馮娟　吳滿武

[摘要] 目的 探討異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖凋亡的影響機制。 方法 采用MTT法觀察異氟醚作用24 h對MDA-MB-231細胞（密度5×105/孔）增殖能力的影響；采用Western blot法檢測磷酸化Akt（蛋白激酶B，protein kinase B），Bcl-xl（B細胞淋巴瘤/白血病-xl基因，B-cell lymphoma-extra large）、Bad（人促凋亡蛋白，Human apoptosis protein）的蛋白表達情況，以探究其對細胞凋亡的調(diào)控機制。 結(jié)果 （1）異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用，隨著時間的延長逐漸增強，與對照組相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果可見異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖起到抑制作用，且具有明顯的量效與時效關(guān)系；（2）各組磷酸化 Akt 的表達變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與對照組相比，異氟醚組磷酸化 Akt 在麻醉24 h 降低63.1%（P<0.05），48 h及72 h均呈回升趨勢（P<0.05）；（3）實驗組各時點Bad表達的變化差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。但各時點 Bcl-xl 表達的變化有顯著差異（P<0.05），72 h Bcl-xl 表達較對照組下降82.2%（P<0.05）。 結(jié)論 異氟醚可抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，并可通過Akt/Bad細胞通路誘導(dǎo)其細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 異氟醚；乳腺癌；MDA-MB-231細胞；增殖；凋亡

[中圖分類號] R737.9 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）05-0008-04

大量報道已證實[1，2]，異丙酚能抑制乳腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移能力，是乳腺癌根治術(shù)的常用麻醉藥物之一。而同樣作為常用吸入麻醉藥物的異氟醚，是否也對乳腺癌細胞存在以上作用？目前，還有研究報道，異氟醚對腦發(fā)育關(guān)鍵期也稱突觸發(fā)育期的哺乳動物具有神經(jīng)毒作用，表現(xiàn)為遠期認知功能障礙、神經(jīng)細胞凋亡增加、突觸棘形態(tài)改變和社會行為的異常[3-5]。因此，本研究設(shè)計體外培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細胞，給予異氟醚進行干預(yù)，通過觀察細胞的增殖情況及通過測定細胞凋亡標(biāo)志蛋白Akt、Bcl-xl、Bad的變化情況，來進一步探究異氟醚誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞毒性機制，為臨床有效防治乳腺癌提供有力的數(shù)據(jù)支持?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

人乳腺癌細胞MDA-MB-231（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），異氟醚（日本MaruishiPharma-ceutical公司，批號：YDST1109），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號：34716），胎牛血清（美國Hyclone公司，批號：67186），色素抑制劑1-苯基-2-硫脲（PTU，美國Sigma公司，批號12979），兔抗人Akt單克隆抗體，兔抗人磷酸化Akt單克隆抗體（ser473）；β-actin 單克隆抗體（美國invitrogen公司），兔抗人Bcl-xl多克隆抗體，兔抗人Bad 多克隆抗體（均購自美國CellSignal 生物技術(shù)公司），羊抗兔二抗（武漢博士德公司）。

1.2 細胞培養(yǎng)及干預(yù)處理

將復(fù)蘇后的細胞放入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。顯微鏡下觀察細胞生長情況，每隔2～3 d用0.25%胰酶消化，以1：2傳代。取對數(shù)生長期細胞進行實驗，經(jīng)消化、計數(shù)后，以5×105個/mL（1 mL/孔）的細胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)板置于密閉容器內(nèi)，置于37℃恒溫水浴鍋中。設(shè)立對照組后，將各組細胞置于密閉容器中，并在進氣口處連接leon麻醉機，出氣口處連接leon麻醉氣體監(jiān)測儀。實驗組通入3.4%～3.5%七氟醚-5%CO2-O2，對照組通入95%O2-5%CO2。在氣體流量1 L/min的條件下，各組均孵育6 h，孵育結(jié)束后繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.3 MTT法檢測細胞增殖情況

各組96孔板中分別加入配制好的濃度為5 mg/mL 20 μL MTT，對每個孔中的細胞進行染色，在λ=490 nm的酶標(biāo)儀讀出每孔的OD值，并根據(jù)試劑盒說明書計算各組細胞的抑制率。細胞抑制率（%）=1-（試驗組吸光度值/ 對照組吸光度值）×100%。

1.4 Western blot法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白

每組各取6個培養(yǎng)孔并收集其中細胞，提取細胞總蛋白，蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別加入檢測蛋白對應(yīng)的兔抗人一抗（稀釋度1：500），4℃下孵育過夜。洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（稀釋度1：2 000），室溫下孵育2 h。ECL顯色，掃描圖像后采用凝膠成像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值，以目標(biāo)條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目標(biāo)蛋白表達情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較用單因素方差分析和t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響

異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用結(jié)果如表1所示，統(tǒng)計結(jié)果表明，異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用，隨著時間的延長逐漸增強。與對照組相比，差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果可見異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖起到抑制作用，且具有明顯的量效與時效關(guān)系。

