陳紅紅，蔡紅，譚華

阿莫西林克拉維酸鉀亞最低殺菌濃度體外誘導細菌耐藥試驗研究

陳紅紅1，蔡紅1，譚華2

（1.南昌市第一醫(yī)院藥劑科，江西 南昌 330000；2.鷹潭市人民醫(yī)院鐵路分院檢驗科，江西 鷹潭 335000）

目的 探討阿莫西林克拉維酸鉀最低殺菌濃度體外誘導細菌耐藥試驗研究。方法 將金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213作為研究對象，將阿莫西林克拉維酸鉀作為抗菌藥物，檢測方法是以微量稀釋法來定量測定經(jīng)過特定誘導天數(shù)時的MBC值，用1/2MBC濃度來對金黃色葡萄球菌進行多步體外誘導試驗共34天，并對試驗結(jié)果金黃色葡萄球菌株MBC的變化進行記錄，使用全自動微生物藥敏鑒定儀來分析誘導后金黃色葡萄球菌株進行阿莫西林克拉維酸鉀耐藥性試驗結(jié)果。結(jié)果 金黃色葡萄球菌標準菌株的MBC值經(jīng)過阿莫西林克拉維酸鉀體外誘導試驗，在第9天時MAC值明顯升高，在經(jīng)過34天誘導后MBC值是標準菌株MBC值的32倍，Pearson相關(guān)系數(shù)顯示亞MBC抗菌藥物時間和標準菌株的耐藥性呈正相關(guān)性（r=0.715，P＜0.001）。誘導出的金黃色葡萄球菌株對阿莫西林克拉維酸鉀藥物100%耐藥。結(jié)論 亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀能夠體外誘導金黃色葡萄球菌耐藥菌株，其耐藥性跟誘導時間成正比。

阿莫西林克拉維酸鉀；亞最低殺菌濃度；體外誘導；細菌耐藥

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標準菌株 金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213，江西省臨床檢驗中心提供金黃色葡萄球菌標準菌株。

1.1.2 抗菌藥物 阿莫西林克拉維酸鉀。規(guī)格1.5 g/支，阿莫西林與克拉維酸鉀比例是4∶1，藥品批號20140316，購自哈爾濱制藥有限公司。

1.1.3 主要試劑及設(shè)備 主要采用M-H肉湯細菌培養(yǎng)液，自行配置，主要成分有酪蛋白17.5 g、淀粉1.5 g、加牛肉湯600 mL、蒸餾水400 mL和50 mL羊血。主要設(shè)備有麥氏標準比濁管，購自北京天安聯(lián)合科技有限公司；DHP-9160型恒溫37℃細菌培養(yǎng)箱，購自山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司。BSC-1100IIA2-X系生物安全柜，購自蘇州長留凈化科技有限公司。VITEK-2 COMPACT全自動藥敏鑒定分析儀和藥敏板條均購自北京蘭伯瑞生物有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌標準菌株液的制備 將金黃色葡萄球菌標準菌株放置在生物安全柜中進行解凍，解凍后，在無菌操作條件下，先將金黃色葡萄球菌標準菌株接種在M-H瓊脂固體培養(yǎng)基上復活，然后再用接種環(huán)挑取少量菌液接種在M-H肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用麥氏標準比濁管稀釋金黃色葡萄球菌至濃度為1×105cfu/mL,作為備用液。

1.2.2 微量稀釋法測定MBC 金黃色葡萄球菌標準菌株MBC值檢測方法采用的是微量稀釋法[5]。

無菌環(huán)境下進行下先用M-H細菌培養(yǎng)液在12×8孔聚苯乙烯無菌微孔培養(yǎng)板中將阿莫西林克拉維酸鉀進行分別的稀釋，再加入金黃色葡萄球菌標準菌株，使阿莫西林克拉維酸 鉀 的 濃 度 為 1 024μg/mL、512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL，而金黃色葡萄球菌標準菌株的終濃度為1×105cfu/mL。在試驗的同時進行空白對照孔和生長對照孔，空白對照孔僅僅是加入M-H細菌培養(yǎng)液，生長對照孔則只有M-H細菌培養(yǎng)液和細菌液，沒有抗菌藥物。放在37℃恒溫細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。再取沒有沉淀渾濁的細菌培養(yǎng)液，按照三線法操作方法接種在M-H瓊脂固體培養(yǎng)基上，繼續(xù)37℃恒溫細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察是否有細菌生長。低劑量抗菌誘導后細菌的會有耐藥性的發(fā)生，將M-H瓊脂固體培養(yǎng)基上沒有細菌生長的抗生素最小濃度作為MBC。根據(jù)此方法進行細菌耐藥性發(fā)生的MBC，試驗對同一個菌株進行5次平行試驗，其中MBC值全部發(fā)生變化，最終結(jié)果才能確定耐藥性誘導后的金黃色葡萄球菌株MBC值。

