張倩+鄭斐+秦偉捷 錢小紅

摘要 蛋白質(zhì)組學(xué)通過規(guī)?；b定、分析從細(xì)胞、組織或有機(jī)體中提取的蛋白質(zhì)，從而獲得蛋白表達(dá)、修飾、組成和定量的變化信息。在目前最為有效的“鳥槍法”蛋白質(zhì)組學(xué)策略中，固定化酶試劑基質(zhì)常用固相載體材料，該固定化酶試劑在酶解蛋白質(zhì)時(shí)為異相體系，存在固液界面?zhèn)髻|(zhì)阻力和空間位阻，限制了酶解效率和樣品處理通量。針對(duì)這一技術(shù)瓶頸，本研究利用溫敏聚合物對(duì)外界溫度變化的響應(yīng)能力，制備了一種新型的基于可溶性溫敏聚合物的固定化胰蛋白酶試劑。該固定化酶特有的溫度敏感特性，使其具有“高溫均相酶解，低溫異相分離”的特色，且兼具酶切時(shí)間顯著縮短、酶可重復(fù)利用的優(yōu)勢(shì)。BSA1min固定化酶解產(chǎn)物肽段的氨基酸序列覆蓋率可達(dá)94%，高于傳統(tǒng)溶液酶解12h所得覆蓋率為（74%）。進(jìn)一步將該固定化酶試劑應(yīng)用于HeLa細(xì)胞全蛋白質(zhì)組的酶解，其酶解效果與相同條件下溶液酶解12h相當(dāng)。該固定化酶試劑對(duì)復(fù)雜蛋白質(zhì)的快速、高效酶解充分證明其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞固定化酶；溫度敏感型聚合物；質(zhì)譜鑒定；蛋白質(zhì)組學(xué)；快速酶解

1引言

蛋白質(zhì)組學(xué)通過對(duì)從細(xì)胞、組織或有機(jī)體中提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行規(guī)?；治鲨b定，系統(tǒng)性的獲得蛋白表達(dá)、修飾、組成和定量的變化信息[1，2＼]，已成為生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中的熱點(diǎn)領(lǐng)域。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的研究策略是基于質(zhì)譜的“鳥槍法”策略，該策略利用蛋白酶將蛋白樣品酶解為肽段混合物，然后通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS）分析鑒定肽段樣品，最后將所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)在數(shù)據(jù)庫(kù)中搜庫(kù)檢索，從而獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息[3，4＼]。在這一策略中，蛋白質(zhì)的定性、定量信息都是通過對(duì)其酶解肽段產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定得到的，因此，蛋白質(zhì)的酶解成為該研究策略中至關(guān)重要的一步。在“鳥槍法”策略中，目前廣泛使用的溶液酶解方法所需時(shí)間過長(zhǎng)（12～24h），嚴(yán)重限制了樣品的處理速度和通量。而且溶液酶解中的蛋白酶只能單次使用，無法回收，導(dǎo)致使用成本較高。固定化蛋白酶試劑可避免蛋白酶自身酶解效應(yīng)，并且顯著提高了酶與底物的投料比，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了酶解效率；另外，固定化蛋白酶可回收重復(fù)使用，大大降低了蛋白酶的使用成本[5～7＼]。目前已報(bào)道了多種不同的蛋白酶固定化方法及固定化載體材料，如介孔材料[8，9＼]、毛細(xì)管石英柱[10，11＼]、芯片材料[12，13＼]、二氧化硅材料[14，15＼]或磁性納米顆粒[16，17＼]。但是，目前所使用的固定化載體多為固相材料，固定化蛋白酶與溶液中的蛋白質(zhì)底物在異相體系中進(jìn)行酶解反應(yīng)，固液界面的傳質(zhì)阻力和固相材料的空間位阻限制了固定化酶與底物的碰撞和酶解效率的進(jìn)一步提高。

