王 敏，黃 翔，石 翾，劉小鳳，曾檢華，劉小紅，陳瑤生，何祖勇

（1．中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號(hào)食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

應(yīng)用CRISPR/Cas9編輯廣東小耳花豬MSTN基因

王 敏1，黃 翔1，石 翾1，劉小鳳1，曾檢華2，劉小紅1，陳瑤生1，何祖勇1

（1．中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006；2．廣東壹號(hào)食品股份有限公司，廣東 廣州 510620）

MSTN基因是肌肉生長(zhǎng)抑制基因，破壞MSTN基因的表達(dá)成為提高畜禽肌肉產(chǎn)量的有效途徑。通過(guò)應(yīng)用CRISRP/Cas9編輯技術(shù)對(duì)廣東小耳花豬MSTN基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行編輯，破壞MSTN基因的讀碼框來(lái)抑制其表達(dá)，從而提高廣東小耳花豬的肌肉產(chǎn)量。共設(shè)計(jì)了6條靶向MSTN基因3個(gè)不同外顯子的gRNA，經(jīng)過(guò)T7E1酶切檢測(cè)和TA克隆分析，發(fā)現(xiàn)其中3條gRNA能夠發(fā)生有效切割，其中切割效率最高的達(dá)28.3%，最低為17.0%。gRNA1-1和gRNA3-3突變的廣東小耳花豬PEF細(xì)胞系，突變效率均在50%以上，其中三號(hào)外顯子上突變位點(diǎn)的突變率達(dá)到61.5%。試驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)進(jìn)行體細(xì)胞核移植，生產(chǎn)MSTN基因編輯的廣東小耳花豬奠定了基礎(chǔ)。

MSTN；CIRSPR/Cas9；廣東小耳花豬；基因編輯

MSTN （Myostatin）基因是肌肉生成抑制基因，在機(jī)體中主要發(fā)揮肌肉生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)節(jié)作用。因此，破壞MSTN基因的表達(dá)成為提高畜禽肌肉產(chǎn)量的有效途徑。MSTN基因是Mcpherron在研究轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）時(shí)發(fā)現(xiàn)的，并在隨后試驗(yàn)中指出，MSTN在脊椎動(dòng)物的骨骼肌中特異表達(dá)，MSTN基因功能的缺失能夠有效增加小鼠的肌肉產(chǎn)量，靶向破壞MSTN基因的小鼠體重是野生小鼠體重的兩倍［1］。MSTN作為肌肉生長(zhǎng)調(diào)節(jié)抑制因子，自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)就受到廣泛重視，研究也越發(fā)深入。Hanset等［2］發(fā)現(xiàn)表現(xiàn)雙肌性狀的比利時(shí)藍(lán)牛和皮埃蒙特牛比普通牛的肌纖維數(shù)量更多，而在胎牛中的肌纖維數(shù)量是普通牛的兩倍［3］。進(jìn)一步研究表明，比利時(shí)藍(lán)牛中表現(xiàn)雙肌性狀是由其MSTN基因編碼區(qū)一段11 bp的堿基缺失引起的，而皮埃蒙特牛則是由相同MSTN基因區(qū)域單堿基G＞A突變所致［4］。2000年，Thomas等［5］研究發(fā)現(xiàn)，MSTN導(dǎo)致P21（一種細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子）表達(dá)上調(diào)，使得 cdk2蛋白活性下降，導(dǎo)致低磷酸化Rb蛋白累積，最終成肌細(xì)胞在G1期阻滯。2001年，Taylor等［6］檢測(cè)了重組MSTN在小鼠成肌細(xì)胞C2C12中的作用，結(jié)果顯示重組MSTN蛋白能夠抑制細(xì)胞增殖，抑制DNA和蛋白合成，推測(cè)MSTN能夠通過(guò)抑制肌肉的生長(zhǎng)和再生從而影響肌肉重量。2002年，Rios等［7］為探究MSTN在成肌分化過(guò)程中扮演的角色，用小鼠MSTN cDNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MSTN cDNA的過(guò)表達(dá)會(huì)下調(diào)肌肉調(diào)控因子MyoD和myogenin mRNA的表達(dá)水平，起到可逆的抑制成肌過(guò)程的作用。2003年，Joulia等［8］同樣闡明了MSTN能夠抑制細(xì)胞的增殖和分化，過(guò)表達(dá)非內(nèi)生性MSTN能夠降低MyoD蛋白的表達(dá)水平，并且導(dǎo)致磷酸化模式的改變。由此可見(jiàn)，機(jī)體內(nèi)MSTN基因能夠通過(guò)調(diào)控成肌相關(guān)因子的表達(dá)來(lái)抑制成肌分化，從而減少機(jī)體的肌肉量。

CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系統(tǒng)是細(xì)菌在進(jìn)化過(guò)程中逐漸演化形成的一種針對(duì)外源DNA的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，存在于約40%的細(xì)菌和幾乎所有的古細(xì)菌中［9］。該系統(tǒng)能夠?qū)⑷肭值耐庠碊NA剪切成喪失生物活性的小片段，并整合到自身序列中，形成規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列。CRISPR/Cas9系統(tǒng)由DNA小片段轉(zhuǎn)錄而成crRNA和帶有Cas9蛋白結(jié)合位點(diǎn)的tracrRNA，以及具有分子剪刀作用的Cas9蛋白組成。作用時(shí)crRNA和tracrRNA相結(jié)合，引導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別靶標(biāo)DNA序列的PAM（NGG）位點(diǎn)進(jìn)行切割［10］。目前，應(yīng)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯的技術(shù)已發(fā)展成熟。2013年，Mali等［11］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯人類細(xì)胞AAVS1基因，在293T細(xì)胞中編輯效率達(dá)到10%～25%，在K562細(xì)胞中編輯效率達(dá)到8%～13%，在誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞中編輯效率為2%～4%。同年，F(xiàn)riedland等［12］利用CRISPR/Cas9編輯了新桿狀線蟲(chóng)生殖細(xì)胞系，實(shí)現(xiàn)了靶標(biāo)位點(diǎn)可遺傳的編輯。2014年，Platt等［13］成功獲得CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲入小鼠，并構(gòu)建了能同時(shí)研究KRAS、p53和LKB1（肺癌細(xì)胞中3種最重要的突變基因）的動(dòng)力學(xué)模型，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)在構(gòu)建疾病模型的研究和應(yīng)用中又前進(jìn)了一步。同樣，CRISPR/ Cas9系統(tǒng)在提高豬的生長(zhǎng)性和抗病性過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。2015年，Wang等［14］在PEF細(xì)胞中編輯MSTN基因，通過(guò)體細(xì)胞核移植，得到了表現(xiàn)明顯“雙肌”性狀的小豬。2016年，Whitworth等［15］利用CRISPR/Cas9突變了豬繁殖與呼吸綜合征病毒PRRSV進(jìn)入細(xì)胞的受體CD163基因，從而阻滯了PRRSV的作用，得到了抗藍(lán)耳病的豬。上述試驗(yàn)思路，結(jié)合MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)的關(guān)鍵作用，啟發(fā)了我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯豬功能基因來(lái)改善中國(guó)地方豬種的肌肉生長(zhǎng)性能普遍較低的弱點(diǎn)，以期獲得高生長(zhǎng)性能和高肌肉產(chǎn)量的廣東小耳花豬新品種。

