微電極表面R`s值逐漸增大，在48h達(dá)到最大值312 Ω，提示A549細(xì)胞增殖過(guò)程中與電極表面間間隙縮小，細(xì)胞粘附強(qiáng)度不斷增強(qiáng)［33］。同時(shí)，PPy/ RGD-ITO微電極表面R's值高于PPy/PSS-ITO微電極，提示A549細(xì)胞與PPy/RGD-ITO微電極間粘附強(qiáng)度高于A549細(xì)胞與PPy/PSS-ITO微電極，該結(jié)果與上述細(xì)胞沖洗實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。此外，A549細(xì)胞在PPy/RGD-ITO微電極和PPy/PSS-ITO微電極隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)Rcell值逐漸增大，Rcell值持續(xù)增加說(shuō)明細(xì)胞－細(xì)胞間的間隙逐漸縮小，細(xì)胞融合度增加［34］。值得注意的是，A549細(xì)胞在 PPy/RGDITO微電極的 Rcell值在24 h和48 h高于 PPy/ PSS-ITO微電極，說(shuō)明A549細(xì)胞在PPy/RGD-ITO微電極表面細(xì)胞融合速度快于PPy/PSS-ITO微電極，該結(jié)果與前述WST－8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)吻合，也進(jìn)一步提示本文發(fā)展的細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)信息檢測(cè)方法的合理性。

2.4 重樓皂苷I的A549細(xì)胞毒性電化學(xué)阻抗檢測(cè)

重樓皂苷I是一種從百合科植物南重樓和北重樓根莖中萃取的含甾體皂苷的小分子單體，研究證實(shí)其對(duì)非小細(xì)胞肺癌具有顯著的抗癌效應(yīng)［35］。為驗(yàn)證本文發(fā)展的基于PPy/RGD-ITO微電極的細(xì)胞行為學(xué)信息檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)以PPy/RGD-ITO微電極作為傳感器電極，利用電化學(xué)阻抗譜技術(shù)對(duì)重樓皂苷I的A549細(xì)胞毒性進(jìn)行量化分析。圖7(a)為不同濃度重樓皂苷I對(duì)PPy/RGD-ITO微電極表面培養(yǎng)的A549細(xì)胞處理12 h后電極系統(tǒng)典型的阻抗頻率曲線。結(jié)果顯示，隨著重樓皂苷I濃度逐漸增加，電極系統(tǒng)的阻抗值逐漸減低，推測(cè)與重樓皂苷I誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，電極表面的A549細(xì)胞質(zhì)膜收縮和細(xì)胞脫落有關(guān)。其中，在頻率為3.5 kHz處，阻抗值變化最為明顯，說(shuō)明檢測(cè)頻率為3.5 kHz時(shí)傳感電極對(duì)細(xì)胞凋亡響應(yīng)靈敏度最高，因此可通過(guò)檢測(cè)3.5 kHz頻率對(duì)應(yīng)的阻抗值變化實(shí)現(xiàn)對(duì)重樓皂苷I細(xì)胞毒性的定量分析。電化學(xué)阻抗檢測(cè)結(jié)果通過(guò)傳統(tǒng)WST－8比色法和顯微鏡形態(tài)學(xué)觀察方法進(jìn)行驗(yàn)證。重樓皂苷I濃度與細(xì)胞毒性和細(xì)胞形態(tài)學(xué)之間的關(guān)系分別如圖7(b)和圖7(c)所示，結(jié)果顯示呈凋亡形態(tài)的A549細(xì)胞數(shù)量隨重樓皂苷I濃度增加而增加，同時(shí)電化學(xué)阻抗技術(shù)檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的WST－8比色分析結(jié)果趨勢(shì)吻合。然而，兩種方法檢測(cè)結(jié)果間仍存在微小差異，其原因推測(cè)與細(xì)胞培養(yǎng)基底(PPy/RGDvs.聚苯乙烯)以及檢測(cè)機(jī)制(形態(tài)學(xué)vs.線粒體脫氫酶活性)不同造成。因此，為了獲得更可靠結(jié)果，需要嚴(yán)格設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組、平行組及質(zhì)量控制。盡管如此，相比傳統(tǒng)光學(xué)分析方法，本文發(fā)展的基于PPy/RGD-ITO微電極的電化學(xué)阻抗檢測(cè)方法具有無(wú)侵襲性、低成本(不需要昂貴的設(shè)備和試劑)及高準(zhǔn)確性(RSD＜5%vs.RSD＜10%)等優(yōu)點(diǎn)。

