苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟及肝臟細(xì)胞低密度脂蛋白受體、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的影響

劉伯帥 王文靜 陳言言 朱曉艷 袁德地 齊勝利 王成章 史瑩華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002)

苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟及肝臟細(xì)胞低密度脂蛋白受體、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)的影響

劉伯帥 王文靜 陳言言 朱曉艷 袁德地 齊勝利 王成章 史瑩華*

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州450002)

本試驗(yàn)旨在研究苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟及大鼠肝臟細(xì)胞(BRL細(xì)胞)膽固醇清除和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑中關(guān)鍵基因低密度脂蛋白受體(LDLR)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5(ABCG5)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G8(ABCG8)mRNA表達(dá)量的影響，從個(gè)體和細(xì)胞水平初步探討苜蓿皂苷調(diào)控膽固醇清除和轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。采用高脂飼糧建立大鼠高脂模型，測(cè)定苜蓿皂苷對(duì)正常、高脂大鼠血清指標(biāo)[總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量]和肝臟LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響；采用高糖DMEM培養(yǎng)液建立BRL細(xì)胞脂變模型，測(cè)定苜蓿皂苷濃度對(duì)BRL細(xì)胞活性的影響，測(cè)定苜蓿皂苷對(duì)正常、脂變細(xì)胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：1)苜蓿皂苷顯著降低高脂大鼠血清中TG、TC和LDL-C的含量(P<0.05)；2)苜蓿皂苷顯著上調(diào)正常大鼠肝臟LDLR、ABCG5、ABCG8及高脂大鼠ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量(P<0.05)；3)添加200、250 μg/mL苜蓿皂苷顯著提高了BRL細(xì)胞的活性(P<0.05)；4)苜蓿皂苷顯著上調(diào)正常BRL細(xì)胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量(P<0.05)，而對(duì)脂變BRL細(xì)胞各基因mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(P>0.05)。結(jié)果提示，苜蓿皂苷可通過(guò)調(diào)控LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA的表達(dá)來(lái)增加肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇的清除和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低機(jī)體膽固醇的含量。

苜蓿皂苷；大鼠；BRL細(xì)胞；低密度脂蛋白受體；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5；三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G8；mRNA表達(dá)量

隨著社會(huì)現(xiàn)代化的發(fā)展，人們的生活質(zhì)量不斷的提高，但是也帶來(lái)了不利的影響。血脂異常，尤其是飲食中膽固醇含量的升高是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和冠狀動(dòng)脈心臟疾病發(fā)生的主要因素。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界大約每年有1 000多萬(wàn)人由于患有高脂血癥而死亡。我國(guó)大約有9 000萬(wàn)人患有高脂血癥，而且隨著人們生活水平的不斷提高，高脂血癥人群也在不斷的增多，并有年輕化的趨勢(shì)[1]。先前許多大規(guī)模臨床試驗(yàn)證實(shí)，膽固醇含量的降低能夠顯著改善心血管疾病患者的心肌缺血癥狀、緩解心絞痛、改善心臟功能，從而減少心血管疾病的發(fā)生[2-4]。中草藥和植物提取物在降血脂方面的應(yīng)用歷史悠久、資源豐富、效果明顯，且副作用較小，長(zhǎng)期服用耐受性好，具有得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。植物提取物具有來(lái)源廣泛、毒副作用小、降脂作用明顯等優(yōu)點(diǎn)，因此成為近年來(lái)降脂藥物研究開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。大量研究表明，植物中的活性物質(zhì)，如皂苷類、甾醇類、酮類、生物堿類、萜類等，都具有降低機(jī)體膽固醇的作用[5-6]。其中皂苷類物質(zhì)的降脂效果最明顯，也最受關(guān)注。苜蓿皂苷是從紫花苜蓿中提取的具有獨(dú)特生物學(xué)活性的物質(zhì)，是由糖中羥基或非糖類化合物的羥基以縮醛鏈脫水縮合而成的環(huán)狀縮醛鏈物，其結(jié)構(gòu)為五環(huán)三萜烯類化合物[7]。大量的試驗(yàn)研究證明，苜蓿皂苷能夠降低動(dòng)物體內(nèi)膽固醇的含量，良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用使其成為降低膽固醇藥物和綠色飼料添加劑的理想原料[8-9]。機(jī)體主要通過(guò)膽固醇的合成、小腸的吸收、膽汁和糞便的排泄維持膽固醇的動(dòng)態(tài)平衡。三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體(ABC)家族介導(dǎo)的膽固醇單向跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制排出胞外[10]，另外，低密度脂蛋白受體途徑在降低血清膽固醇的含量，調(diào)節(jié)低密度脂蛋白代謝和保持血液中膽固醇正常含量方面起著非常重要的作用[11]。本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究苜蓿皂苷對(duì)正常血脂、高脂水平大鼠及正常、脂變大鼠肝臟細(xì)胞(BRL細(xì)胞)低密度脂蛋白受體(LDLR)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G5(ABCG5)、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G8(ABCG8)mRNA表達(dá)的影響，探討其對(duì)膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和清除途徑中關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)量的影響，從分子水平揭示苜蓿皂苷調(diào)控膽固醇清除和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低膽固醇的機(jī)理，為其在安全、綠色、健康畜產(chǎn)品生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物試驗(yàn)

