李姝靜，周自若，周 威，王心蕊，袁 麗

（北京工商大學理學院化學系，北京 100048）

根皮素與兩種β-環(huán)糊精衍生物的包合作用及性質(zhì)

李姝靜，周自若，周 威，王心蕊，袁 麗

（北京工商大學理學院化學系，北京 100048）

采用相溶解度法定量研究甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，Me-β-CD）及羥丙基-β-環(huán)糊精（(2-hydroxy) propyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）與根皮素的包合作用，通過冷凍-干燥法成功制備了水溶性良好的包合物。并利用紅外光譜、粉末X射線衍射、掃描電子顯微鏡研究分析根皮素及其包合物的結構。此外，通過測定還原能力及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力，檢測根皮素及其包合物的抗氧化能力，并探究其對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活力的影響。結果表明：成功制備了根皮素與Me-β-CD、HP-β-CD物質(zhì)的量比1∶1的包合物，包合作用顯著提升了根皮素在水中的溶解度及抗氧化能力，有助于其加工成為水基化保健食品劑型。此外，根皮素及其包合物對酪氨酸酶均有良好的抑制效果，可作為天然、高效、環(huán)保的食品保鮮劑。

根皮素；β-環(huán)糊精衍生物；包合物；溶解性；抑制酪氨酸酶能力；抗氧化能力

根皮素屬于二氫查耳酮類化合物，作為一種天然的活性物質(zhì)廣泛分布于蘋果、梨等多汁水果的根皮中，故名“根皮素”[1]。已有大量研究報道表明，根皮素具有降低血糖、改善記憶力、抗癌[2-3]及抗炎[4]等功效。同時，它還具有抗氧化[5]及抑制酪氨酸酶活性的能力[6]。一些食品如蔬菜、肉類等長時間處在空氣中，易氧化分解成為低級脂肪酸等物質(zhì)，造成食品酸敗。而一些海洋產(chǎn)品及水果飲料等由于酪氨酸酶的酶促作用，易導致結構中的酚類被氧化成黑色素，從而導致食品褐變、變質(zhì)。根皮素可以有效地防止食品的酸敗變黑，因此可作為良好的抗氧化劑及水果保鮮劑應用到食品工業(yè)中[7]。但是，由于根皮素較低的水溶性，限制了其在食品領域中的發(fā)展。

環(huán)糊精（cyclodextrins，CDs）是由α-1,4-糖苷鍵連接多個D（+）-葡萄糖單元形成的環(huán)狀化合物，形狀類似截去尖部的中空圓筒立體錐。環(huán)糊精外側(cè)通過C2、C3形成的仲羥基及C6構成的伯羥基使之具有親水性，而內(nèi)層空腔則因受到C—H鍵的屏蔽作用而具有疏水性[8]。利用這種特性，環(huán)糊精可以包合許多具有疏水性質(zhì)的化合物，提高難溶性物質(zhì)的水溶性及對抗光、熱時的穩(wěn)定性[9-10]。β-CD由于其廉價、具有適中的空腔尺寸、容易形成包合物等特點，應用最為廣泛。但由于其較低的水溶性限制了應用。甲基-β-環(huán)糊精（methyl-β-cyclodextrin，Me-β-CD）、羥丙基-β-環(huán)糊精（(2-hydroxy) propyl-βcyclodextrin，HP-β-CD）等衍生物因具有水溶性好、無毒性等優(yōu)點[11-12]，常用來替代β-CD進行包合。

本實驗采用冷凍-干燥法制備了根皮素與Me-β-CD及HP-β-CD的包合物，通過相溶解度法、紅外光譜分析、粉末X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）譜圖及掃描電子顯微鏡（scanning electron microscopy，SEM）研究了CDs與根皮素的主客體作用，并考察了包合作用對抗氧化性和抑制酪氨酸酶活性的影響，有助于根皮素加工成為水基化保健食品劑型，擴大應用領域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

根皮素（純度＞98%）、氫醌、酪氨酸酶（25 kU）、L-多巴（純度＞9 9%）、三氯乙酸、鐵氰化鉀（K3Fe(CN)6）、三氯化鐵 阿拉丁公司；L-酪氨酸國藥集團化學試劑有限公司；熊果苷、Me-β-CD（M= 1 310 g/mol，取代度為12.5） 北京百靈威科技有限公司；HP-β-CD（M=1 380 g/mol，取代度為4.2） 上海西寶生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

