臺州地區(qū)規(guī)模豬場主要疫病的流行病學調查

徐麗華，陳冬祥，姚 邦，候賢宏，游新根，管妙東，王一成*

(1.浙江省農業(yè)科學院，浙江 杭州 310021； 2.臺州市畜牧獸醫(yī)局，浙江 臺州 318000； 3.椒江區(qū)畜牧獸醫(yī)局，浙江 椒江 318000；4.路橋區(qū)畜牧獸醫(yī)局，浙江 路橋 318000； 5.溫嶺市畜牧獸醫(yī)局，浙江 溫嶺 317500)

臺州地區(qū)規(guī)模豬場主要疫病的流行病學調查

徐麗華1，陳冬祥2，姚 邦2，候賢宏3，游新根4，管妙東5，王一成1*

(1.浙江省農業(yè)科學院，浙江 杭州 310021； 2.臺州市畜牧獸醫(yī)局，浙江 臺州 318000； 3.椒江區(qū)畜牧獸醫(yī)局，浙江 椒江 318000；4.路橋區(qū)畜牧獸醫(yī)局，浙江 路橋 318000； 5.溫嶺市畜牧獸醫(yī)局，浙江 溫嶺 317500)

選取浙江臺州地區(qū)規(guī)模豬場為試驗豬場，從2014年到2016年用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬偽狂犬野毒(PRV gE)抗體的陽性率，分析豬群免疫狀況。同時采取臨床可疑病料，用PCR及RT- PCR技術檢測PRRSV、PCV2、SFV和PRV的感染率。結果顯示：從2014年到2016年CSFV抗體陽性率從64.9%上升到80.4%；PRRSV和PCV2抗體陽性率變化不大，均處于高位；PRV gE抗體陽性率從52.5%下降到22.9%。在不同年齡段豬群中，母豬抗體水平最高，仔豬抗體水平逐漸下降，保育豬最低，抗體陽性率下降到50%以下，肥育豬階段又有所回升。在病原檢測中，2014年PRRSV、PCV2、SFV和PRV4種病原檢出率均較高，其中PCV2檢出率高達60%，到2016年4種病原檢出率均下降到15%以下。本實驗結果為控制豬場疫病和完善豬群免疫程序等防治措施提供了科學依據。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)； 豬瘟病毒(CSFV)； 豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)； 豬偽狂犬病毒(PRV)； 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)； PCR； RT- PCR

浙江臺州地區(qū)位于浙江省東南沿海，山地資源豐富，水路交通發(fā)達。近年來，臺州地區(qū)規(guī)模豬場增加，生豬交易日益頻繁，遠距離的運輸和應激增加了豬群的疫病風險，豬場豬群發(fā)病率明顯提高，損失慘重。目前豬群中流行的病原有豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合癥、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒病、豬病毒性腹瀉等10多種病毒性疫病，混合感染和繼發(fā)感染增多[1- 3]。為了防控這些疫病，規(guī)模豬場中往往進行高密度的疫苗免疫，極易造成豬體免疫紊亂和免疫干擾現象。另一方面，藥物保健是目前規(guī)模豬場常規(guī)防疫技術之一，但部分抗生素(如鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素等)、糖皮質激素、性激素、環(huán)磷酰胺等藥物即使在治療量水平也會對生豬免疫器官和免疫細胞具有不同的抑制效應，削弱生豬的免疫應答能力。所以，規(guī)模豬場中免疫失敗時有發(fā)生，并且日趨嚴重，給養(yǎng)殖戶帶來巨大經濟損失[3- 4]。

為了較客觀全面地了解臺州地區(qū)規(guī)模豬場豬群主要疫病的免疫狀況及流行情況，為制訂有效防治措施提供依據。在2014—2016年本實驗室采取臺州地區(qū)規(guī)模豬場豬群的血清樣本，進行豬藍耳病、豬瘟、豬圓環(huán)病毒病和豬偽狂犬病的血清學抗體檢測，同時對臺州地區(qū)豬場的臨床可疑組織病料進行病原檢測，分析當前規(guī)模豬場的疫病種類、流行狀況、豬群免疫狀況的變化動態(tài)，為調整豬群免疫程序，提高豬群存活率提供依據。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