1.1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

雄性健康SD無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)大鼠32只，體重為(191.41±16.01) g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠適應(yīng)性飼喂1周，之后所有大鼠禁食過(guò)夜，稱量體重，尾動(dòng)脈采血，檢測(cè)血清總膽固醇(TC)含量。并根據(jù)血清TC含量和體重情況將雄性健康SD大鼠32只隨機(jī)分為2組，分別為正常組、高脂組，每組16只，2組之間血清TC含量和體重?zé)o統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。采用飼喂高脂飼糧的方法建立大鼠高脂模型。正常組飼喂基礎(chǔ)飼糧，高脂組飼喂高脂飼料。高脂飼糧組成：1.0%膽固醇、0.1%豬膽鹽、10.0%豬油，5.0%蛋黃粉、5.0%全脂奶粉、78.9%基礎(chǔ)飼糧。建模時(shí)間為4周。每周稱量1次體重，第4周末尾動(dòng)脈采血。建模成功后，根據(jù)血清TC含量和體重分別將正常組和高脂組各隨機(jī)分為2組，每組8只，分組情況及具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：正常對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)飼糧，每天09:00灌胃2 mL蒸餾水；正常皂苷組，飼喂基礎(chǔ)飼糧，每天09:00灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷2 mL；高脂模型組，飼喂高脂飼糧，每天09:00灌胃2 mL蒸餾水；高脂皂苷組，飼喂高脂飼糧，每天09:00灌胃240 mg/kg苜蓿皂苷2 mL。試驗(yàn)期4周。

大鼠均自由飲水、采食，所有飼料和飲用水均經(jīng)過(guò)消毒處理。苜蓿皂苷由河北省滄州市寶恩生物科技有限公司提供，總皂苷含量為51%。

1.1.2 樣本的采集與制備

試驗(yàn)結(jié)束后，所有大鼠禁食過(guò)夜。乙醚麻醉，斷尾采血，4 ℃冰箱傾斜靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心10 min，分離出血清分裝于EP管中，-20 ℃冰箱保存待測(cè)。沿大鼠腹部中部剖開(kāi)，取肝臟，吸干血跡后稱重，將肝臟一分為二，用錫箔紙包裝好后1/2置于-20 ℃度冰箱待測(cè)，另1/2迅速置于液氮中冷凍，并保存于-80 ℃冰箱待測(cè)。

1.1.3 血清相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定

采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中TC、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)含量，TC含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京北化康泰臨床試劑有限公司，TG含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自寧波美康生物科技有限公司，LDL-C和HDL-C含量測(cè)定試劑盒購(gòu)自廣州達(dá)爾斯科生物科技公司，具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書。

1.2 細(xì)胞試驗(yàn)

選取BRL細(xì)胞為試驗(yàn)材料，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生科院細(xì)胞資源中心。

1.2.1 細(xì)胞計(jì)數(shù)