圖7 重樓皂苷I的A549細(xì)胞毒性電化學(xué)阻抗檢測(cè)

3 結(jié)論

本研究以含RGD多肽序列作為摻雜劑，通過(guò)簡(jiǎn)單的電化學(xué)共聚合方式在ITO微電極表征可控沉積PPy/RGD復(fù)合物制備出PPy/RGD-ITO微電極。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PPy/RGD復(fù)合膜具有良好的生物相容性及仿生性，能促進(jìn)A549細(xì)胞鋪展、粘附與增殖。在此基礎(chǔ)上，以PPy/RGD-ITO微電極作為傳感電極，通過(guò)電化學(xué)阻抗譜技術(shù)首先分析了A549細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)信息，解析了細(xì)胞粘附與增殖過(guò)程中細(xì)胞質(zhì)膜電容、細(xì)胞間融合度及細(xì)胞－電極結(jié)合度的變化信息。其次量化分析了重樓皂苷I的細(xì)胞毒性，且檢測(cè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)檢測(cè)和傳統(tǒng)的WST－8比色法結(jié)果相吻合。綜上，本研究不但提出了將生物活性分子直接摻雜進(jìn)聚吡咯構(gòu)建具有生物活性的傳感電極表面，而且發(fā)展的基于PPy/RGD-ITO微電極細(xì)胞行為學(xué)信息阻抗檢測(cè)方法未來(lái)可作為一種體外細(xì)胞分析新工具，應(yīng)用在藥物篩選、細(xì)胞病理生理學(xué)機(jī)制及細(xì)胞－導(dǎo)電聚吡咯材料間相互作用等研究領(lǐng)域。

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李 遠(yuǎn)(1985－)，男，重慶醫(yī)科大學(xué)，博士，主要研究方向?yàn)槲⒘骺匦酒凹?xì)胞生物傳感器，liyuan_1985999@163.com;

劉北忠(1970－)，男，重慶醫(yī)科大學(xué)，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樯镝t(yī)學(xué)微納米技術(shù)與系統(tǒng)、腫瘤分子診療靶點(diǎn)篩選等，lbzemail@163.com。

Construction of a Biomimetic Microelectrode Based on RGD Peptide/Polypyrrole-Indium Tin Oxide for Detecting Cell Biology Behaviors by Electrochemical Impedance Spectroscopy*

LI Yuan1，XIAO Wenhai2，CHEN Jing1，LIAO Juan1，LIU Beizhong1*
(1.Central Laboratory of Yongchuan Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 402160，China; 2.DAZU Chinese Medical Hospital，Chongqing 402360，China)

For fabricating an indium tin oxide(ITO)microelectrode modified with RGD peptide doped polypyrrole (PPy/RGD-ITO)and using it as sensing electrode for detecting cell biology behaviors by electrochemical impedance spectroscopy.The ITO microelectrode was firstly fabricated by etching the insulating layer of photosensitive dry film with lithography technology.Then the PPy/RGD composite was deposited on the surface of the ITO microelectrode by electrochemical copolymerization using the peptide contained RGD motif as the sole dopant to form the PPy/ RGD-ITO microelectrode.The surface topology morphology，wettability and composition of the resulted PPy/RGD composite film were characterized by atomic force microscope(AFM)，contact angle measurement instrument and fourier transform infrared spectrometer(FTIR)respectively.The human lung cancer A549 cells spreading，adhesion and proliferation experiments were conducted to investigate the interaction between the PPy/RGD composite with cells.Used the PPy/RGD-ITO microelectrode as sensing electrode，A549 cells adhesion and proliferation，as well as the cytotoxicity of Polyphyllin I，a well-known natural anti-cancer molecule，were analyzed by electrochemical impedance spectroscopy.Resulted showed that the RGD molecule was doped into the PPy matrix successfully through the facile electrochemical copolymerization and the resulted PPy/RGD composite film has excellent surface physical properties.The RGD molecule doped into the PPy matrix retained its biology activity and promoted A549 cells spreading，adhesion and proliferation when compared with bare ITO electrode and poly(4-styrene sulfonate) (PSS)doped PPy film.Finally，as the morphological change of A549 cells on the surface of PPy/RGD-ITO microelectrode would change the impedance spectrum characteristics of the electrode system，the information about A549 cells during the process of adhesion and proliferation as well as the quantitative cytotoxicity of Polyphyllin I could be obtained by the electrochemical impedance technology.Therefore，the PPy/RGD film prepared by doping the RGD molecule into the PPy through the facile electrochemical copolymerization showed excellent biocompatibility.In future，the PPy/RGD film could be used as the coupling interface between electronic system and biological cell system and for researching the cellular bio-behaviors and drug screening.

