張枝雪 黃茜 李玥 楊志斌??肖懷 巫秀美 張成桂

【摘要】目的：利用激光散斑血流成像技術(shù)觀察尼莫地平對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型腦血流灌注量的影響。方法：成年雄性SD大鼠，采用改良線栓法制備大腦中動(dòng)脈梗塞/再灌注模型。利用激光散斑血流成像技術(shù)觀測(cè)造模前，缺血再灌注05、1、2、24h后腦血流灌注量情況，并對(duì)選定區(qū)域血流進(jìn)行分析，再灌注24h TTC染色觀察腦梗死體積。結(jié)果：造模成功后大鼠右側(cè)腦血流明顯減少，灌胃給4mg/kg尼莫地平后，大鼠局部腦血流漸漸增加，腦梗死面積減少，腦組織含水量減少。結(jié)論：尼莫地平能顯著增加MCAO/R模型大鼠血流量。

【關(guān)鍵詞】尼莫地平；腦缺血再灌注損傷；激光散斑血流成像；腦血流量

【中圖分類號(hào)】R965【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）07-0042-04

Effect of Nimodipine on MCAO/R Rats Different Time Point Blood Perfusion

ZHANG Zhixue1，3HUANG Xi1，3LI Yue1，2，3YANG Zhibin1，2，3XIAO Huai1，2，3WU Xiumei1，2，3ZHANG Chenggui1，2，3*

1.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D， Institute of Entomoceutics Research， Dali University， Dali 671000， China；2.Yunnan Provincial 2011 Collaborative Innovation Center for Entomoceutics， Dali University，Dali 671000， China；3.National-Local Joint Engineering Research Center of Entomoceutics，Dali 671000， China

Abstract：Objective To study the effect of nimodipine on cerebral blood flow in MCAO/R rats by laser speckle imaging （LSI）. Methods To establish the MCAO/R model in male SD rats by the modified intraluminal filament technique. Measuring the cerebral blood flow before modeling and after ischemia-reperfusion for 05 h， 1 h， 2 h， 24 h by LSI， meanwhile analysing the selected area blood flow， and observing the infarct size after perfusion for 24 h with TTC. Results The cerebral blood flow was decreased in right hemisphere after the models established successfully， and after the intragastric administration of nimodipine with 4 mg/kg， the regional cerebral blood flow of rats gradually increased， the cerebral infarction area reduced， and the brain water content was decreases. Conslusions Nimodipine significantly improve the cerebral blood flow of MCAO/R rats.

Keywords：Nimodipine； Cerebral Ischemia-Reperfusion Injury； Laser Speckle Imaging； Cerebral Blood Flow

缺血性腦卒中（Ischemic Stroke，IS）指腦的供血主動(dòng)脈發(fā)生狹窄或阻塞，腦的血液供應(yīng)出現(xiàn)障礙，導(dǎo)致氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的缺乏，從而引起腦的功能異常，腦局部組織壞死[1]。局灶性腦缺血后大腦損傷的進(jìn)展取決于血流量減少的嚴(yán)重程度和缺血后再灌注的動(dòng)力學(xué)變化。提高缺血區(qū)域血流量，改善缺血腦組織的血液循環(huán)，對(duì)于提高患者的治療效率具有重要意義。大腦中動(dòng)脈栓塞（Middle Cerebralartery Occlusion，MCAO）模型是目前運(yùn)用最為廣泛的腦缺血模型[2]，但對(duì)MCAO模型的血流變化報(bào)道不多。尼莫地平對(duì)腦缺血引起的神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用，能減少缺血腦組織梗死面積，增加局部腦血流量[3]，在臨床前的研究效果顯著，但抗自由基和抗氧化特性在臨床患者中得不到體現(xiàn)。為進(jìn)一步證實(shí)尼莫地平改善腦血液循環(huán)的作用，研究引用激光散斑血流成像技術(shù)（Laser Speckle Contrast Imaging，LSI）較直觀的、實(shí)時(shí)的觀察MCAO/R模型后的局部血流變化情況。

1儀器與材料

11儀器HWS24電熱恒溫水浴鍋（上海恒恒科技有限公司）；PSI ZR瑞典帕瑞醫(yī)學(xué)激光散斑血流監(jiān)測(cè)視頻系統(tǒng)（perimed）。

12材料水合氯醛（批號(hào)：20120827，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；硫酸阿托品注射液（批號(hào)：03141205，上海禾豐制藥有限公司）；尼莫地平片（批號(hào)：BJ29770，拜耳醫(yī)藥保健有限公司）；氯化三苯基四氮唑（Triphenyl tetrazolium chloride，TTC，批號(hào)：20141119，南京建成生物工程研究所）；2636-100栓線（北京西濃科技有限公司）。

