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      木質(zhì)纖維物質(zhì)中纖維素和半纖維素含量的測定

      2017-04-15 03:18張文博賀建龍蔣浩熊鵬
      江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年5期
      關(guān)鍵詞:比色法木糖濾液

      張文博++賀建龍++蔣浩++熊鵬

      摘要:以稻草秸稈為樣品,通過美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)方法水解得到液體成分,采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法測定其五碳糖(5C)和六碳糖(6C)的含量。結(jié)果表明,液體成分中5C和6C達(dá)到一定濃度比例時(shí),會互相干擾測定的準(zhǔn)確度。對已有測定纖維素、半纖維素含量的方法進(jìn)行綜合應(yīng)用并加以改進(jìn),分析測定液體中5C和6C在不同波長下互不干擾的最大濃度和可測范圍。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在620 nm波長下準(zhǔn)確測定水解液中6C含量時(shí),要同時(shí)滿足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16;在660 nm波長下準(zhǔn)確測定液體中5C含量時(shí),要同時(shí)滿足[6C]<0.023 3 g/L 和[6C]/[5C]<24。在可測范圍內(nèi),可以通過稀釋法達(dá)到測定要求,此法適用于混合液中5C和6C含量的測定,與高效液相色譜(HPLC)法進(jìn)行對比,測定結(jié)果相對誤差的絕對值小于統(tǒng)計(jì)學(xué)上規(guī)定的5%,表明該法適用于木質(zhì)纖維物質(zhì)中纖維素和半纖維素含量快速、準(zhǔn)確的測定。

      關(guān)鍵詞:美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL);纖維素;半纖維素;稻草秸稈;定量分析

      中圖分類號: TK61文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

      文章編號:1002-1302(2017)05-0281-03

      木質(zhì)纖維素的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素,3種組分含量的多少及變化是木質(zhì)纖維素原料綜合利用的重要依據(jù),因此,準(zhǔn)確測定木質(zhì)纖維素中纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的含量十分必要[1]。目前常用72%濃硫酸法[2]測定木質(zhì)素含量,硫酸與重鉻酸鉀氧化法[3]、硝酸乙醇法[4]、差重法[5]等測定纖維素含量,堿液提取法[6]、2 mol/L鹽酸水解法[7]等測定半纖維素含量,它們的主要缺點(diǎn)是操作復(fù)雜、耗時(shí)長且無法進(jìn)行批量測樣。其中用2 mol/L鹽酸水解半纖維素時(shí),難以控制水解程度,此法僅適用于對比性研究,應(yīng)用領(lǐng)域受到局限[7]。美國國家可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)方法[8]是用72%濃硫酸和4%稀硫酸2步水解樣品,得到濾液,然后用高效液相色譜(HPLC)法測定濾液中的單糖含量,雖然HPLC法測定結(jié)果較準(zhǔn)確,但是單位時(shí)間所測樣品有限,測定速度相對較慢,不適合批量測定。HPLC色譜柱一般采用的基質(zhì)相對脆弱且價(jià)格昂貴,批量測樣會很快損壞色譜柱。為了降低成本,方便、快速地測定木質(zhì)纖維物質(zhì)中纖維素和半纖維素的含量,以稻草秸稈為樣品,先用NREL法處理樣品得到濾液,然后分別用苔黑酚比色法[7]和蒽酮比色法[9]測定濾液中五碳糖(5C)和六碳糖(6C)的含量。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),測定濾液中5C和6C含量時(shí)會出現(xiàn)相互干擾現(xiàn)象,從而影響了測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此本研究考察了濾液中5C和6C在不同波長下互不干擾測定結(jié)果的最大濃度和可測范圍,并與HPLC法[8]的測定結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證。

      1材料與方法

      1.1儀器、試劑與材料

      9FZ-42型系列農(nóng)作物秸稈粉碎機(jī);UV752紫外-可見分光光度計(jì)(上海佑科儀器儀表有限公司);XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌鍋(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司);SHB-3循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠);HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市鴻科儀器廠);分析天平(上海越平科學(xué)儀器有限公司)。