細(xì)胞計(jì)數(shù)步驟如下：1)制備濃度適中的細(xì)胞懸液；2)將計(jì)數(shù)板及蓋片擦拭干凈，并在計(jì)數(shù)板上蓋好蓋片；3)吸出15 μL細(xì)胞懸液，沿著蓋片邊緣緩慢滴加，直至懸液充滿蓋片和計(jì)數(shù)板之間，靜置3 min左右，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中；4)數(shù)計(jì)數(shù)板4大格中的所有細(xì)胞，壓線細(xì)胞只計(jì)左側(cè)和上方的，避免重復(fù)計(jì)數(shù)。鏡下細(xì)胞團(tuán)按單個(gè)細(xì)胞計(jì)數(shù)，若細(xì)胞團(tuán)10%以上，說(shuō)明分散不好，需重新制備細(xì)胞懸液；5)細(xì)胞數(shù)(個(gè)/mL)=4大格細(xì)胞總數(shù)/4×104。

1.2.2 BRL細(xì)胞的培養(yǎng)

將BRL細(xì)胞接種于25 cm培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，鋪滿瓶底即可，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換1次新鮮培養(yǎng)液，定期將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底70%左右時(shí)即可傳代或凍存。

1.2.2.1 脂變BRL細(xì)胞模型的建立[12]

BRL細(xì)胞接種于50 mL的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，采用10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿瓶底，胰酶消化，計(jì)數(shù)后傳代。接種于6孔板中，每孔接種約1.5×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)滿80%后，更換新鮮培養(yǎng)液，在培養(yǎng)液中加入50%胎牛血清，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h至出現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)脂滴或泡沫樣物沉積，即制成脂變肝細(xì)胞模型。將所得細(xì)胞改置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中，使其靜止24 h后，再做相應(yīng)的處理。

1.2.2.2 試驗(yàn)分組

細(xì)胞用六孔板培養(yǎng)，試驗(yàn)分為4個(gè)組，每組6個(gè)重復(fù)，具體分組情況如下。

正常對(duì)照組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，加入100 μL的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

苜蓿皂苷組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后換液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，加入100 μL的300 μg/mL苜蓿皂苷溶解液(終濃度為100 μg/mL)培養(yǎng)24 h。

脂變模型組：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，之后用含50%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，加入100 μL的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

脂變?cè)碥战M：六孔板每孔添加2.9 mL含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，之后用50%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，置于含0.1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中靜止24 h，加入100 μL的300 μg/mL苜蓿皂苷溶解液(終濃度為100 μg/mL)培養(yǎng)24 h。

1.2.3 噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞活性的影響

測(cè)定步驟如下：1)胰酶消化對(duì)數(shù)期細(xì)胞，終止消化后離心收集，制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整其濃度至2×104個(gè)/mL；2)將細(xì)胞懸液制備好后，輕輕混勻，96孔板每孔加入100 μL,這樣待測(cè)細(xì)胞的密度為2 000個(gè)/孔(邊緣孔用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液填充)，每加6個(gè)孔混勻1次，以確保接種的細(xì)胞密度在各孔之間完全相同；3)將接種好的細(xì)胞培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后添加苜蓿皂苷50 μL，5個(gè)梯度，終濃度分別為0(對(duì)照)、50、100、200、250 μg/μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔；4)5% CO237 ℃孵育24 h，倒置顯微鏡下觀察藥物的作用效果；5)每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h；6)3 000 r/min離心5 min后，用移液器將上清移走，注意不能把結(jié)晶移走，每孔加入150 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解；用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔的吸光度值。