13實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)成年健康雄性（Sprague-Dawley，SD）大鼠，體量220～250g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SYXK（湘）2011-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)置后在大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5d后用于正式實(shí)驗(yàn)。飼養(yǎng)條件：清潔級(jí)，室溫19～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，12h明暗交替照明，自由進(jìn)食、飲水。

2方法

21腦血流量的測(cè)定大鼠用10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，肌內(nèi)注射阿托品01mL/100g體重用于抑制呼吸道分泌物。大鼠固定于腦立體定位儀上，用剃毛器剃去大鼠頭部的毛，從頭部正中沿矢狀縫剪開(kāi)頭皮及筋膜，用手術(shù)刀將顱骨表面的骨膜等結(jié)締組織清理干凈后，采用785nm波長(zhǎng)的半導(dǎo)體激光源均勻照射到頭骨上方約16cm處，設(shè)置采樣頻率為8幀/s，曝光時(shí)間為10ms，圖像采集像素為1388×1038，連續(xù)成像10幀，通過(guò)系統(tǒng)將原始的散斑圖像轉(zhuǎn)換成血流圖和血流信息。在每組實(shí)驗(yàn)中，在大鼠MCAO模型之前記錄一組基線數(shù)據(jù)，手術(shù)后缺血2h，再灌注05、1、2、24h各監(jiān)測(cè)一次腦血流并采集血流灌注圖。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要檢測(cè)肛溫，控制加熱墊溫度，保持大鼠體溫恒定在（370±02）℃范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)中時(shí)不時(shí)向監(jiān)測(cè)部位滴加生理鹽水，保持表面濕潤(rùn)。

22大鼠MCAO模型的建立參考Longa、Kugal等[4-5]方法，并加以改進(jìn)，采用線栓法復(fù)制短暫性大鼠腦中動(dòng)脈閉塞（MCAO）模型，復(fù)制方法如下：將已麻醉的大鼠仰臥固定在手術(shù)臺(tái)上，用智能恒溫儀使大鼠在手術(shù)過(guò)程中，肛溫維持在37℃，頸部剃毛并進(jìn)行常規(guī)消毒后頸正中偏左05cm處切口約15cm，分離右頸總動(dòng)脈（Common Carotid ar Aery，CCA）至分叉處，分離頸外動(dòng)脈（External Carotid Artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（Internal Carotid Artery，ICA）。結(jié)扎CCA近心端，用一個(gè)微動(dòng)脈夾夾閉CCA遠(yuǎn)心端，在CCA上用縫合線扎一活結(jié)，眼科剪在距離分叉約1cm處剪一“V”形缺口，將線栓經(jīng)缺口插入，松開(kāi)CCA上動(dòng)脈夾，調(diào)整線栓進(jìn)入角度（向左側(cè)傾斜約20°角），使線栓進(jìn)入ICA再次調(diào)整進(jìn)線角度（向右側(cè)傾斜約15°角）并輕輕拉CCA，使栓線進(jìn)入大腦，微遇阻力時(shí)停止，此時(shí)線栓插入深度為18～20mm （ECA與ICA分叉處為起點(diǎn)），線栓頭端通過(guò)MCA起始處，到達(dá)較細(xì)的大腦前動(dòng)脈。仔細(xì)關(guān)閉創(chuàng)口，縫合皮膚，此時(shí)完成大鼠MCAO模型的制備。

23TTC染色及梗死體積計(jì)算大鼠腦缺血再灌注24h斷頭處死取腦，去除嗅球及小腦，濾紙吸去腦表面水分，稱濕重后，立即放入-20℃冰凍15min后取出，由前向后做連續(xù)冠狀切片，共5片。將腦切片置于pH74，001mmol/L PBS配制的02% TTC溶液中，37℃避光孵育30min，期間不時(shí)搖晃燒杯，使腦切片與TTC溶液充分接觸。數(shù)碼相機(jī)拍照，計(jì)算腦梗死率。

腦梗死率=5片缺血側(cè)腦梗死區(qū)像素之和5片缺血側(cè)半腦像素之和×100%

24腦組織含水量TTC染色后將5片腦組織置于110℃烘箱中烘烤24h，在干燥器中冷卻至室溫后稱干重。計(jì)算腦組織含水量=（腦組織濕重-腦組織干重）/腦組織濕重×100%。

25大鼠神經(jīng)病學(xué)評(píng)分大鼠缺血2h，再灌注6h和24h進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。參照Longa[4]并加以改進(jìn)的5分制法進(jìn)行評(píng)分，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度缺損，即提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪；2分：中度缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：中度缺損，即行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分：重度缺損，不能自發(fā)行走，意識(shí)水平下降。