CARY-60分光光度計 美國瓦里安公司；D/MAX 2500V/PC X射線衍射儀 德國布魯克公司；VEGA Ⅱ掃描電子顯微鏡 捷克Tescan公司。

1.3 方法

1.3.1 根皮素/Me-β-CD、根皮素/HP-β-CD包合物的制備

根皮素分別與Me-β-CD、HP-β-CD按物質(zhì)的量比3∶1配制。根皮素溶于乙醇，環(huán)糊精溶于去離子水中，然后將根皮素溶液緩慢加入到環(huán)糊精溶液中，磁力攪拌3 d，經(jīng)旋轉(zhuǎn)-蒸發(fā)除去大部分溶劑，剩余樣品用0.45 μm的濾膜過濾，濾液經(jīng)冷凍干燥后即得包合物。

1.3.2 根皮素/Me-β-CD、根皮素/HP-β-CD的物理混合物

將根皮素分別與兩種環(huán)糊精按照物質(zhì)的量比1∶1混合，在瑪瑙研缽中充分研磨使其混合均勻。

1.3.3 相溶解度的測定

稱取過量的根皮素依次加入不同濃度的Me-β-CD與HP-β-CD的水溶液中，然后將樣品放入水浴恒溫振蕩器中，保持水溫為25 ℃、振動頻率為120 r/min的條件進行充分振蕩，反應48 h。最后用0.45 μm的濾膜除去不溶的根皮素。通過紫外-可見分光光度計測定濾液中根皮素的含量，然后分別以Me-β-CD及HP-β-CD的濃度為橫坐標，根皮素的溶解度為縱坐標，繪制根皮素的相溶解度曲線并根據(jù)式（1）計算包合平衡常數(shù)（KS）[13]。

式中：S0表示在25 ℃的條件下不添加環(huán)糊精的根皮素的溶解度；Slope為相溶解度曲線的斜率。

1.3.4 紅外光譜分析

采用KBr壓片法研究分析根皮素、Me-β-CD、HP-β-CD、根皮素與Me-β-CD及HP-β-CD的混合物、根皮素與Me-β-CD及HP-β-CD包合物的紅外吸收光譜。

1.3.5 XRD分析

在Cu Kα射線，波長為1.540 56 ?，電流40 mA，電壓40 kV，掃描速率4°/min，掃描范圍25～50°的條件下，分別對根皮素、Me-β-CD、HP-β-CD、根皮素/Me-β-CD、根皮素/H P-β-C D的物理混合物及其包合物進行XRD分析。

1.3.6 SEM觀察

將樣品粉末研磨均勻后，在導電膠帶上涂布一層樣品，之后放入噴金儀中噴金使之具有導電性，最后放入SEM中觀察樣品形貌。

1.3.7 抗氧化性檢測

1.3.7.1 還原能力的測定

配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液注入含有2 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mmol/L，pH 6.6）和2.0 mL的1 g/100 mL K3Fe(CN)6的混合溶液中。在50 ℃的條件下保溫20 min。經(jīng)迅速冷卻后，再量取2.0 mL的10 g/100 mL三氯乙酸溶液加入到樣品溶液中。取上清液加入到含有2.0 mL去離子水和0.4 mL 0.1 g/100 mL FeCl3的混合液中。經(jīng)充分反應后，在700 nm波長處檢測樣品吸光度[14]。

1.3.7.2 DPPH自由基清除能力的測定

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力的實驗方法為：以乙醇為溶劑配制DPPH溶液，在避光的條件下，將2 mL的DPPH溶液分別注入到不同濃度的樣品溶液，然后在（30±1）℃的溫度中保溫60 min，檢測517 nm波長處樣品的吸光度[15]。DPPH自由基清除能力（KD）的計算公式如式（2）所示：

式中：A0表示DPPH溶液和樣品溶劑的吸光度；Ai表示DPPH溶液和樣品溶液的吸光度；Aj表示樣品溶液和乙醇溶液的吸光度。

1.3.8 抑制酪氨酸酶活性能力

1.3.8.1 根皮素及其包合物對酪氨酸酶單酚酶活力影響以L-酪氨酸為底物，向其中加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5）及樣品溶液（熊果苷為對照組）混勻保溫

10 min，再加入酪氨酸酶溶液，混勻后放入37 ℃的水浴鍋中反應，在475 nm波長處測定吸光度。根據(jù)公式（3）計算根皮素及其包合物對酪氨酸酶的抑制率。

式中：A1表示加入L-酪氨酸、酪氨酸酶時的吸光度；A2表示加入L-酪氨酸、樣品、酪氨酸酶時的吸光度；A3表示加入L-酪氨酸時的吸光度；A4表示加入L-酪氨酸、樣品時的吸光度。

