李靜媛+張瑩+姜楠楠+趙方圓

摘 要：該研究測定了9種天然未加工蜂蜜及加工后（模擬蜂蜜的工業(yè)加熱過程）蜂蜜中的淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶4種酶的酶活性。結(jié)果表明，不同蜜源的天然蜂蜜中，4種酶的含量差異明顯；加熱過程會導(dǎo)致蜂蜜中4種酶含量顯著降低。對于蜂蜜中各種活性酶的測定可為改良蜂蜜的加工工藝提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：蜂蜜；加熱；酶活性

中圖分類號 TS207.3 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）07-0020-03

Abstract：The enzymatic activity of amylase，sucrose invertase，glucose oxidase and catalase in nine kinds of natural

honey and processed honey（simulation of industrial heating process of honey）were measured in this study.Results showed that there were obvious differences of enzyme activity among honey of various nectar；in addition，heating process could lead to a significant reduce of four kinds of enzymes in honey. Therefore，the determination of variety of enzymes in honey could provide some reference for improvement of processing technology of honey.

Key words：Honey；Heating；Enzymatic activity

蜂蜜是蜜蜂采集植物的蜜露、花蜜以及分泌物，與自身分泌物結(jié)合后并充分釀造，在巢脾中形成的天然的甜而粘稠的膠狀物質(zhì)[1]。蜂蜜的主要成分是葡萄糖和果糖，此外還含有蛋白質(zhì)、酶類、脂質(zhì)、有機酸、維生素、礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分[2]，因其營養(yǎng)豐富、綠色安全，是天然營養(yǎng)保健品。而蜂蜜所具有的助消化、排毒養(yǎng)顏、抑菌等功效，與蜂蜜中含有的種類豐富的生物活性酶有關(guān)，如淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化酶、磷酸酶等[3]。這些酶的熱穩(wěn)定性不強，若對蜂蜜進行加工處理或長期貯存，酶的活性會逐漸降低[4]。因此，蜂蜜中的各種酶活性是反應(yīng)蜂蜜質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。為了延長保質(zhì)期、改善蜂蜜的外觀和口感，我國的市售蜂蜜一般要經(jīng)過預(yù)熱溶蜜、高溫殺菌、加熱濃縮等加工步驟[5]，這些加工步驟由于涉及加熱處理，均會導(dǎo)致蜂蜜中對熱敏感的酶類物質(zhì)的損失。本研究對未加熱處理和加熱處理的9種不同蜜源天然蜂蜜中淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶的酶活性進行了測定及對比分析，以期為今后改進蜂蜜的加工工藝提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品 本實驗所采用的9種蜜源的天然蜂蜜（分別為槐花蜜、棗花蜜、龍眼蜜、油菜蜜、枇杷蜜、荔枝蜜、荊條蜜、百花蜜、野藿香蜜）購自蜂農(nóng)處，均未經(jīng)過任何加熱處理。

1.1.2 試劑及配制 淀粉、碘化鉀、蔗糖、葡萄糖、靛藍胭脂紅、30%過氧化氫、3，5-二硝基水楊酸等其他試劑均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。（1）蜂蜜蔗糖混合液的配制：吸取10.0mL蜂蜜溶液（100g/L）、10.0mL蔗糖溶液（100g/L），取此混合液2.5mL定容到100mL容量瓶中。（2）3，5-二硝基水楊酸溶液的配制：稱取3，5-二硝基水楊酸6.5g于少量水中溶解，轉(zhuǎn)移到1 000mL的容量瓶中，再加入325mL 2mol/L的氫氧化鈉溶液，最后加入丙三醇45g，搖動以充分混合，冷卻并定容。（3）0.1%的H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取30%過氧化氫0.5mL于50mL棕色容量瓶中，用磷酸緩沖液（pH6.8-7.0，50mmol/L）定容至刻度，從中準(zhǔn)確量取10.0mL于三角錐瓶中，再準(zhǔn)確稱取磷酸緩沖液20.0mL加入混勻既得。

1.1.3 儀器 ELX808IU型酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；WFZUV-2000型紫外可見光分光光度計（上海優(yōu)尼科儀器有限公司）；BT-323分析天平（德國賽多利斯）；SHA-B數(shù)顯水浴恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司）；數(shù)顯磁力攪拌器（廣州儀器實驗室技術(shù)有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 蜂蜜加熱方法 本實驗?zāi)M蜂蜜在工業(yè)加工中的主要加熱過程，對9種天然蜂蜜進行加熱處理，進行原蜜的預(yù)熱（未結(jié)晶蜜在45℃下水浴1h，結(jié)晶蜜在60℃下水浴4～8h）、加熱滅菌（63℃下水浴30min）和解晶（83℃下水浴5min后迅速降溫到50℃）幾個步驟。