      72% H2SO4溶液[9]:665 mL濃H2SO4(汕頭化工有限公司,分析純)加入300 mL蒸餾水中,冷卻至20 ℃,補(bǔ)加蒸餾水至1 000 mL。苔黑酚試劑[7]:A試劑,0.1 g FeCl3(天津市巴斯夫化工有限公司,分析純)溶于100 mL 37%濃HCl(上海振企化學(xué)試劑有限公司,分析純)中;B試劑,6 g苔黑酚(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)溶于100 mL無水乙醇(天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司)中,現(xiàn)用現(xiàn)配。蒽酮試劑[10]:0.2 g 蒽酮(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純)溶于 100 mL 濃H2SO4(汕頭化工有限公司,分析純)中,現(xiàn)用現(xiàn)配。葡萄糖(天津市大茂化學(xué)試劑廠,分析純);D-木糖(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);所采用的其他試劑按常規(guī)法配制。稻草秸稈:產(chǎn)自江蘇省淮安市,原料粉碎至1~2 cm,80 ℃烘干備用。

      1.2測定方法

      本試驗(yàn)擬定的系統(tǒng)定量分析程序是將NREL法與苔黑酚比色法和蒽酮比色法的綜合應(yīng)用并加以改進(jìn)。以粉碎干燥后的稻草秸稈作為樣品,用72%濃H2SO4和4%稀H2SO4 2步水解樣品,樣品中的纖維素、半纖維素被水解成單糖,然后分別采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法進(jìn)行定量,操作流程如圖1所示[1,10]。

      1.3不同波長下吸收曲線的繪制

      [CM(24]用蒽酮定糖法測定葡萄糖和木糖在不同波長下的吸光

      [FL(2K2]度:取3支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管,其中1支為空白,配制0.05 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.1 g/L木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于另2支試管中,1 mL蒸餾水于空白試管中,再分別加入2 mL蒽酮試劑,混勻,100 ℃下煮沸 5 min,自來水冷卻至室溫,用10 mm玻璃比色皿,分別于 520~700 nm(波長間隔10 nm)波長下測定吸光度,繪制葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在520~700 nm波長下的吸收曲線。

      用苔黑酚比色定糖法測定葡萄糖和木糖在不同波長下的吸光度:取3支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管,其中1支為空白,配制0.02 g/L木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和0.10 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取1 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液于另2支試管中,1 mL蒸餾水于空白試管中,再分別加入2.000 mL A試劑和0.134 mL B試劑,混勻,100 ℃下煮沸20 min,自來水冷卻至室溫,用10 mm玻璃比色皿,于580~760 nm(波長間隔10 nm)波長下測定吸光度,繪制木糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在580~760 nm波長下的吸收曲線。

      2結(jié)果與分析

      2.1混合液中5C和6C之間相互干擾的分析

      用本試驗(yàn)方法測定純凈單糖時(shí),結(jié)果準(zhǔn)確,但實(shí)際上所接觸到的往往是某些糖的混合溶液,例如預(yù)處理稻草秸稈后得到的預(yù)處理液和固體水解液。用本試驗(yàn)方法處理稻草秸稈得到的濾液就是一種同時(shí)存在5C和6C的混合溶液。由圖2和圖3可知,不同濃度的葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一波長下用同一種方法測定時(shí),都會呈現(xiàn)不同的吸光度,也就是說當(dāng)測定濾液中某一單糖的吸光度時(shí),另一種單糖也會有吸光度。因?yàn)槲舛染哂屑雍托?,所?種糖之間必然會存在某種程度的干擾。若濾液中一種單糖的濃度減小,那么所測吸光度也會相應(yīng)減小,當(dāng)該糖該濃度下的吸光度減小到可以忽略不計(jì)而又不影響另一種單糖正常測定時(shí),便可以消除干擾。