electrochemical impedance detection;RGD peptide;polypyrrole;Indium tin oxide;cell proliferation; cytotoxicity

C:7230J

10.3969/j.issn.1004－1699.2017.02.002

TP212.3

A

1004－1699(2017)02－0174－10

項(xiàng)目來(lái)源:重慶市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(cstc2012jjA10046);重慶市衛(wèi)生局中醫(yī)藥科技項(xiàng)目(ZY20132132);重慶市永川區(qū)創(chuàng)新能力建設(shè)平臺(tái)項(xiàng)目(Ycstc2014bf5001);重慶市大足區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目(DZKJ，2014ACC1084);重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院院級(jí)研究項(xiàng)目(YJZD201302，YJZQN201534)

2016－07－22 修改日期:2016－09－22

摘 要:構(gòu)建一種基于RGD多肽分子摻雜聚吡咯膜修飾的銦錫氧化物微電極(PPy/RGD-ITO)，并以此作為傳感電極實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)行為的電化學(xué)阻抗譜檢測(cè)。采用光刻技術(shù)蝕刻感光干膜絕緣層制備ITO微電極;以含RGD模體的多肽分子作為吡咯電聚合唯一的摻雜陰離子，通過(guò)電化學(xué)共聚合方式在ITO微電極表面沉積PPy/RGD復(fù)合膜形成PPy/RGD-ITO微電極;原子力顯微鏡(AFM)、接觸角測(cè)量?jī)x和傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)分別表征PPy/RGD復(fù)合膜的表面拓?fù)湫蚊?、濕?rùn)性和組成成分;人肺癌細(xì)胞株A549鋪展、粘附及增殖實(shí)驗(yàn)考察了PPy/RGD復(fù)合膜與細(xì)胞間的相互作用;以構(gòu)建的PPy/RGD-ITO微電極作為傳感電極，通過(guò)電化學(xué)阻抗譜技術(shù)對(duì)A549細(xì)胞粘附增殖行為及天然抗癌藥物分子重樓皂苷I的細(xì)胞毒性進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，通過(guò)簡(jiǎn)單的電化學(xué)共聚合成功將RGD分子摻雜進(jìn)PPy膜內(nèi)，且PPy/RGD復(fù)合膜具有優(yōu)異的表面物理性能;PPy基質(zhì)膜內(nèi)摻雜的RGD分子保留其生物活性，相比裸ITO電極和聚4－苯乙烯磺酸鈉(PSS)摻雜的PPy膜，PPy/RGD復(fù)合膜能更好地促進(jìn)A549細(xì)胞的鋪展、粘附和增殖;由于PPy/RGD-ITO微電極表面A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化可改變電極系統(tǒng)的阻抗譜特征，因此通過(guò)電化學(xué)阻抗譜技術(shù)可解析A549細(xì)胞粘附增殖行為學(xué)信息，同時(shí)可定量分析重樓皂苷I細(xì)胞毒性。因此，通過(guò)簡(jiǎn)單的電化學(xué)共聚合方法將生物活性RGD分子摻雜進(jìn)PPy膜內(nèi)制備出的PPy/RGD膜具有優(yōu)良的生物相容性，可作為一種重要的仿生電極修飾材料用于構(gòu)建電子系統(tǒng)和細(xì)胞生物學(xué)系統(tǒng)的耦合界面，未來(lái)可應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)行為及藥物篩選研究。