1.2.2 淀粉酶活性測定 按照國標(biāo)GB/T18932.16-2003[6]中分光光度法測定并計算淀粉酶酶活。

1.2.3 蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性測定 采用3，5-二硝基水楊酸法，將蜂蜜蔗糖混合液于45℃水浴鍋中水浴1h進行轉(zhuǎn)化，分別取轉(zhuǎn)化前和轉(zhuǎn)化后的蜂蜜蔗糖混合溶液各1mL移入25mL容量瓶中，加入3，5-二硝基水楊酸溶液2mL，沸水浴3min顯色，冷卻后定容。用分光光度儀在520nm波長處測定。將數(shù)據(jù)代入葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線可獲得葡萄糖含量，并按以下公式進行計算：蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性（mg/g）=10×2（M-N）。

式中：M—轉(zhuǎn)化后的單糖含量（mg/g）；N—轉(zhuǎn)化前的單糖含量（mg/g）。

1.2.4 葡萄糖氧化酶活性測定 采用靛紅褪色光度法來測定蜂蜜中葡萄糖氧化酶的活性[7]。

1.2.5 過氧化氫酶的測定方法 取蜂蜜樣品1g，加入10mL新鮮配制的磷酸緩沖溶液溶解，轉(zhuǎn)入25mL容量瓶中定容，8 000g、4℃離心15min，取上清液。將樣品溶液與H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液均放入40℃水浴鍋水浴10min，準(zhǔn)確吸取樣品溶液0.1mL、H2O2標(biāo)準(zhǔn)溶液2.9mL混合均勻，轉(zhuǎn)移至于石英皿中，在240nm波長下測定吸光值，每5s計數(shù)一次，測定120s。酶活力單位（U）：在1min內(nèi)，過氧化氫在240nm波長下的吸光度每減少0.1的酶量為1U。過氧化氫酶的活性（U/g）按照以下公式計算：

式中：X—過氧化氫酶酶值；△A—所選取的1min的吸光度差值；V1—樣品溶液的總體積（mL）；t—1min；V2—樣品測定時所用的體積（mL）；m—樣品的質(zhì)量（g）[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 加熱對蜂蜜中淀粉酶的影響 利用分光光度法分別測定了9種蜜源的未加熱天然蜂蜜及加熱處理后蜂蜜中淀粉酶的酶活，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以得出：在9種不同蜜源的未經(jīng)加熱處理的天然蜂蜜中，淀粉酶的含量差異較明顯。其中荊條蜜中淀粉酶的酶活力最高，達到了18.80mL/g·h；棗花蜜、龍眼蜜、油菜蜜、荔枝蜜中的淀粉酶活力居中，在7.90～11.50mL/g·h；而百花蜜和野藿香蜜的淀粉酶活力相對較低，僅有2.28mL/g·h和2.79mL/g·h。此外，由圖1還可以發(fā)現(xiàn)同蜜源的蜂蜜在加熱前后其淀粉酶酶活力均有一定程度的降低：油菜蜜、荔枝蜜中淀粉酶的損失較大，均損失了82%；其次是槐花蜜、龍眼蜜、枇杷蜜和荊條蜜，其淀粉酶含量下降了67%～80%；棗花蜜和野藿香蜜中淀粉酶損失較少，損失40%～57%；百花蜜中淀粉酶含量受加熱影響最小，僅下降了37%。

2.2 加熱對蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的影響 利用3，5-二硝基水楊酸法測定蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的酶活力，樣品為天然未加熱及加熱后的9種蜜源的蜂蜜，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以得出：未加熱的9種蜜源的天然蜂蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶含量有較大差異。其中野藿香蜜、油菜蜜的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的酶活最高，達到1 650.51mg/g·h和1 238.17mg/g·h；其次是荊條蜜，為871.31mg/g·h；槐花蜜、龍眼蜜、枇杷蜜、荔枝蜜和百花蜜的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的酶活力，介于284.32～417.31mg/g·h；棗花蜜中的蔗糖轉(zhuǎn)化酶活力最低，僅有100.89mg/g·h。此外，還發(fā)現(xiàn)同蜜源的蜂蜜在加熱前后其蔗糖轉(zhuǎn)化酶酶活力均有一定程度的降低：荔枝蜜的蔗糖轉(zhuǎn)化酶的損失較大，減少了88%；其次為槐花蜜、龍眼蜜、枇杷蜜，損失率在50%～75%，而油菜蜜、百花蜜和野藿香蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的損失較小，分別降低了37%、39%和47%。加熱對棗花蜜和荊條蜜中蔗糖轉(zhuǎn)化酶的影響最小，酶活損失率僅為31%。

2.3 加熱對蜂蜜中葡萄糖氧化酶的影響 采用靛紅褪色光度法對9種不同蜜源的天然蜂蜜及加熱后樣品進行葡萄糖氧化酶含量的測定，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出：9種蜜源的天然未加熱蜂蜜的葡萄糖氧化酶酶活各不相同：其中枇杷蜜中葡萄糖氧化酶的酶活力最高，達到15.03mg/g；槐花蜜、棗花蜜、龍眼蜜和油菜蜜次之，在9.24～12.46mg/g；荔枝蜜、荊條蜜、百花蜜和野藿香蜜中葡萄糖氧化酶活較低，其酶值在4.72～7.6mg/g。此外，同蜜源的蜂蜜在加熱前后其葡萄糖氧化酶酶活力均有一定程度的降低：枇杷蜜中葡萄糖氧化酶的損失較多，損失率為88%；槐花蜜、棗花蜜、龍眼蜜、油菜蜜、荔枝蜜和荊條蜜中葡萄糖氧化酶的損失居中，在68%～75%；百花蜜和野藿香蜜的葡萄糖氧化酶的損失較少，僅減少34%和44%。