豬繁殖與呼吸道綜合征病毒抗體檢測試劑盒、豬瘟病毒抗體檢測試劑盒和豬偽狂犬病毒gpI(gE)抗體檢測試劑盒均為美國IDEXX公司生產，購于杭州楚陽生物技術有限公司；豬圓環(huán)病毒抗體檢測試劑盒為韓國金諾公司生產，購于杭州杰萌生物技術有限公司；病毒RNA提取試劑盒為德國MN公司生產，購于上?；蚬?；病毒RNA一步法試劑盒購于大連寶生生物科技有限公司；病毒DNA提取試劑盒及1 000 bp DNA Marker均購自上海申能博彩生物科技有限公司(Lot: 0507)；TaqDNA 聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶、dNTPS等均購自上海生工生物工程技術服務有限公司；無水乙醇等化學試劑均為國產分析純。

1.2 血樣采集及病料來源

2014—2016年上半年采取臺州地區(qū)規(guī)模豬場各年齡段豬血液，其中2014年采血815份，2015年采血1 753份，2016年采血469份。分離血清，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2014—2016年上半年對臺州地區(qū)送檢的臨床疑似病料采樣，其中2014年采樣31份，2015年采樣16份，2016年上半年采樣16份，每份病料均無菌采取肺臟、脾臟、腎臟和淋巴結，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 血清抗體檢測

按照酶聯免疫吸附試驗檢測試劑盒中的說明書操作，對豬繁殖與呼吸道綜合征病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒gE基因的抗體進行檢測。

1.4 病料病原檢測

1.4.1 引物設計

根據GenBank 中登錄的PCV2ORF2基因、PRVgE基因、PRRSVORF1a基因的核苷酸序列，應用DNAStar和Primer Premier軟件分別設計了3對特異性引物，委托上海生工生物工程有限公司合成。CSFVE2基因引物參考浙江大學動物科學院方維煥實驗室。引物序列見表1。

表1 PRRSV、CSFV、PCV2和PRV用于PCR反應的引物

1.4.2 病毒基因組DNA及RNA的提取

從-70 ℃取出臨床病料0.1 g，置于Eppendorf管中，加入pH值7.4 PBS緩沖液0.5 mL，用研磨棒研磨成勻漿，-70 ℃凍融3次，離心取上清0.15 mL，再用病毒DNA提取試劑盒及RNA提取試劑盒分別提取病毒DNA及RNA，于-70 ℃保存。

1.4.3 RT- PCR擴增PRRSV及SFV

按照一步法RT- PCR檢測試劑盒說明書操作?；靹蚍盅b后置PCR 擴增儀中，擴增條件為：50 ℃ 30 min; 95 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

因為SFV一步法擴增效率低，容易造成漏檢，需進行第二套PCR反應。50 μL 反應體系分別為：10×PCR Buffer 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTPs(2.0 mmol·L-1)4.0 μL，引物F9/F10各4.0 μL(濃度為5 μmol·L-1)，rTaqDNA ploymerase 0.5 μL，SFV PCR產物為模板1.0 μL，ddH2O 27.5 μL?；靹蚝笾肞CR 擴增儀中，擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

反應結束后，取PCR產物5 μL，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用BIO- RAD成像系統(tǒng)觀察拍照。

1.4.4 PCR擴增PCV2及PRV

按照常規(guī)PCR擴增方法，擴增PCV2目的基因片段， 50 μL 反應體系分別為：10×PCR Buffer 5.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTPs (2.0 mmol·L-1) 4.0 μL，引物各4.0 μL(濃度為5 μmol·L-1)，rTaqDNA ploymerase 0.5 μL，模板為4.0 μL，ddH2O 24.5 μL?；靹蚝笾肞CR 擴增儀中，擴增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