      2.2測定6C含量時(shí),5C的最大干擾濃度和可測范圍

      配制不同濃度梯度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蒽酮比色法測定木糖的吸光度,采用5點(diǎn)法作圖。因?yàn)?C與蒽酮反應(yīng)生成的有色物質(zhì)在可見光區(qū)吸收峰為620 nm,所以以620 nm波長為中心,繪制580~650 nm波長下的木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      選取所用紫外-可見分光光度計(jì)讀數(shù)的最小可信值為 0.05,那么6C的吸光度≥0.05時(shí),視為可信的吸光度,根據(jù)620 nm波長下葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=13.090x-0.006,r2=0999 9,y: 吸光度;x:濃度,g/L) 可以得到吸光度為0.05時(shí)

      6C的濃度為0.004 3 g/L,此濃度即為6C的最小可測濃度。同理,5C的吸光度<0.05時(shí),不會影響6C的吸光度,根據(jù)不同波長下木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得到吸光度為0.05時(shí)5C的濃度,只有混合液中5C小于此濃度時(shí),才不會干擾6C的測定結(jié)果,此時(shí)的5C濃度即為不干擾6C測定的最大濃度。因此,測定6C含量時(shí),5C的濃度要小于最大干擾濃度,6C的濃度要大于最小可測濃度(0.004 3 g/L),即5C與6C濃度的比值會恒小于某個(gè)數(shù)。由5C和6C濃度的比值可以得到不同波長下的可測范圍。

      2.3測定5C含量時(shí),6C的最大干擾濃度和可測范圍

      配制不同濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,用苔黑酚比色法測定葡萄糖的吸光度,采用5點(diǎn)法作圖。因?yàn)樘诜颖壬y定木糖在660 nm波長下有最大吸光度,所以以 660 nm 波長為中心,繪制620~690 nm波長下的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      選取所用紫外-可見分光光度計(jì)讀數(shù)的最小可信值為 0.05,5C的吸光度≥0.05時(shí),視為可信的吸光度,根據(jù) 660 nm 波長下木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=62.870x-0.012,r2=0.999 9,y:吸光度;x:濃度,g/L)可以得到吸光度為0.05時(shí)5C的濃度為0.986 mg/L,此濃度即為5C的最小可測濃度。同理,6C的吸光度<0.05時(shí),不會影響5C的吸光度,根據(jù)不同波長下葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以得出吸光度為0.05時(shí)6C的濃度,只有混合液中的6C小于此濃度時(shí),才不會干擾5C的測定結(jié)果,此時(shí)6C的濃度即為不干擾5C測定的最大濃度。因此,測定5C含量時(shí),6C的濃度要小于最大干擾濃度,5C的濃度要大于最小可測濃度(0.986 mg/L),即6C與5C濃度的比值會恒小于某個(gè)數(shù)。由5C和6C濃度的比值可以得到不同波長下的可測范圍(

      3結(jié)論與討論

      本試驗(yàn)所采用的方法操作簡便,成本低,測定結(jié)果準(zhǔn)確,可以進(jìn)行多個(gè)試樣的分析,在具有一般化學(xué)分析條件的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)都可以使用。用本法準(zhǔn)確測定混合液中6C含量時(shí),需要同時(shí)滿足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16;準(zhǔn)確測定5C含量時(shí),需要同時(shí)滿足[6C]<0.023 3 g/L和 [6C]/[5C]<24。在測定混合液中5C和6C含量時(shí),可以通過稀釋的方法控制濃度大小,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的糖濃度符合表1和表2所列的互相不干擾范圍,即認(rèn)為測定結(jié)果準(zhǔn)確。用本法測定稻草秸稈中纖維素含量38.74%、半纖維素含量21.84%,與HPLC法測定結(jié)果一致。此方法對測定木質(zhì)纖維素原料中纖維素和半纖維素的含量提供了幫助,也為進(jìn)一步利用木質(zhì)纖維素這一寶貴的資源提供了資料。

      參考文獻(xiàn):

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      [5]杜甫佑,張曉昱,王宏勛. 木質(zhì)纖維素的定量測定及降解規(guī)律的初步研究[J]. 生物技術(shù),2004,14(5):46-48.

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