1.3 基因mRNA表達(dá)量的測(cè)定

1.3.1 大鼠肝臟、細(xì)胞總RNA提取

總RNA提取步驟如下。1)勻漿的制備。肝臟：將樣品置于用液氮預(yù)冷過(guò)的研缽中，用研磨棒敲碎大塊組織。取30～50 mg肝臟組織，用力研磨至組織呈均勻的白色細(xì)粉末為止。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移到加有Trizol的1 mL EP管。大鼠BRL細(xì)胞：吸去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的上清液，每10 cm2培養(yǎng)皿面積加1 mL Trizol，槍頭上下吹打幾次，轉(zhuǎn)移到EP管中。2)室溫下靜置孵育5 min，使組織或細(xì)胞完全溶解。3)加入200 μL三氯甲烷，蓋好蓋子。4)用手劇烈搖晃15 s。5)4 ℃ 12 000×g離心15 min，可見(jiàn)液體分為3層。6)45°傾斜離心管，移液槍吸取上層水相400 μL左右，移入新的離心管中，操作過(guò)程中應(yīng)避免碰到中間相與有機(jī)相。7)每1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，輕輕翻轉(zhuǎn)搖勻。8)室溫下孵育10 min。9)4 ℃ 12 000×g離心10 min。10)棄去上清液，只留下RNA沉淀。11)每1 mL Trizol加入1 mL 75%的乙醇，洗滌RNA沉淀。12)渦旋振蕩數(shù)秒，4 ℃ 7 500×g離心5 min，棄去洗滌液。13)空氣或真空干燥5～10 min,干燥不要太徹底，以免RNA難以溶解。14)將其重新溶于50 μL不含RNA酶的水中，用槍頭輕輕吹打，55～60 ℃放置10～15 min使RNA完全溶解。15)總RNA保存于-80 ℃，以備后續(xù)試驗(yàn)使用。

1.3.2 總RNA濃度的測(cè)定

采用Thermo微量紫外分光光度計(jì)260 nm處測(cè)定總RNA濃度，并記錄OD260 nm/OD280 nm，結(jié)果在1.8～2.0的樣本滿足要求。

1.3.3 總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

用英國(guó)Syngene公司電泳凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)電泳結(jié)果。

1.3.4 總RNA反轉(zhuǎn)錄

總RNA反轉(zhuǎn)錄采用大連寶生物工程公司提

供的Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)試劑盒進(jìn)行，得到cDNA。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、ABCG5、ABCG8、LDLRDNA序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物序列及參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 引物序列及參數(shù)

1.3.6 熒光定量PCR

本試驗(yàn)采用SYBR qPCR Mix為熒光染料，經(jīng)過(guò)摸索確定最佳反應(yīng)體系如下：SYBR qPCR Mix 5 μL, 焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水3.8 μL,模版cDNA 1 μL，上、下游引物各0.1 μL,反應(yīng)體系為10 μL。按照以下條件設(shè)定熒光定量PCR儀器，進(jìn)行PCR：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，此步驟40個(gè)循環(huán)；溶解曲線，產(chǎn)物20 ℃保存10 min。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法進(jìn)行組間多重比較，以P<0.05差異顯著判斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿皂苷對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響

由表2可知，與正常對(duì)照組比較，高脂模型組大鼠血清TG、TC以及LDL-C含量顯著升高(P<0.05)；苜蓿皂苷組大鼠血清TG、TC、HDL含量略有升高，但差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與高脂模型組相比，高脂皂苷組大鼠血清TG含量顯著下降(P<0.05)，下降幅度17.29%，血清TC含量顯著下降(P<0.05)，下降幅度為12.20%，血清HDL含量變化不顯著(P>0.05)，血清LDL-C含量顯著下降(P<0.05)，下降幅度為21.95%。

2.2 苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響

由表3可知，與正常對(duì)照組相比較，苜蓿皂苷組LDLR、ABCG5和ABCG8 mRNA表達(dá)量分別提高了31.11、6.77和7.26倍，且差異顯著(P<0.05)，高脂模型組和高脂皂苷組LDLRmRNA表達(dá)量分別提高了6.57、4.47倍，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，ABCG5 mRNA表達(dá)量分別提高了2.32、4.37倍，差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)，ABCG8 mRNA表達(dá)量分別提高了2.57、3.40倍，差異顯著(P<0.05)。與高脂模型組相比較，高脂皂苷組LDLRmRNA表達(dá)量有所下降，但差異并不顯著(P>0.05)；ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量均有不同程度的提高，且差異顯著(P<0.05)。

表2 苜蓿皂苷對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響

同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in the same column with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

表3 苜蓿皂苷對(duì)大鼠肝臟LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響

2.3 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞活性的影響

由表4可知，苜蓿皂苷添加終濃度為50、100 μg/mL時(shí)，BRL細(xì)胞活性與對(duì)照組相比差異不顯著(P>0.05)，而200、250 μg/mL時(shí)BRL細(xì)胞活性升高，且與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