PRVgE基因GC含量高，用PrimeSTAR HS DNA擴增目的片段，50 μL反應體系分別為：2×PrimeSTAR GC Buffer 25.0 μL，MgCl2(25 mmol·L-1)4.0 μL，dNTPs(2.0 mmol·L-1)4.0 μL，引物(濃度為5 μmol·L-1)各4.0 μL，Prime STAR HS DNA 0.5 μL，模板為4.0 μL，ddH2O 4.5 μL?；靹蚝笾肞CR 擴增儀中，擴增條件為：95 ℃ 5 min；98 ℃ 15 s，68 ℃ 45 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應完成后，取PCR產物5 μL，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用BIO- RAD成像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 PRRSV、CSFV、PCV2、PRV病原檢測

從2014年開始，收集臺州地區(qū)規(guī)模豬場中臨床疑似病例，其中2014年31份，2015年16份，2016年至今16份。分別檢測PRRSV、CSFV、PCV2、PRV病原。結果(圖1)顯示，在臺州地區(qū)規(guī)模豬場中PRRSV、CSFV、PCV2和PRV均存在不同程度的感染；在2014年，PRRSV、CSFV、PCV2和PRV4種病原的檢出率均較高，其中PCV2的檢出率達到60%；2015年和2016年4種病原的檢出率持續(xù)下降，到2016年上半年，4種病原的檢出率均下降到15%以下，其中豬瘟檢出率為0；從2014年到2016年豬偽狂犬病毒檢出率下降不大，說明豬偽狂犬野毒在臺州地區(qū)豬場中持續(xù)流行存在。

圖1 2014—2016年臨床疑似病料中PRRSV、CSFV、PCV2、PRV檢出率

2.2 不同年份中，PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗體陽性率檢測

從2014年到2016年上半年，采集臺州地區(qū)規(guī)模豬場血液分別為815份，1 753份和469份。分別進行PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗體檢測。檢測結果(圖2)顯示，從2014年到2016年，PRRSV和PCV2抗體陽性率變化不大，PRRSV保持在65%以上，PCV2抗體陽性率一直處于高位，在90%以上；CSFV抗體陽性率逐年提高，從2014年的64.9%逐漸上升到2016年的80.4%；PRV gE抗體陽性率逐年下降，從2014年的52.5%逐漸下降到2016年的22.9%。

圖2 2014—2016年豬血清中PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗體陽性率比較

2.3 不同年齡段豬群中，PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗體陽性率檢測

按照豬群的年齡段劃分為母豬、仔豬、保育豬和肥育豬，其中母豬776份、仔豬211份、保育豬467份、肥育豬436份。檢測結果(圖3)顯示，不同年齡段豬群中，PRRSV和CSFV的抗體陽性率出現較一致的變化趨勢，母豬抗體水平最高，仔豬抗體水平逐漸下降，保育豬最低，抗體陽性率下降到50%以下，肥育豬階段又有所回升；PCV2的抗體陽性率一直都處于較高水平，保育階段雖有所下降，也能維持在80%左右。PRV gE在母豬和仔豬階段抗體陽性率相對較高，在30%～40%，而在保育豬和肥育豬階段抗體陽性率較低，均維持在20%以下。

圖3 不同年齡段豬群中，PRRSV、CSFV、PRV gE、PCV2抗體陽性率比較

3 討論

臺州位于浙江省的東南沿海，三面環(huán)山，資源豐富，水路發(fā)達，但當地生豬養(yǎng)殖量少，供給主要依靠山東、河南、安徽等地的調入。近些年，在當地政府的扶持下，一批規(guī)?；B(yǎng)豬場逐漸發(fā)展起來，解決了當地百姓的就業(yè)問題。生豬養(yǎng)殖的增加以及交易的日益頻繁，同時豬疫病也隨之增加，特別是豬的病毒性疫病，發(fā)病急，死亡率高，給養(yǎng)殖戶帶來很大的經濟壓力。其中豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬偽狂犬病毒(PRV)等疾病是臺州地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)最主要也是最常見的豬病毒性疫病。有資料顯示，PRRSV和PCV2可以侵害豬的免疫器官和免疫細胞，造成豬群免疫系統(tǒng)的破壞，導致豬瘟等疫苗免疫抑制或失敗，豬群抗體水平整體下降，更加易感豬瘟野毒等病原微生物。