針對(duì)上述技術(shù)瓶頸，本研究提出并發(fā)展了基于溫敏聚合物載體的固定化蛋白酶，利用溫敏聚合物的溫度敏感特性，通過控制溫敏聚合物固定化蛋白酶所處環(huán)境溫度使其在溶解和不溶解間相互轉(zhuǎn)換，從而在溶液中呈現(xiàn)不同狀態(tài)，以達(dá)到“均相酶解，異相分離”的目的。溫度敏感型聚合物水溶液通常具有相轉(zhuǎn)變溫度，其中一類為最高臨界溶解溫度（UCST）型，當(dāng)環(huán)境溫度高于其相轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，聚合物在水溶液中呈完全溶解狀態(tài)；當(dāng)環(huán)境溫度達(dá)到或低于該聚合物的相轉(zhuǎn)變溫度時(shí)，聚合物開始聚集，析出沉淀[18，19＼]。本研究以N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）為溫度響應(yīng)基團(tuán)，合成了具有UCST溫度響應(yīng)能力的N丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛（poly（NAGAcoUnAl））溫敏聚合物，將該溫敏聚合物作為載體材料，制備得到新型可溶性溫敏固定化胰蛋白酶。通過控制反應(yīng)體系溫度使固定化酶對(duì)蛋白質(zhì)樣本實(shí)現(xiàn)了“高溫均相酶解，低溫異相分離”，消除了固定化蛋白酶酶解時(shí)的固液界面?zhèn)髻|(zhì)阻力和空間位阻，大大縮短了酶解時(shí)間，提高了酶解效率。常用的固定化酶方法大多用固相載體制備，酶解均在異相體系反應(yīng)；相較于此，本研究制備的固定化酶試劑，在37℃超聲溶解，與蛋白進(jìn)行均相反應(yīng)，置于冰水浴中，固定化酶試劑團(tuán)聚沉淀，與酶解肽段分離，達(dá)到異相分離，酶解效率提高，酶解效果比固相載體高。此固定化蛋白酶試劑在標(biāo)準(zhǔn)蛋白和復(fù)雜樣本中均取得良好效果，證明其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用潛力。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

基質(zhì)輔助激光解析飛行時(shí)間質(zhì)譜（NewultrafleXtremeMALDITOF/TOFMS），EQUINOX55型傅里葉紅外光譜儀（FTIR）均購(gòu)自德國(guó)Bruker公司；四極桿靜電場(chǎng)軌道阱組合高分辨串聯(lián)質(zhì)譜儀（QExactivePlusOrbitrapMS），液相色譜（EasynLC1000），均購(gòu)自美國(guó)ThermoFisherScientific公司。

牛血清白蛋白（BSA，98%）、胰蛋白酶（90%）、甘氨酰胺鹽酸鹽（98%）、丙烯酰氯（98%）、10十一烯醛（UnAl，95%）、氰基硼氫化鈉（99%）、偶氮二異丁腈（AIBN，99%），均購(gòu)自美國(guó)SigmaAldrich公司；實(shí)驗(yàn)用水為MilliQ去離子水。

2.2實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）的合成溫敏單體NAGA的具體步驟參考文獻(xiàn)＼[18＼]。

2.2.2UCST溫敏型共聚物poly（NAGAcoUnAl）的合成

控制合成共聚物的單體的起始摩爾比為NAGAKG-3∶KG-5UnAl=4KG-3∶KG-51，利用自由基聚合反應(yīng)，合成UCST溫敏型共聚物poly（NAGAcoUnAl）。步驟同文獻(xiàn)＼[18＼]。

2.2.3胰蛋白酶在poly（NAGAcoUnAl）上的固定將10mgpoly（NAGAcoUnAl）共聚物溶解于500μL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中，再依次加入4mg胰蛋白酶與5mg氰基硼氫化鈉，將混合體系在24℃下振蕩反應(yīng)3h。將體系置于冰水浴中靜置2min，待體系出現(xiàn)明顯渾濁后，在4℃以10000r/min離心10min，收集上清液，將不溶物溶解于1mL50mmol/LNH4HCO3溶液中，再次置于冰水浴中降溫并高速離心進(jìn)行分離，此過程重復(fù)3次，以洗去未固定的胰蛋白酶，得最終產(chǎn)物poly（NAGAcoUnAl）trypsin固定化酶。收集清洗過程中所有上清液，用于測(cè)定載體材料對(duì)胰蛋白酶的固載量。