1.2.3 多步驟誘導耐藥菌株的建立 將依據(jù)上述方法檢測到金葡菌標準菌株的MBC值，記錄為MBC0。然后取10μL金葡菌標準菌株備用液加到5.0 mL M-H液態(tài)培養(yǎng)基中，加入阿莫西林克拉維酸鉀濃度是0.5 MBC0，放置在37℃恒溫細菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，檢測誘導后葡萄球菌標準菌株MBC值，如果測出來的MBC值不改變的話，阿莫西林克拉維酸鉀濃度也不需要改變，繼續(xù)培養(yǎng)并測定標準菌株的MBC值，對比數(shù)據(jù)觀察MBC值是否有變化。經(jīng)過多次誘導培養(yǎng)細菌后金黃色葡萄球菌標準菌株發(fā)生變化，為MBC1，加入阿莫西林克拉維酸鉀濃度則為0.5 MBC1，繼續(xù)培養(yǎng)誘導并檢測MBC值，金黃色葡萄球菌標準菌株再次發(fā)生變化，為MBC2,稀釋抗菌藥物濃度為0.5 MBC2，按照此種方法連續(xù)進行34 d的誘導試驗進行，記錄好金黃色葡萄球菌標準菌株MBC值以及變化趨勢誘導所需時間。

1.2.4 耐藥菌株的鑒定 按照本研究方法誘導的耐藥菌株在M-H液態(tài)培養(yǎng)基（不含任何抗菌藥物）中培養(yǎng)，再細菌穩(wěn)定傳代3次后，采用麥氏標準比濁管將傳代菌液配置濃度為1×105cfu/mL，采取VITEK-2 COMPACT全自動藥敏鑒定分析儀進行檢測。重復10次的測試觀察對阿莫西林克拉維酸鉀是否耐藥，并與誘導前金葡菌標準菌株耐藥性進行比較。

2 結(jié)果

2.1 阿莫西林克拉維酸鉀MBC誘導時間與耐藥性的觀察初始阿莫西林克拉維酸鉀MBC0值為2.0μg/mL，經(jīng)過濃度為1.0μg/mL阿莫西林克拉維酸鉀的誘導9 d后，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌標準菌株發(fā)生變化，升到了4.0μg/mL（MBC1）。在11 d時開始用濃度為2.0μg/mL阿莫西林克拉維酸鉀的誘導，在誘導19 d的時候，發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌標準菌株發(fā)生變化，升到了8.0μg/mL（MBC2）。開始從第20天濃度為4.0μg/mL抗菌藥物的誘導，繼續(xù)誘導到25 d時可發(fā)現(xiàn)標準菌株發(fā)生了變化，升到了16.0μg/mL（MBC3）。繼續(xù)增加阿莫西林克拉維酸鉀誘導劑濃度，在31 d和34 d時黃色葡萄球菌標準菌株發(fā)生變化，分別升到了32.0μg/mL（MBC4）和64.0μg/mL（MBC5）。實驗結(jié)果可以清楚看到隨著亞MBC抗菌藥物誘導時間的不斷增加，金葡菌標準菌株耐藥性也相應(yīng)增大，經(jīng)過34 d的亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀誘導，金黃色葡萄球菌標準菌株耐藥性增加了32倍。Pearson相關(guān)系數(shù)顯示亞MBC抗菌藥物時間和標準菌株的耐藥性呈正相關(guān)性（r=0.715，P＜0.001）。

2.2 經(jīng)過亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀誘導的耐藥菌株對阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥率 本實驗經(jīng)過亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀誘導出金黃色葡萄球菌傳代菌的耐藥性，通過VITEK-2 COMPACT全自動藥敏鑒定分析儀檢測發(fā)現(xiàn)對阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥率為100%，而未經(jīng)誘導的金黃色葡萄球菌菌株耐藥率為0%。

3 討論

臨床上細菌感染患者通過不合理使用抗菌藥物會導致細菌的耐藥性不斷增加。不合理藥物使用主要有抗菌藥種類和抗菌藥物劑量的濫用，這些不合理的藥物使用導致了細菌耐藥性產(chǎn)生[6]。臨床患者感染的細菌產(chǎn)生耐藥性問題已經(jīng)引起了社會廣泛的重視，超級耐藥菌的產(chǎn)生對抗菌藥物臨床療效也產(chǎn)生了嚴重的影響[7]。透徹研究細菌產(chǎn)生耐藥性的機制，可以為臨床抗菌藥物的使用及防止細菌發(fā)生耐藥性提供臨床依據(jù)。金黃色葡萄球菌標準菌株常用于微生物臨床試驗的細菌藥敏研究，其對多種的抗菌藥物有高度敏感性或耐藥性[8]。在臨床試驗中，可以將抗菌藥物突變選擇窗作為臨床上選擇抗菌藥物治療劑量選擇的一個重要依據(jù)。況且研究表明臨床上細菌出現(xiàn)耐藥性現(xiàn)象，并不是突變導致的，而是一個慢慢積累的過程，從而導致細菌對抗菌藥物敏感演變?yōu)槟退嶽9-10]。