2.2 磷酸化Akt蛋白表達的變化

如表2，各組磷酸化 Akt 的表達變化差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與對照組相比，異氟醚組磷酸化 Akt在麻醉24 h降低67.3%（P<0.05），48 h及72 h均呈回升趨勢（P<0.05），提示異氟醚抑制磷酸化Akt表達。

2.3 Bcl-xl/Bad比值的變化

各時點Bcl-xl 表達的變化差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。但各時點 Bad 表達的變化有顯著差異（P<0.05），72 h Bad表達較對照組下降 82.2%（P<0.05）。結(jié)果提示異氟醚對Bad表達影響不大，而能降低Bcl-xl表達，從而降低Bcl-xl/Bad 比值（P<0.05）。

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，且致死率高，預(yù)后差，嚴重影響患者生活質(zhì)量。有研究已經(jīng)證實，乳腺癌的發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7%～10%，其發(fā)病率仍呈逐年增加趨勢[6-8]。因此，如何有效治療乳腺癌是當(dāng)前亟待解決的醫(yī)學(xué)難題[9]。近年來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)科技的飛速發(fā)展和腫瘤治療理念的不斷更新，傳統(tǒng)的以根治性手術(shù)為主的乳腺癌治療模式被廣大臨床工作者質(zhì)疑，而多學(xué)科的合理的綜合治療的呼聲越來越高。目前，臨床綜合療法多為手術(shù)配合放化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療、生物治療等[10，11]。但任何一種療法都有自身的優(yōu)勢與不足，且難以達到治愈效果。由此，尋找多靶點、新靶向且更深入探究高效、低毒的抗癌藥物成為近年來國內(nèi)外研究熱點之一[12]。

多篇研究[13-15]報道顯示，異氟醚能誘導(dǎo)突觸，使其呈上調(diào)狀態(tài)，從而促使發(fā)育高峰期的動物腦神經(jīng)細胞凋亡。因此，本研究擬用異氟醚干預(yù)體外培養(yǎng)的人乳腺癌MDA-MB-231細胞，通過觀察細胞的增殖情況，以證實其抑制乳腺癌的作用效果，同時也通過測定細胞凋亡相關(guān)蛋白的變化情況，來進一步探究異氟醚誘導(dǎo)MDA-MB-231細胞毒性機制，為臨床有效防治乳腺癌提供有力的數(shù)據(jù)支持。

本次研究重點觀察了Akt，研究結(jié)果顯示各組磷酸化 Akt 的表達變化有明顯差異。與對照組相比，異氟醚組磷酸化Akt在麻醉24 h降低67.3%，48 h及72 h均呈回升趨勢，提示異氟醚抑制磷酸化Akt表達。Akt其主要通過PI3K激活，從而作用于下游的Bad、Caspase 9等底物或下游因子抑制細胞凋亡[16，17]?？梢哉J為，激活后的Akt是抗凋亡和保護絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化的細胞屏障。因此，本次研究重點觀察了異氟醚干預(yù)后的人乳腺癌MDA-MB-231細胞中Akt的表達情況，所得實驗結(jié)果與前期及文獻報道結(jié)果相符。原癌基因蛋白Bcl-2家族，是一類細胞內(nèi)與細胞增殖相關(guān)的基因，是維持機體正常生命活動所必須的，在進化上高度保守。其中的Bad蛋白，具有較強的促進細胞凋亡的作用，Bcl-xl則是相反的具有抗凋亡作用，兩者表達失去平衡將會促進細胞的凋亡。研究已經(jīng)證實，當(dāng)機體處于磷酸化狀態(tài)下時，Ser136/Ser112殘基被Akt的激活，從而減少下游的Bad蛋白的表達，Bcl-xl表達相對較多，此時，細胞凋亡被抑制[18，19]。本次實驗結(jié)果也顯示，實驗組各時點Bcl-xl 表達的變化沒有顯著差異，但各時點Bad表達的變化有顯著差異，72 h Bad表達較對照組下降82.2%。該結(jié)果也證實，異氟醚對人乳腺癌MDA-MB-231細胞Bcl-xl/Bad的蛋白表達存在一定影響，從而也在一定程度上證實了異氟醚具有細胞毒性作用，可促使MDA-MB-231細胞凋亡，這可能是異氟醚治療乳腺癌的機制之一，后續(xù)仍需要大量是實驗數(shù)據(jù)進一步對其進行支撐[20]。異丙酚和七氟烷也是臨床上常用的麻醉藥，曾有學(xué)者研究研究了異丙酚和七氟烷對人乳腺癌癌細胞遷徙的影響差異，研究結(jié)果表明兩種麻醉藥對人乳腺癌細胞株的侵襲和遷移能力的影響沒有較大差異。關(guān)于其他常用麻醉藥之間效果比較，還需要我們進一步的探索和證實。綜上所述，異氟醚可抑制人乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖，并可通過Akt/Bad細胞通路誘導(dǎo)其細胞凋亡。但仍有很多實驗需要我們?nèi)プC實和探索。

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（收稿日期：2016-11-20）