表4 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞活性的影響

2.4 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響

由表5可知，與正常對(duì)照組相比較，苜蓿皂苷組LDLRmRNA表達(dá)量提高了3.35倍，且差異顯著(P<0.05)，ABCG5和ABCG8 mRNA表達(dá)量升高，分別為對(duì)照組的1.75、3.27倍，且差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)；脂變細(xì)胞組LDLRmRNA表達(dá)量下降，但差異不顯著(P>0.05)，脂變?cè)碥战MLDLRmRNA表達(dá)量略有上升，但差異不顯著(P>0.05)。脂變細(xì)胞組和脂變?cè)碥战MABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)；與脂變細(xì)胞組相比較，脂變?cè)碥战MLDLRmRNA表達(dá)量有所上升，但差異不顯著(P>0.05)；脂變?cè)碥战MABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量均有不同程度的下降，且差異顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 苜蓿皂苷對(duì)大鼠血清指標(biāo)的影響

血脂是血液中所含各類脂質(zhì)的總稱，包括膽固醇、TG、磷脂(PL)和游離脂肪酸等。高脂血癥是指由于脂肪代謝或運(yùn)轉(zhuǎn)異常使血漿中一種或多種脂質(zhì)高于正常的現(xiàn)象。臨床上把高脂血癥分為以下3類：一是高膽固醇血癥即TC含量增高；二是高甘油三酯血癥即TG含量增高；三是混和型高脂血癥即TC和TG含量均增高。故TC和TG含量是評(píng)定是否得高脂血癥的重要指標(biāo)[13]。高脂血癥目前已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病形成的一個(gè)主要危險(xiǎn)因子[14-15]。大量研究表明，苜蓿皂苷能夠降低血脂水平，具有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化效應(yīng)[16]。Yu等[17]的研究表明，苜蓿皂苷能夠顯著降低高脂小鼠血液中TC、TG和LDL-C含量。Malinow等[18]的研究表明，苜蓿皂苷能夠降低血清TC的含量而不改變高密度脂蛋白的含量，增加膽汁酸和中性膽固醇的排泄。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加苜蓿皂苷后高脂皂苷組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量顯著降低，與前人的研究結(jié)果一致。

表5 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響

3.2 苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞活性的影響

苜蓿皂苷具有溶血作用，將皂苷水溶液注射入血液，低濃度時(shí)即可使紅細(xì)胞破裂。一般認(rèn)為溶血作用與皂苷和紅細(xì)胞膜中膽固醇的相互作用有關(guān)。本試驗(yàn)用MTT法檢測(cè)苜蓿皂苷對(duì)BRL細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以確定苜蓿皂苷對(duì)這種細(xì)胞是否具有毒性，并確定細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中苜蓿皂苷的添加量，為后續(xù)試驗(yàn)打下基礎(chǔ)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，苜蓿皂苷濃度在100 μg/mL以下時(shí)對(duì)BRL細(xì)胞的活性并無(wú)影響，故選取100 μg/mL作為細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中苜蓿皂苷的添加量。

3.3 苜蓿皂苷對(duì)膽固醇清除和轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

前人對(duì)植物皂苷降低膽固醇機(jī)理方面的研究主要集中在物理化學(xué)方面，即皂苷在腸道中和膽固醇結(jié)合形成不溶性的復(fù)合物，分子方面的研究很少且不系統(tǒng)。王先科等[19]的研究表明，苜蓿皂苷降低高脂血癥大鼠膽固醇的作用可能與抑制大鼠乙酰輔酶A乙酰基轉(zhuǎn)移酶2(ACAT-2)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，降低膽固醇的吸收，促進(jìn)膽固醇7-羥化酶(CYP7A1)的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，加速膽固醇向膽汁酸的轉(zhuǎn)變有關(guān)。Yu等[17]研究了苜蓿皂苷對(duì)高脂血癥大鼠膽固醇代謝的影響，發(fā)現(xiàn)脂蛋白脂酶(LPL)、肝脂酶(HTGL)的活性和mRNA的表達(dá)量均顯著升高，從而推測(cè)苜蓿皂苷降低膽固醇的效應(yīng)是由肝臟脂蛋白酯酶的活性升高引起的。本試驗(yàn)從動(dòng)物個(gè)體和細(xì)胞2種水平上，研究了苜蓿皂苷對(duì)膽固醇清除和分泌途徑中關(guān)鍵基因LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量的影響，從分子水平探討苜蓿皂苷調(diào)控膽固醇清除和轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而降低膽固醇的機(jī)理。