本研究采用微量稀釋法測定阿莫西林克拉維酸鉀MBC值，多步驟誘導建立耐藥菌株。實驗結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌標準菌株耐藥性與亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀誘導時間呈時間依賴性關(guān)系，經(jīng)過34天的亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀誘導，金黃色葡萄球菌標準菌株耐藥性增加了32倍。而Pearson相關(guān)系數(shù)顯示亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀時間和標準菌株的耐藥性呈正相關(guān)性。經(jīng)過誘導的耐藥菌株對阿莫西林克拉維酸鉀的耐藥率為100%，而未經(jīng)誘導的金黃色葡萄球菌菌株耐藥率為0%。經(jīng)本實驗研究可知，長期使用低劑量的抗菌藥就會發(fā)生細菌耐藥性，使抗菌藥失去本有的作用，為了盡量避免此類事件的發(fā)生，減少細菌耐藥性，因此要對藥劑的使用進行合理控制。

綜上所述，本研究證實亞MBC阿莫西林克拉維酸鉀長時間誘導會導致標準菌株產(chǎn)生耐藥性。因此，臨床要合理使用藥物劑量和時間，以免患者體內(nèi)致病菌產(chǎn)生耐藥性，影響患者治療效果。

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Experimental study on bacterial resistance of amoxicillin and clavulanate potassium in vitro

Chen Hong-hong1,Cai Hong1,Tan Hua2
(1.Department of Pharmacy,Nanchang First Hospital,Nanchang,Jiangxi,330000,China;2.Department of Clinical Laboratory,Yingtan People's Hospital railway,Yingtan,Jiangxi,335000,China)

Objective To investigate the antibiotic resistance of amoxicillin and clavulanate potassium in vitro.Methods The standard strains of Staphylococcus aureus ATCC29213 as the research object,the amoxicillin and clavulanate potassium as antimicrobial agents,the detection method is determined by the specific induction of days when the value of MBC by micro dilution method to quantitative,with the concentration of 1/2 MBC for multi step test for 34 days in vitro of Staphylococcus aureus,and change the test results of Staphylococcus aureus strain MBC were recorded to analyze the induction of Staphylococcus aureus strains of amoxicillin and clavulanate potassium resistance test results using automated microbial susceptibility testing instrument.Results The standard strains of Staphylococcus aureus MBC value after amoxicillin and clavulanate potassium in vitro test in 9 days when the MAC value increased significantly,after 34 days of induction when the MBC value is 32 times the standard strain of MBC,Pearson correlation coefficient showed a positive correlation between sub-MBC antimicrobial drug time and drug resistance(r=0.715,P＜0.001),induced by Staphylococcus aureus strains of amoxicillin and clavulanate potassium 100%drug resistance.Conclusion MBCAmoxicillin clavulanate can induce Staphylococcus aureus resistant strains in vitro,and its drug resistance is proportional to the induction time.

Amoxicillin clavulanate potassium;Minimum bactericidal concentration;In vitro induction;Bacterial resistance

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.36.010

臨床不合理使用抗菌藥物導致細菌的耐藥性不斷增加，細菌產(chǎn)生耐藥性的原因及發(fā)生機制的研究已經(jīng)越來越受到國內(nèi)外研究學者的關(guān)注[1]?？咕幬锓N類和劑量的不合理使用是耐藥性產(chǎn)生的主要原因。相關(guān)研究表明，低濃度抗菌藥物會通過體外誘導使臨床患者感染菌株產(chǎn)生細菌耐藥[2]。在醫(yī)院里，耐甲氧西林和其他抗生素的細菌的廣泛流行，給臨床抗感染治療帶來了很大問題。耐藥性菌除了可以引起機體感染外，還可以通過腸毒素污染食物而引起食物中毒，加重公共衛(wèi)生負擔。金黃色葡萄球菌是感染者患者常見的致病菌之一，它能產(chǎn)生許多不同毒素因子從而使人類感染患病，如殺白細胞素能夠破壞人體內(nèi)的白細胞和巨噬細胞從而導致皮膚軟組織感染、骨髓壞死及壞死性肺炎等[3]。因此選擇金葡菌作為研究對象具有重要的臨床意義。臨床研究證實阿莫西林克拉維酸鉀是臨床常用且有效的抗感染藥物[4]，因此利用阿莫西林克拉維酸鉀亞最低殺菌濃度（mininal bactericidal concentration，MBC）對于標準菌株的體外誘導培養(yǎng)情況來探討MBC抗生素可導致耐藥性的發(fā)生是有臨床意義。雖然國內(nèi)已有相關(guān)研究，但體外誘導的時間和劑量不一，本研究旨在MBC抗生素對于臨床耐藥性發(fā)生提供新的實驗數(shù)據(jù)。