2.2.4Poly（NAGAcoUnAl）trypsin固定化酶酶解標(biāo)準(zhǔn)蛋白將40μg牛血清白蛋白（BSA）溶解于50mmol/LNH4HCO3溶液中至1μg/μL，加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度為10mmol/L，95℃下加熱10min，待冷卻后加入碘乙酰胺（IAA）至終濃度為50mmol/L，暗處放置1h。

將變性后的BSA溶液加入到poly（NAGAcoUnAl）trypsin中充分混合，置于37℃水浴中超聲酶解1min。然后迅速將混合物置于冰水浴中靜置2min后，在4℃以10000r/min離心10min，收集上清液，不溶物再用50μL水清洗，將上清液與第一次的溶液混合，脫鹽后用于質(zhì)譜鑒定。不溶物用50mmol/LNH4HCO3溶液反復(fù)清洗后，于4℃保存。

2.2.5對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA酶解產(chǎn)物和人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）全蛋白的酶解的質(zhì)譜鑒定使用MALDITOF/TOFMS對(duì)BSA酶解產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并使用Moscot在線搜庫(kù)對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行肽指紋譜圖分析。

對(duì)HeLa細(xì)胞全蛋白的固定化酶解操作與上述對(duì)BSA的步驟相同。所得酶解產(chǎn)物使用LCQExactivePlusMS鑒定后由軟件ProteinDiscoverer1.3搜庫(kù)分析。

3結(jié)果與討論

本研究中的溫敏聚合物poly（NAGAcoUnAl）是通過N丙烯酰甘氨酰胺和十一烯醛的自由基聚合反應(yīng)得到的。其中，N丙烯酰甘氨酰胺提供具有溫度敏感特性的官能團(tuán)，十一烯醛提供醛基官能團(tuán)，通過醛基與胰蛋白酶N端或氨基酸側(cè)鏈的氨基反應(yīng)將胰蛋白酶固定到溫敏聚合物上。UCST溫敏共聚物固定化胰蛋白酶的制備流程如圖1所示。

本研究制備的UCST溫敏聚合物固定化胰蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的酶解過程如圖2所示。利用此溫敏聚合物的溫度響應(yīng)特性，即在體系溫度高于UCST時(shí)處于溶解狀態(tài)，其與蛋白質(zhì)樣本形成均相體系，消除了固液界面的傳質(zhì)阻力，并降低了空間位阻，有效提高了固定化酶的酶解效率；在體系溫度低于其UCST時(shí)，團(tuán)聚析出形成沉淀，便于與酶解產(chǎn)物的有效分離和酶的簡(jiǎn)便回收，從而實(shí)現(xiàn)了“高溫均相酶解低溫異相分離”的固定化酶解新策略。

兩個(gè)紅外譜圖中均存在的1550和1650cm 1兩處強(qiáng)烈的吸收峰屬于NAGA側(cè)基上的JG（NZJYHJG）伸縮振動(dòng)和JG（CZJLX，YOJG）伸縮振動(dòng)；2930cm 1處的吸收峰屬于聚合物骨架上的JG（CH2ZJZ；YJG）伸縮振動(dòng)；（b）中出現(xiàn)的2850cm 1處的吸收峰屬于醛基的JG（CZJYHJG）鍵特征吸收峰，表明在與UnAl共聚合之后，醛基被成功引入。上述結(jié)果證明所得聚合物由NAGA和UnAl兩種單體共聚所得，溫敏聚合物同時(shí)具備溫敏響應(yīng)基團(tuán)和可用于胰蛋白酶固定的醛基官能團(tuán)。

3.1.2UCST溫敏共聚物的溫敏性能考察poly（NAGAcoUnAl）在水溶液中的溫敏性能如圖4所示，poly（NAGAcoUnAl）溫敏聚合物表現(xiàn)出了良好的UCST型溫度響應(yīng)能力。

在溫度處于共聚物的UCST以上時(shí)，共聚物可完全溶解于水中，形成澄清透明的溶液（圖4a）；而當(dāng)溫度冷卻至其UCST以下時(shí)，共聚物分子發(fā)生締合，從溶液中析出，

體系出現(xiàn)明顯的渾濁（圖4b）；經(jīng)高速離心后與溶液分離（圖4c），從而達(dá)到“高溫均相溶解，低溫異相分離”的目的。JPPS01764.eps，Y，PZ#TS（（1HT5”SS