26數(shù)據(jù)處理對(duì)于每組記錄的10幀散斑圖像數(shù)據(jù)，選取每組中間的8幀進(jìn)行分析；數(shù)據(jù)采用SPSS 210統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以Mean±S表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性且方差齊的，采用參數(shù)檢驗(yàn)中的單因素方差分析（one-way ANOVA）比較，組間兩兩比較采用LSD（最小顯著差檢驗(yàn)），數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差不齊的采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Mann-Whitney檢驗(yàn)分析比較，以P<005表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

31形態(tài)學(xué)觀察假手術(shù)組造模前后腦左右測(cè)紅色區(qū)域變化不大，說(shuō)明血流量無(wú)明顯變化。模型組造模前后右側(cè)腦可明顯發(fā)生變化，造模后再灌注05h右側(cè)腦紅色區(qū)域明顯減少，到24h時(shí)黃色區(qū)域面積相對(duì)于2h時(shí)明顯增多，說(shuō)明隨時(shí)間延長(zhǎng)模型越嚴(yán)重。尼莫地平組再灌注0h時(shí)開(kāi)始灌胃給藥，再灌注05h時(shí)明顯看到右側(cè)區(qū)域血流變化，24h時(shí)缺血側(cè)（黃色區(qū)）面積相對(duì)于05h、1h和2h明顯減少，說(shuō)明尼莫地平能增加腦血流量。見(jiàn)圖1。

32不同時(shí)間點(diǎn)血流量在缺血側(cè)同一區(qū)域畫(huà)相同大小的面積，如圖1。計(jì)算所畫(huà)區(qū)域的腦血流量。見(jiàn)表1。MCAO/R模型前，所有大鼠腦血流量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>005）。假手術(shù)組造模前后腦血流變化不明顯；與假手術(shù)組比較，模型組缺血2h，再灌注05、1、2、24h不同時(shí)間點(diǎn)腦血流呈現(xiàn)下降的顯著下降，且24h腦血流量較前幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)血流量低，說(shuō)明模型組腦組織隨著時(shí)間的延長(zhǎng)損傷越嚴(yán)重（由29918±4944下降到17542±4164）；尼莫地平組缺血2h，再灌注后腦血流呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，與模型組比較，在缺血2h再灌注24h時(shí)，其腦血流量顯著上升，提示尼莫地平對(duì)腦組織可能具有保護(hù)作用。

4 討論

腦缺血的動(dòng)物模型雖然種類繁多，但都無(wú)法同時(shí)滿足以下三個(gè)模擬臨床的基本要求：創(chuàng)傷小、局部缺血、可再灌注。直到MCAO/R模型的出現(xiàn)，才出現(xiàn)了一個(gè)真正受廣泛認(rèn)可模擬臨床中風(fēng)的模型。MCAO模型是一種被廣泛運(yùn)用的腦缺血模型[2]，但其也存在一定的局限性，如大鼠血管的差異導(dǎo)致模型的不穩(wěn)定性等。在做 MCAO模型時(shí)利用激光散斑技術(shù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)進(jìn)行血流監(jiān)測(cè)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)血流情況能幫助較快發(fā)現(xiàn)造模失敗和極端變異個(gè)體，提高實(shí)驗(yàn)效率，有助于控制實(shí)驗(yàn)質(zhì)量。文獻(xiàn)[6]所述，把MCAO前的腦血流定義為100%，缺血時(shí)局部腦血流降到25%以下，說(shuō)明模型成功，繼續(xù)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)，否則剔除。當(dāng)腦血流因各種原因下降時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致腦的病理性改變，造成缺血性的腦損傷，此時(shí)，缺血區(qū)血流大幅減少，ATP迅速耗竭，缺血區(qū)域的中心組織細(xì)胞開(kāi)始死亡[7]。因此，研究腦血流量變化不僅有助于研究疾病發(fā)生的病因病機(jī)，還可以作為一項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行藥物的篩選。研究中，尼莫地平能夠改善多個(gè)與腦缺血損傷有關(guān)的病理機(jī)制，如抑制血小板聚集，提高腦組織清除自由基的能力，拮抗5-HT，TXA2和前列腺素F2α（PGF2α）等多種血管活性物質(zhì)引起的血管收縮[8]。尼莫地平不僅能舒張血管平滑肌，預(yù)防和解除腦血管痙攣，改善腦部微循環(huán)，亦能保護(hù)腦缺血時(shí)由于鈣離子內(nèi)流超載所致的腦細(xì)胞損害，對(duì)腦缺血引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷具有重要的保護(hù)作用[9]。評(píng)價(jià)梗死主要有兩種方法，一種是使用HE染色法，另一種是TTC染色法，HE染色法的原理為缺血區(qū)細(xì)胞死亡，細(xì)胞核無(wú)法著色，染色顯示為蒼白。TTC染色的原理為T(mén)TC與細(xì)胞線粒體脫氫酶結(jié)合，線粒體失活便無(wú)法著色，染色顯示為蒼白，TTC染色方法比較簡(jiǎn)便快捷，是目前評(píng)價(jià)梗死的最主要方法。實(shí)驗(yàn)研究表明在栓塞大腦中動(dòng)脈15min后，整腦冠狀切面用TTC染色，就可出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的缺血灶，主要位于缺血半球側(cè)邊部分的大腦尾殼核區(qū)；栓塞2～3h后缺血灶的面積趨于一致；在視交叉前后約2～3mm范圍內(nèi)作冠狀切面，缺血灶約占同側(cè)腦冠狀切面面積的60%～85%，缺血灶累及的結(jié)構(gòu)有：大腦背外側(cè)的皮質(zhì)層、尾殼核、丘腦外側(cè)部下丘腦的背外側(cè)部[10]。結(jié)果顯示，尼莫地平能明顯降低皮層區(qū)的梗死灶，有助于大鼠腦缺血再灌注后腦組織損傷區(qū)半暗帶的恢復(fù)，抑制腦梗死范圍的進(jìn)一步擴(kuò)大。