從病原檢測結果看，PRRSV、CSFV、PCV2及PRV4種病毒病在臺州地區(qū)不同程度的存在并流行，其中2014年PCV2檢出率高達60%，PRRSV檢出率為41.9%，SFV檢出率為19.23%。在PCV2感染普遍的情況下，PRRSV引起豬免疫抑制性疫病也增多，可能會導致豬瘟免疫的失敗。

從血清抗體監(jiān)測結果看，PRRSV、CSFV、PCV2的抗體水平變化較一致，其中母豬的抗體水平均較高，仔豬抗體水平有所回落，而保育階段抗體水平最低，到育肥階段抗體水平均有不同程度的提高。具體分析可能是因為仔豬母源抗體水平較高，而育肥豬因為豬只體重增加，抵抗力增強、疫苗免疫次數多等因素有關。這與豬場在保育豬階段豬群容易發(fā)病，死亡率也較其它階段高的情況相符合。

本次調查的規(guī)模豬場均接種了 PRV gE基因缺失疫苗，而實驗中采用的豬偽狂犬病毒gpI(gE)抗體檢測試劑盒，其監(jiān)測的PRV抗體為豬只感染豬偽狂犬野毒后產生的抗體，即PRV gE抗體。gE抗體陽性率越高，說明豬群感染豬偽狂犬野毒越嚴重[5]。2014年到2016年臺州地區(qū)PRV gE抗體從52.5%下降到22.9%，說明該地區(qū)豬偽狂犬病在豬群中持續(xù)存在，但感染率有明顯下降趨勢。

從近3年的調查結果來看，在臺州地區(qū)PRRSV、CSFV、PCV2及PRV存在不同程度流行的態(tài)勢下，對規(guī)模豬場最有效也是最實用的手段是選用優(yōu)質的疫苗，并制定科學合理的免疫計劃，進行疫苗免疫。同時每季度定期對豬群進行抗體的監(jiān)測，按照檢測數據具體分析豬場的實際情況，及時調整免疫程序，同時補免個別漏打豬及淘汰多次免疫不合格豬，以保證豬群有足夠的免疫力。另外，豬場還需要加強管理和生物安全措施，防止病毒的入侵。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學[M]. 4版. 北京：中國農業(yè)出版社, 2007：358.

[2] HARMS P A, HALBUR P G, SORDEN S D, et al. Three cases of porcine respiratory disease complex associated with porcine circovirus type 2 infection [J]. Journal of Swine Health and Production, 2002, 10 (1)：27- 30.

[3] 舒相華, 尹革芬, 楊志雷, 等. 云南地區(qū)部分豬場豬呼吸道疾病綜合癥(PRDC)患病豬群中PRRSV，PCV- 2，CSFV，PRV混合感染調查[J]. 云南農業(yè)大學學報，2011，26(1)：54- 58.

[4] 左奕, 王建永, 袁萬哲, 等. PCV2- PRV- PRRSV- CSFV多重PCR檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，2015，45(8)：771- 775.

[5] 黨占國, 莊金山, 晉春霞, 等. 2012—2015年河南省部分地區(qū)規(guī)?；i場PRV血清流行病學調查[J]. 國外畜牧學：豬與禽，2016(1)：44- 47.

(責任編輯：盧福莊)

2016- 12- 30

院地合作農業(yè)科技項目(TYD- 013)

徐麗華，女，助理研究員，E- mail：xulihua08@yeah.net。

王一成，男，研究員，研究方向為畜禽傳染病。

10.16178/j.issn.0528- 9017.20170341

S828.82

A

0528- 9017(2017)03- 0493- 04

文獻著錄格式：徐麗華，陳冬祥，姚邦，等. 臺州地區(qū)規(guī)模豬場主要疫病的流行病學調查[J].浙江農業(yè)科學，2017，58(3)：493- 496.