1.3.8.2 根皮素及其包合物對酪氨酸酶二酚酶活力影響

以L-多巴為底物，按照下列步驟操作：空白對照：向L-多巴中加入磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5），水浴15 min后，再加酪氨酸酶溶液，37 ℃水浴加熱，在475 nm波長處測量吸光度（A3）；受試組：向不同樣品溶液中加入L-多巴和磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.5），水浴15 min后，加酪氨酸酶溶液，37 ℃水浴加熱，測量475 nm波長處的吸光度（A1）；受試對照：將受試組的樣品換成氫醌，測量吸光度（A2）。根皮素及其包合物的抑制率計算見公式（4）。

2 結果與分析

2.1 相溶解法

β-CD存在下根皮素的相溶解度曲線Fig. 1 Phase-solubility diagrams of phloretin with Me-β-CD and HP-β-CD圖1 Me-β-CD和HP-

相溶解度是一種用來計算主客體間形成包合物穩(wěn)定性強弱的重要方法。環(huán)糊精包合物的穩(wěn)定性與相溶解法計算出的包合平衡常數(shù)相對應。其中，包合平衡常數(shù)數(shù)值越大，表明生成的包合物越穩(wěn)定。由根皮素與Me-β-CD及HP-β-CD的相溶解圖可知（圖1）：根皮素在水溶液中的溶解度隨環(huán)糊精濃度的增加呈線性增長?；贖iguchi等[13]理論，表明Me-β-CD及HP-β-CD與根皮素均以物質(zhì)的量比1∶1的形式生成了包合物。計算得出根皮素與Me-β-CD及HP-β-CD的包合平衡常數(shù)分別為6 606、5 577 mol-1，根據(jù)包合平衡常數(shù)與形成包合物的鍵能關系可知[16]，根皮素與環(huán)糊精之間化學鍵結合強度大，形成的包合物穩(wěn)定性好。此外，當Me-β-CD及HP-β-CD的濃度增加到10 mmol/L時，根皮素的溶解度分別增大了47.7、42.3 倍。表明經(jīng)包合作用后，根皮素的水溶性得到了顯著地提升。

2.2 包合物的表征

2.2.1 紅外光譜分析

測定根皮素、Me-β-CD、HP-β-CD、根皮素與Me-β-CD、HP-β-CD物質(zhì)的量比為1∶1的物理混合物及其包合物波數(shù)在4 000～400 cm-1處的紅外吸收光譜，其結果如圖2所示。以Me-β-CD為例，根皮素在1 600～1 400 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)骨架振動峰，其中1 605 cm-1處為C＝O鍵伸縮振動的特征峰；Me-β-CD在3 400 cm-1處出現(xiàn)了寬且強的環(huán)糊精羥基吸收峰；根皮素與Me-β-CD物質(zhì)的量比為1∶1物理混合物的紅外光譜圖中既包含Me-β-CD在3 400 cm-1處的特征峰，也含有根皮素在1 605 cm-1處的特征峰，僅僅是峰的強度有所減弱。該結果表明兩者只是簡單的混合，并未發(fā)生包合作用。而根皮素與Me-β-CD包合物的紅外光譜圖中，1 600 cm-1處C＝O鍵伸縮振動峰藍移至1 633 cm-1，表明根皮素成功進入了Me-β-CD的空腔內(nèi)，根皮素和Me-β-CD形成了包合物。HP-β-CD與根皮素的紅外譜圖與上述結果類似，表明根皮素也可以與HP-β-CD形成包合物。

2.2.2 XRD分析

圖3 XRD圖Fig. 3 XRD patterns

XRD是表征主客體包合物常用的研究方法。根據(jù)根皮素、Me-β-CD及HP-β-CD、根皮素與環(huán)糊精的物理混合物及其包合物的XRD圖可知（圖3）：根皮素衍射圖中出現(xiàn)了許多晶型結構的特征峰，表示根皮素為晶體結構，而Me-β-CD及HP-β-CD的衍射峰僅為兩條寬峰，表明環(huán)糊精為無定型結構。根皮素與環(huán)糊精物理混合物的峰形為兩者峰形的疊加，因此可以證明根皮素和環(huán)糊精之間未發(fā)生化學反應，仍保留兩者原始的物理化學性質(zhì)[17]。而包合后根皮素，其峰形由結晶態(tài)的尖峰變成了兩條無定型態(tài)的寬峰，表明根皮素成功進入了Me-β-CD及HP-β-CD的空腔內(nèi)部，并發(fā)生了化學反應，且包合過程中未破壞環(huán)糊精的結構，由此證明了包合物的形成[18-20]。