LDLR是位于細(xì)胞表面的跨膜受體，主要功能是參與低密度脂蛋白(LDL)的代謝過(guò)程，血漿中LDL攜帶的膽固醇主要是通過(guò)肝細(xì)胞LDLR清除，LDLR對(duì)LDL的吞噬與清除是LDL代謝過(guò)程中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。LDLR途徑在降低血清膽固醇的含量、調(diào)節(jié)低密度脂蛋白代謝和保持血液中膽固醇正常含量方面起著非常重要的作用[11]。血清中近2/3的LDL-C是通過(guò)這一內(nèi)吞途徑清除的，LDL-C被攝入量的多少取決于LDLR的數(shù)量和活性，因此LDLR對(duì)維持血漿中的LDL-C和膽固醇含量發(fā)揮著重要作用[20]。大量研究表明，植物活性成分能夠通過(guò)調(diào)節(jié)LDLRmRNA的表達(dá)來(lái)調(diào)控機(jī)體內(nèi)膽固醇的含量。羅艷等[21]研究表明，姜黃素能夠顯著降低血液中膽固醇的含量，其機(jī)理可能為姜黃素顯著增加LDLR的數(shù)量和活性，從而起到降膽固醇的作用。竇曉兵[22]進(jìn)一步研究了其機(jī)理，結(jié)果表明姜黃素可以通過(guò)激活膽固醇調(diào)節(jié)元件(SRE)促進(jìn)LDLR的表達(dá)，或者是通過(guò)逆轉(zhuǎn)受胰島素誘導(dǎo)2(Insig2)抑制的膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)通路上調(diào)LDLR的表達(dá)。劉凱等[23]研究了大槐合劑對(duì)試驗(yàn)大鼠臟器攝取LDL和膽固醇排泄的影響，結(jié)果表明大槐合劑可以顯著增強(qiáng)臟器對(duì)LDL的攝取，有效促進(jìn)膽固醇自體內(nèi)的排出。本試驗(yàn)結(jié)果表明，添加苜蓿皂苷后，正常和高脂水平大鼠肝臟LDLRmRNA的表達(dá)量均成倍增加；正常BRL細(xì)胞LDLRmRNA表達(dá)量上升，其結(jié)果與正常大鼠動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果相近，而苜蓿皂苷對(duì)脂變BRL細(xì)胞LDLRmRNA表達(dá)量的影響不大。這說(shuō)明苜蓿皂苷可通過(guò)調(diào)控LDLR mRNA表達(dá)量來(lái)加速正常肝細(xì)胞內(nèi)膽固醇的吞噬與清除。

ABCG5和ABCG8是ABC超家族G亞家族的新成員[24]，是膽固醇進(jìn)入膽汁的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，它們的表達(dá)量增加后肝臟膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)增加，中性膽固醇排泄選擇性增多以及膽固醇合成代償性增加；阻斷這對(duì)基因后血漿和肝臟膽固醇含量對(duì)于飲食膽固醇含量的應(yīng)答明顯增加。在肝臟內(nèi)表達(dá)的ABCG5、ABCG8分子對(duì)膽汁膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)具有決定作用。Yu等[25-26]研究發(fā)現(xiàn)，ABCG5、ABCG8基因敲除的小鼠中，膽汁膽固醇分泌急劇減少，而在ABCG5、ABCG8轉(zhuǎn)基因鼠中膽汁酸膽固醇含量顯著增多，糞便中性膽固醇含量也顯著增多。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加苜蓿皂苷后，正常和高脂水平大鼠肝臟ABCG5、ABCG8 mRNA的表達(dá)量均成倍增加；正常BRL細(xì)胞ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量上升，其結(jié)果與正常大鼠動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果相一致，而苜蓿皂苷對(duì)脂變BRL細(xì)胞ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量影響不大。這說(shuō)明苜蓿皂苷可通過(guò)調(diào)控ABCG5、ABCG8 mRNA的表達(dá)來(lái)增加正常肝細(xì)胞內(nèi)源性膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而減少膽固醇的含量。本試驗(yàn)中,苜蓿皂苷可顯著影響高脂大鼠肝臟LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA的表達(dá)，但對(duì)脂變BRL細(xì)胞中各基因的表達(dá)無(wú)顯著影響，推測(cè)苜蓿皂苷對(duì)高脂大鼠肝臟膽固醇清除和轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)控可能是代償性的而非直接作用，具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