圖4溫敏聚合物poly（NAGAcoUnAl）在水中不同溫度下呈現(xiàn)的不同狀態(tài)（a）為加熱后形成的澄清透明溶液，（b）為溶液冰水浴后形成的乳狀懸濁液，（c）為乳狀懸濁液經(jīng)高速離心后形成的團(tuán)聚沉淀

3.1.3poly（NAGAcoUnAl）的胰蛋白酶固載能力測(cè)試為考察poly（NAGAcoUnAl）對(duì)胰蛋白酶的固載能力，采用超微量分光光度計(jì)測(cè)定胰蛋白酶

溶液在固定前、后溶液中A280處吸光值的變化，計(jì)算出胰蛋白酶固定前、后的濃度差，再進(jìn)一步計(jì)算得出一定質(zhì)量溫敏聚合物的胰蛋白酶固載量，測(cè)定poly（NAGAcoUnAl）對(duì)蛋白酶的固載能力為247.7μg/mg。

繼續(xù)考察溫敏聚合物固定化胰蛋白酶的酶活性，使用固定化酶酶解N苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE），通過測(cè)量不同時(shí)間酶解BAEE溶液的吸光度，得到溫敏聚合物固定化酶的酶活力為228.3U/mg，即單位質(zhì)量的溫敏聚合物上負(fù)載的酶能夠酶解228.3UBAEE。

計(jì)算公式：其中，P為每1mg供試品中含胰蛋白酶的量；A1為直線上終止的吸光度；A2為直線上開始的吸光度；T為A1～A2的讀數(shù)時(shí)間（min）；W為測(cè)定液中含供試品的量（mg）；0.001為在上述條件下，1mL底物的吸收度1min改變0.001，即相當(dāng)于1個(gè)BAEE單位（U）；V為底物體積（mL）。胰蛋白酶的單位定義為：以BAEE為底物，在一定反應(yīng)條件下，每分鐘使ΔA253nm增加0.001的酶量為1UBAEE。

3.2UCST溫敏共聚物固定化胰蛋白酶的應(yīng)用

3.2.1固定化胰蛋白酶的酶解效率本實(shí)驗(yàn)分別使用UCST溫敏聚合物固定化胰蛋白酶及溶液酶對(duì)牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行平行酶解實(shí)驗(yàn)，來考察固定化酶的酶解效率。固定化酶酶解的操作過程如圖2所示。酶解產(chǎn)物使用MALDITOF/TOFMS進(jìn)行鑒定，一級(jí)質(zhì)譜圖如圖5所示。1min固定化酶解BSA，鑒定到84條肽段，氨基酸序列覆蓋率可達(dá)94%。而溶液酶解，雖然經(jīng)過長(zhǎng)達(dá)12h孵育，卻只能鑒定到68條肽段，達(dá)到74%的氨基酸序列覆蓋率，明顯低于固定化酶解的結(jié)果（表1）。相比于溶液酶解所需的孵育時(shí)間12h，

固定化酶酶解僅需1min即可完成酶解，具有極大的效率和通量?jī)?yōu)勢(shì)。這是由于UCST溫敏共聚物固定化酶在37℃條件下可完全溶解于溶液中，

形成均相體系，消除了固液界面的傳質(zhì)阻力并降低了空間位阻，有效促進(jìn)了酶與底物蛋白的碰撞。同時(shí)，固定化酶具有超高的酶固載量，使得體系內(nèi)的酶底物蛋白比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于溶液酶解中酶與蛋白比，在等量蛋白底物存在的情況下，固定化酶的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于溶液酶的量，在固定化酶解過程中，酶與底物蛋白的碰撞幾率成倍提高，從而大大加快了酶解反應(yīng)的進(jìn)行。

3.2.2固定化胰蛋白酶酶解的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性稱量10mg溫敏聚合物poly（NAGAcoUnAl），將其固定上胰蛋白酶。將此固定化酶在一個(gè)月內(nèi)重復(fù)15次酶解40μgBSA。每次所得BSA酶解產(chǎn)物經(jīng)MALDITOF質(zhì)譜鑒定，15次酶解所得氨基酸序列覆蓋率在82%～94%之間（均高于溶液酶解74%的序列覆蓋率），波動(dòng)范圍小于10%，平均覆蓋率達(dá)89%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為3.9%，如圖6所示。結(jié)果表明，此固定化酶能夠多次重復(fù)使用，且表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