2.2.3 SEM觀察

圖4 SEM圖Fig. 4 Scanning electron microphotographs

圖4 是根皮素、Me-β-CD、根皮素/Me-β-CD的物理混合物、根皮素/Me-β-CD包合物的SEM圖。觀察可知，根皮素的形貌為細長的條狀結構，Me-β-CD的形貌為球體。根皮素/Me-β-CD物理混合物的圖像中，既有根皮素特有的形貌結構，也含有Me-β-CD的形貌特點，由此可以證明兩者并未形成新的物質(zhì)，而根皮素/Me-β-CD包合物的形貌則變成表面光滑的塊狀，由此證明了根皮素與Me-β-CD之間發(fā)生了包合作用。

2.2.4 還原能力

圖5 抗氧化能力Fig. 5 Antioxidant activities

檢測物質(zhì)的還原能力是確定樣品抗氧化能力強弱的一種常用方法。其原理是利用抗氧化劑將鐵氰化物中的Fe3+還原成Fe2+，然后檢測溶液在700 nm波長處的吸光度，判斷物質(zhì)的還原能力。其中，吸光度越高，表明物質(zhì)的還原能力越強[21]。以環(huán)糊精作對照，在700 nm波長處并未產(chǎn)生吸光度，由此排除環(huán)糊精自身對根皮素還原能力結果的影響。根皮素及其包合物的還原能力如圖5A所示，隨著根皮素質(zhì)量濃度的增加，其吸光度也隨之增加，并且經(jīng)環(huán)糊精包合后的根皮素吸光度遠大于未經(jīng)包合的根皮素，表明了包合作用提升了物質(zhì)的還原能力。產(chǎn)生該結果的原因可能是由于包合作用提升了根皮素的水溶性，減小了其在水中的團聚，有利于根皮素充分接觸Fe3+，從而增強物質(zhì)的還原能力[22-23]。

2.2.5 清除DPPH自由基能力

抗氧化劑捕獲DPPH單電子，使其在517 nm波長處的吸光度下降。所以，測定的吸光度越低，表明物質(zhì)的抗氧化能力越強，以此判定抗氧化能力的強弱。酚醛類化合物抗氧化的能力主要取決于羥基的位置及羥基化程度[24]。同樣以環(huán)糊精作對照，在517 nm波長處并未產(chǎn)生吸光度，由此排除環(huán)糊精的影響。根皮素及其包合物的清除DPPH自由基能力如圖5B所示，隨著樣品濃度的增加，根皮素及其包合物的清除DPPH自由基能力也隨之增加，并且包合后的根皮素明顯高于未包合的，該結果證明了根皮素包合物的抗氧化性能更強。其原因可能為：抗氧化性物質(zhì)進入環(huán)糊精空腔內(nèi)，使客體分子穩(wěn)定性增加，更易與DPPH自由基反應[25]。抗氧化性物質(zhì)中的酚羥基與環(huán)糊精中的羥基形成了分子內(nèi)氫鍵，增加了羥基化程度，使之更有利于清除DPPH自由基[26-27]。

2.2.6 根皮素及其包合物對酪氨酸酶的抑制率

2.2.6.1 根皮素及其包合物對酪氨酸酶單酚酶活力影響

以L-酪氨酸為底物，根皮素、根皮素/Me-β-CD包合物及根皮素/HP-β-CD包合物為效應物，對酪氨酸酶單酚酶活力的抑制能力如表1所示。表中顯示Me-β-CD、HP-β-CD、根皮素及其包合物對酪氨酸酶的單酚酶活性均沒有抑制作用，而陽性對照組熊果苷的抑制率為43%。由此推測環(huán)糊精及根皮素不具有通過清除過氧自由基，終止自由基鏈的引發(fā)，從而抑制對酪氨酸酶單酚酶激活的能力[28]。

表1 根皮素及其包合物對酪氨酸酶單酚酶活力的抑制率Table 1 Inhibition types and inhibition constants of phloretin and its inclusion complexes on monophenolase activity

2.2.6.2 根皮素及其包合物對酪氨酸酶二酚酶活力影響

表2 根皮素及其包合物對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用Table 2 Inhibition types and inhibition constants of phloretin and its inclusion complexes on diphenolase activity