① 苜蓿皂苷顯著降低了高脂血癥大鼠血清中TG、TC以及LDL-C的含量。

② 添加苜蓿皂苷后,正常和高脂水平大鼠肝臟LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA的表達(dá)量均成倍增加；正常BRL細(xì)胞LDLR、ABCG5、ABCG8 mRNA表達(dá)量上升，而苜蓿皂苷對(duì)脂變BRL細(xì)胞各基因mRNA表達(dá)量的影響不大。這說(shuō)明血脂水平影響大鼠體內(nèi)膽固醇的代謝，因此研究苜蓿皂苷對(duì)膽固醇代謝的影響時(shí)應(yīng)考慮血脂水平的差異。

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*Corresponding author, professor, E-mail： annysyh@126.com

(責(zé)任編輯 王智航)

Effects of Alfalfa Saponins on mRNA Expressions of Low-Density Lipoprotein Receptor and Adenosine Triphosphate Binding Cassette Transporters in Liver and Liver Cells of Rats

LIU Boshuai WANG Wenjing CHEN Yanyan ZHU Xiaoyan YUAN Dedi QI Shengli WANG Chengzhang SHI Yinghua*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

This experiment was conducted to investigate the effects of alfalfa saponins (AS) on mRNA expressions of low-density lipoprotein receptor (LDLR), adenosine triphosphate binding cassette transporter G5 (ABCG5) and adenosine triphosphate binding cassette transporter G8 (ABCG8) in liver and liver cells of rats, and discuss the mechanism of AS regulating cholesterol elimination and transportation at both individual and cellular levels. Hyperlipidemic rat model was set up using high fat diet, and the effects of AS on serum indexes [total cholesterol (TC), triglyceride (TG), low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) and high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) contents] and liverLDLR,ABCG5 andABCG8 mRNA expressions of normal and hyperlipidemic rats were determined; hyperlipidemic cell model was set up using high DMEM culture medium, the effects of AS concentration on BRL cell activity, and AS onLDLR,ABCG5 andABCG8 mRNA expressions of normal and hyperlipidemic cells were determined. The results showed as follows: 1) AS significantly decreased the contents of triglyceride, total chelesterol and low-density lipoprotein cholesterol in serum of hyperlipidemic rats (P<0.05); 2) AS significantly up-regulated mRNA expressions ofLDLR,ABCG5 andABCG8 in liver of normal rats and those of ABCG5 and ABCG8 in liver of hyperlipidemic rats (P<0.05); 3) the supplementation of 200 and 250 μg/mL AS increased BRL cell activity (P<0.05); 4) AS significantly up-regulated mRNA expressions ofLDLR,ABCG5 andABCG8 of normal BRL cells (P<0.05), however, AS had no significant effects on those of hyperlipidemic BRL cells. The results indicate that AS may accelerate the elimination and transportation of cholesterol by up-regulating mRNA expressions ofLDLR,ABCG5 andABCG8, and then reduce the content of cholesterol in body.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(4)：1437-1445]

alfalfa saponins; rat; BRL cell; low-density lipoprotein receptor; adenosine triphosphate binding cassette transporter G5; adenosine triphosphate binding cassette transporter G8; mRNA expression

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.04.043

2016-09-08

國(guó)家自然科學(xué)基金(31301983)；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35)；河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科技創(chuàng)新基金(30600968)

劉伯帥(1993—),男，河南新鄉(xiāng)人，碩士研究生，從事牧草營(yíng)養(yǎng)與利用研究。E-mail： 1339712268@qq.com

*通信作者:史瑩華，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： annysyh@126.com

S816.7

A

1006-267X(2017)04-1437-09