腦水腫是缺血性腦血管病主要的臨床并發(fā)癥之一，在大鼠MCAO/R模型中主要存在細(xì)胞毒性腦水腫和血管源性腦水腫，兩種水腫類型的機(jī)理依據(jù)出現(xiàn)時(shí)間不同，前者為在缺血時(shí)便出現(xiàn)并持續(xù)整個(gè)缺血再灌注過(guò)程，后者只在再灌注過(guò)程中出現(xiàn)，在再灌注過(guò)程中兩者常同時(shí)存在。腦水腫與其引起的顱內(nèi)壓增高是腦梗死早期致死主要原因，而且腦水腫會(huì)引起腦血流進(jìn)一步下降，加重腦缺血損傷。結(jié)果顯示，尼莫地平組降低大鼠腦缺血再灌注損傷后腦組織內(nèi)水分含量，能在一定程度上減輕腦缺血再灌注損傷。

綜上，研究采用激光散斑成像技術(shù)測(cè)定尼莫地平對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦血流量的影響，并對(duì)選定區(qū)域血流進(jìn)行分析，TTC染色觀察腦梗死體積及腦組織含水量，初步闡明尼莫地平能增加腦血流灌注量，從而改善腦供血，對(duì)腦組織有保護(hù)作用。

參考文獻(xiàn)

[1]Glenn A Armitage， Kathryn G Todd， Ashfaq Shuaib， et al . Laser speckle contrast imaging of collateral blood flow during acute ischemic stroke [J]. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism，2010，30： 1432-1436.

[2] Stoll G， Kleinschnitz C， Nieswandt B. Molecular mechanisms of thrombus formation in ischemic stroke： novel insights and targets for treatment[J]. Blood， 2008， 112（9）： 3555-3562.

[3] 黃德斌，董 志. 尼莫地平對(duì)缺血性腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞黏附分子表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24（5）：640-643.

[4] Longa E Z， Weinstein P R， Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke， 1989， 20（1）： 84-91.

[5] Kuge Y， Minematsu K， Yamaguchi T， et al.Nylon monofilament for intraluminal middle cerebral artery occlusion in rats [J]. Stroke， 1995， 26（9）：1655-1658.

[6] Li P， Murphy TH. Two-photon imaging during prolonged middle cerebral artery occlusion in mice reveals recovery of dendritic structure after reperfusion [J]. J Neurosci， 2008， 28（46）：l1970-11979.

[7] Lust WD， Taylor C， Pundik S，et al.Ischemic cell death： dynamics of delayed secondary energy failure during reperfusion following focal ischemia [J]. Metab Brain Dis， 2002， 17（2）： 113-121.

[8] Suman W， Martin G， Hair WM， et al. Effect of calcium antagonists on endothelin-induced contraction of isolated human resistance arteries： differences related to site of origin[J]. J Hum Hypertens，1993， 7（2）：189-191.

[9] Takijawa S，Hogan MJ，Buchan AM，et al. In vivo binding of [3H] nimodipine in rat brain after transient forebrain ischemia[J]. J Cereb Blood Flow Metab，1994， 14（3）： 397-405.

[10]Garcia JH， Yoshida Y， Chen H， et al Progression from ischemic injury to infarct following middle cerebral artery occlusion in the rat [J]. Am J Pathol， 1993， 142（2： 623-635.

（收稿日期：2017-02-11編輯：程鵬飛）