以L-多巴為底物，測定根皮素及其包合物對酪氨酸酶二酚酶活力的抑制作用，結果見表2。Me-β-CD及HP-β-CD對酪氨酸酶二酚酶活力無抑制作用，而根皮素及其包合物對酪氨酸酶二酚酶活力均有抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的增加，對二酚酶活性的抑制能力也逐漸加強，當質(zhì)量濃度達到0.16 g/100 mL時，根皮素及其包合物的抑制率分別達到100%、90.4%和90.4%。此外，根皮素/Me-β-CD及根皮素/HP-β-CD包合物對酪氨酸酶的抑制率由于受包合作用的影響，對二酚酶活性的抑制率有所減弱。

根據(jù)根皮素結構推測，其對酪氨酸酶的抑制作用主要是由于分子中存在大量的還原性羥基與酪氨酸酶分子中的Cu2+發(fā)生螯合作用有關[29]，并且其結構可能與L-多巴相似，從而與底物形成競爭關系，削弱了酪氨酸酶對底物的氧化作用。由于影響抑制活性的關鍵位點是根皮素的3 個酚羥基，推測包合作用減弱對酪氨酸酶抑制能力的原因為環(huán)糊精將根皮素部分酚羥基包裹在空腔內(nèi)部，減弱了其與酪氨酸酶分子中Cu2+的螯合作用。

3 結 論

本實驗以Me-β-CD和HP-β-CD為主體成功制備了水溶性良好的根皮素/Me-β-CD及根皮素/HP-β-CD包合物。相溶解法的結果表明根皮素與環(huán)糊精之間形成了包合比1∶1的包合物，通過包合平衡常數(shù)可知生成的包合物穩(wěn)定性高。利用XRD、SEM等表征手段證明了包合物的形成，并且發(fā)現(xiàn)包合作用有助于促進根皮素水溶性的提升。此外，通過檢測物質(zhì)的還原能力及清除DPPH自由基能力表明包合后根皮素的抗氧化能力增加，而抑制酪氨酸酶的實驗則證明了根皮素及其包合物均可以有效地抑制黑色素的生成，且抑制效果優(yōu)越。目前，抗氧化劑、酪氨酸酶抑制劑的開發(fā)已成為食品保健、防腐及保鮮等領域的研究重點，根皮素包合物優(yōu)良的水溶性、抗氧化能力及抑制酪氨酸酶活性在食品領域有著廣闊的發(fā)展前景。

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Preparation and Properties of Inclusion Complexes of β-Cyclodextrin Derivatives with Phloretin

LI Shujing, ZHOU Ziruo, ZHOU Wei, WANG Xinrui, YUAN Li
(Department of Chemistry, School of Science, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China)

The inclusion complexation behavior of phloretin with methyl-β-cyclodextrin (Me-β-CD) and (2-hydroxy) propylβ-cyclodextrin (HP-β-CD) was investigated quantitatively by the phase solubility method. Water-soluble inclusion complexes of phloretin and two β-CD derivatives were prepared by the freeze-drying method and structurally characterized by infrared spectroscopy (IR), X-ray diffraction (XRD) and scanning electron microscopy (SEM). Furthermore, the antioxidant activities of phloretin and the inclusion complexes were determined by reducing power (RP) and 1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radical scavenging methods. The tyrosinase inhibitory activities of phloretin and the inclusion complexes were also investigated. The results proved that phloretin formed 1:1 stoichiometric inclusion complex with Me-β-CD and HP-β-CD, respectively. The water solubility and antioxidant activity of phloretin were greatly enhanced in the presence of CDs, providing a good way to develop water-based health food formulations. Additionally, phloretin and its inclusion complexes were observed to eff i ciently inhibit tyrosinase activity. The inclusion complexes could be developed as a natural, eff i cient and environmental friendly food preservative.

phloretin; β-cyclodextrin derivatives; inclusion complex; solubility; tyrosinase inhibitory activity; antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201707003

TS201.1

A

李姝靜, 周自若, 周威, 等. 根皮素與兩種β-環(huán)糊精衍生物的包合作用及性質(zhì)[J]. 食品科學, 2017, 38(7): 11-16.

10.7506/spkx1002-6630-201707003. http://www.spkx.net.cn

LI Shujing, ZHOU Ziruo, ZHOU Wei, et al. Preparation and properties of inclusion complexes of β-cyclodextrin derivatives with phloretin[J]. Food Science, 2017, 38(7): 11-16. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707003. http://www.spkx.net.cn

2016-04-26

國家自然科學基金青年科學基金項目（31501445）

李姝靜（1980—），女，副教授，博士，研究方向為新型主客體識別功能體系的設計與制備。E-mail：lishujing@mail.ipc.ac.cn