3.2.3HeLa細(xì)胞全蛋白酶解產(chǎn)物質(zhì)譜鑒定本實(shí)驗(yàn)對(duì)HeLa細(xì)胞全蛋白的固定化酶解操作與上述對(duì)BSA的步驟相同，固定化酶解產(chǎn)物以及溶液酶解產(chǎn)物均經(jīng)LCQExactivePlusMS質(zhì)譜鑒定一次，搜庫(kù)后結(jié)果如表2所示。經(jīng)1min固定化酶解后鑒定到15012條肽段，歸屬于2659個(gè)蛋白。其中368條肽段含兩個(gè)漏切位點(diǎn)，含1個(gè)漏切位點(diǎn)的肽段有3191條。經(jīng)12h溶液酶解后鑒定到16215條肽段，歸屬CM（20于2754個(gè)蛋白。其中566條肽段含兩個(gè)漏切CM）

位點(diǎn)，含1個(gè)漏切位點(diǎn)的肽段有3624條。綜上ZH（可知，固定化酶具備快速、高效酶解的能力，而且酶解產(chǎn)物鑒定蛋白和肽段數(shù)量與溶液酶解相當(dāng)，但酶解時(shí)間縮短720倍，同時(shí)帶有漏切位點(diǎn)的肽段數(shù)量也有所降低。

通過合成poly（NAGAcoUnAl）溫敏聚合物，成功制備出UCST溫敏聚合物固定化胰蛋白酶。該溫敏聚合物特有的溫度響應(yīng)特性，使制備的溫敏聚合物固定化胰蛋白酶具有“高溫均相酶解，低溫異相分離”的特色和優(yōu)勢(shì)，可以很好地滿足當(dāng)前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，快速、高效、高通量的鑒定需求；同時(shí)，作為一種新型通用型載體材料，其在固定化酶領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。ZH）

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AbstractBymassivelyanalyzingproteinsextractedfromcells，tissuesandorganismsusingmassspectrometry，proteomicsiscapableofprovidinginformationaboutchangeinproteinsexpression，modification，compositionandquantification.However，mostimmobilizedenzymesusedinmassspectrometrybased"shotgun"proteomicstrategyarepreparedusingsolidmaterialsastheimmobilizationmatrixanddigestthesubstrateproteinsinheterogeneoussystem.Theinherentmasstransferresistanceinthesolidliquidinterfaceandsterichindranceofthesolidmatrixlimitsthedigestionefficiencyandsampleprocessingthroughput.Here，wepreparedanovelimmobilizedenzymeusingsolublethermosensitivepolymerasthematrixmaterialbyexploitingthethermoresponsiveabilityofthepolymertoenvironmentaltemperaturechanges.Thethermosensitiveimmobilizedtrypsinhadthefeatureof“homogeneousdigestionathightemperatureandheterogeneousseparationatlowtemperature”andtheadvantageofsignificantlyshorteneddigestiontimeandrecoverandreuseoftheenzyme.Anaminoacidsequencecoveringupto94%in1mindigestionwasobtained，whichwashigherthanthatof74%obtainedbyinsolutiondigestionfor12h.Finally，theimmobilizedtrypsinwassuccessfullyappliedtofastandhighlyefficientdigestionofcomplexproteomeextractedfromHeLacell.Theefficiencyofimmobilizeddigestionin1minwassimilartothatofsolutiondigestionin12h，whichsufficientlydemonstratedtheapplicationpotentialofthisthermosensitiveimmobilizedtrypsininproteomicsresearch.

KeywordsImmobilizedenzyme；Thermosensitivepolymer；Massspectrometry；Proteomics；Fastdigestion

HQWT6JY（Received10March2016；accepted11July2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalKeyProgramforBasicResearchofChina（Nos.2013CB911204，2016YFA0501403），theNationalKeyScientificInstrumentDevelopmentProgramofChina（No.2011YQ09000504），theNationalHighTechResearchandDevelopmentProgramofChina（No.2014AA020906），andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21275005，21235001，21405175and21675172）.