2.4 加熱對蜂蜜中過氧化氫酶的影響 利用紫外分光光度法對9種不同蜜源的天然未加工及加熱后蜂蜜樣品中的過氧化氫酶活力進行測定，結(jié)果如圖4所示。從圖4可以得出：9種不同蜜源的天然蜂蜜中過氧化氫酶的含量不盡相同。其中荊條蜜和百花蜜中過氧化氫酶的酶活力較高，分別為100.03U/g和108.33U/g；槐花蜜、棗花蜜、龍眼蜜、油菜蜜、荔枝蜜和野藿香蜜次之，酶活在66.55～83.33U/g；枇杷蜜中的過氧化氫酶活力最低，僅50.10U/g。此外，從圖4還發(fā)現(xiàn)同蜜源的蜂蜜在加熱前后其過氧化氫酶活力均有一定程度的降低?；被?、龍眼蜜、油菜蜜、荔枝蜜、荊條蜜和百花蜜中過氧化氫酶的損失較大，損失率均在50%左右；其次為枇杷蜜和野藿香蜜，其過氧化氫酶含量降低33%～35%；棗花蜜中過氧化氫酶含量下降最少，加熱后仍然能保留原來的80%。

3 結(jié)論與討論

本實驗以9種不同蜜源的天然未加工蜂蜜和模擬工業(yè)加工時的主要加熱步驟加工后的蜂蜜為樣品，分別測定蜂蜜中的4種主要酶：淀粉酶、蔗糖轉(zhuǎn)化酶、葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶，并由此得出如下結(jié)論：（1）9種蜜源的天然蜂蜜的4種酶的含量差別明顯：淀粉酶活性最高的蜂蜜是荊條蜜，為18.8mL/g·h；蔗糖轉(zhuǎn)化酶活性最高的蜂蜜是野藿香蜜，為1 650.51mg/g·h。葡萄糖氧化酶活力和過氧化氫酶活力最高的蜂蜜分別是枇杷蜜（15.03mg/g）和百花蜜（108.33U/g）。（2）在模擬蜂蜜加工過程對蜂蜜進行加熱后，蜂蜜中的4種酶含量有顯著降低：不同蜜源蜂蜜的淀粉酶含量下降范圍為37%～82%，其中下降最多的是油菜蜜和荔枝蜜；蔗糖轉(zhuǎn)化酶含量下降的范圍為31%～88%，蔗糖轉(zhuǎn)化酶損失最多的是荔枝蜜；葡萄糖氧化酶在加熱后其含量下降范圍是34%～88%，其中葡萄糖氧化酶含量變化最大的是枇杷蜜；過氧化氫酶活力的下降范圍是20%～50%，槐花蜜、龍眼蜜、油菜蜜、荔枝蜜、荊條蜜和百花蜜的過氧化氫酶含量在加熱后下降較多且均降低了50%左右。

蜂蜜中的各種酶具有多種活性功能，而為了延長蜂蜜的保質(zhì)期，對蜂蜜進行加工必不可少，但加工過程中的高溫滅菌、濃縮等步驟會降低蜂蜜中各種酶的活性，進而降低了蜂蜜的營養(yǎng)價值。若要將這些影響蜂蜜品質(zhì)的因素降至最低，必須探索并進一步改進蜂蜜的加工工藝。綜上，本研究通過對天然蜂蜜及加熱處理后蜂蜜中4種酶酶活力的測定，為探索、開發(fā)新的蜂蜜加工工藝提供一定依據(jù)，并為尋求適合我國現(xiàn)狀的蜂蜜產(chǎn)業(yè)化途徑、最終提高蜂蜜的品質(zhì)和附加值提供參考。

參考文獻

[1]李琦智，朱敏，任德鑫，等.蜂蜜的功效與應(yīng)用[J].四川中醫(yī)，2004，22（1）：30-31.

[2]Blasa，M，Candiracci，M，et al.Raw Millefiorihoney is packed full of antioxidants[J].Food Chemistry，2006，97：217-222.

[3]陳盛祿.中國蜜蜂學(xué)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[4]易松強，鄭火青，張翠平，等.蜂蜜中β-葡萄糖苷酶活性測定及其來源分析[J].食品科學(xué)，2010，31（19）：241-244.

[5]鄧華.蜂蜜加工工藝的探討[J].蜂蜜雜志，2001，08：20-21.

[6]GB/T18932.16-2003 蜂蜜中淀粉酶值的測定方法分光光度法.

[7]莊會榮，胡順香，陳鴻琪.靛紅褪色光度法測定過氧化氫[J].理化檢驗（化學(xué)分冊），2000，36（1）：36-38.

[8]王春臺，徐同，劉學(xué)群.紫外分光光度法測定過氧化氫酶的活性[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1987，6（1）：77-81.

（責(zé)編：張宏民）