廣東小耳花豬屬于我國(guó)華南型地方豬種，具有肉質(zhì)鮮美、肉色鮮紅、系水力強(qiáng)、肌內(nèi)脂肪含量高和肌纖維直徑?。?6］等優(yōu)點(diǎn)，但是生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)肉量低。目前，國(guó)內(nèi)育種工作者利用傳統(tǒng)的選育技術(shù)以及現(xiàn)代分子育種技術(shù)對(duì)其遺傳改良和利用的效果不太理想，還處于較為簡(jiǎn)單的雜交利用階段。基于MSTN基因的研究進(jìn)展以及CRISPR/Cas9系統(tǒng)技術(shù)日趨成熟，本研究擬通過(guò)CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯廣東小耳花豬MSTN基因，解除其對(duì)肌肉生長(zhǎng)的抑制作用，從而進(jìn)一步嘗試培育產(chǎn)生具備高產(chǎn)肉量、肉質(zhì)優(yōu)良的廣東小耳花豬新品種。試驗(yàn)共設(shè)計(jì)gRNA 6條，將它們分別克隆進(jìn)帶有U6啟動(dòng)子、CRISPR系統(tǒng)發(fā)揮作用所必需的骨架RNA（crRNA和tracrRNA）以及綠色熒光標(biāo)記蛋白的PX458載體中，得到6種靶向廣東小耳花豬MSTN基因不同位置的CRISPR/Cas9敲除載體。通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后可根據(jù)綠色熒光的表達(dá)情況估計(jì)CRISPR/Cas9敲除載體轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的比例，若敲除載體進(jìn)入細(xì)胞，則U6啟動(dòng)子發(fā)揮作用，敲除載體各部分得以表達(dá)，綠色熒光蛋白的標(biāo)記作用顯現(xiàn)，此時(shí)細(xì)胞發(fā)綠光；若敲除載體沒(méi)有進(jìn)入細(xì)胞，則載體不能得以表達(dá)，細(xì)胞不發(fā)光。轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行流式分選。流式細(xì)胞術(shù)也是根據(jù)綠色熒光將敲除質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分開(kāi)，并且精確統(tǒng)計(jì)各部分的細(xì)胞數(shù)量，因此，我們可以準(zhǔn)確計(jì)算出轉(zhuǎn)染效率，并對(duì)成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群進(jìn)行T7E1酶切分析以及TA克隆系列實(shí)驗(yàn)，從而得到成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群中有多少被CRISPR/Cas9系統(tǒng)切割的細(xì)胞比例，了解切割后機(jī)體通過(guò)同源重組（Homology-directed repair，HDR）和非同源末端連接（Non-homologous ending-joining，NHEJ）方式修復(fù)所產(chǎn)生的插入或缺失類型。本試驗(yàn)篩選出了3條能夠發(fā)生有效切割的gRNA，可用于后續(xù)體細(xì)胞核移植實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

廣東小耳花豬胎兒來(lái)源于廣東壹號(hào)食品股份有限公司核心育種場(chǎng)，成纖維細(xì)胞由實(shí)驗(yàn)室分離建立，pX458質(zhì)粒購(gòu)自Addgene（北京中原公司代理，貨號(hào)為#48138）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 gRNA設(shè)計(jì)與oligo合成 試驗(yàn)所用的骨架載體為pX458，利用張鋒團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的CRISPR設(shè)計(jì)網(wǎng)站（crispr.mit.edu）［10］設(shè)計(jì)gRNA，分別選取MSTN基因的3個(gè)外顯子區(qū)域序列輸入，依據(jù)間隔相鄰基序（proto-spacer adjacent motif，PAM），共篩選6條gRNA，其中一號(hào)外顯子3條、二號(hào)外顯子2條、三號(hào)外顯子1條。具體序列見(jiàn)圖1。

圖1 gRNA序列

由于設(shè)計(jì)好的gRNA序列要插入到骨架載體pX458的相應(yīng)位置，因此gRNA序列兩側(cè)需要添加BbsⅠ酶酶切骨架載體pX458后的末端堿基互補(bǔ)序列，之后送至生工生物工程有限公司合成。具體序列見(jiàn)表1。

表1 oligo序列

1.2.2 CRISPR敲除載體構(gòu)建 合成的oligo加水稀釋到100μmol/L，取正義鏈、反義鏈各1 μL，另添加10×T4 連接酶緩沖液、T4 PNK，補(bǔ)充雙蒸水到10 μL，進(jìn)行退火磷酸化反應(yīng)，反應(yīng)條件為：37℃ 30 min，95℃ 5 min，緩慢降溫至25℃（5℃/min）。得到雙鏈片段，再用BbsⅠ酶酶切pX458質(zhì)粒，得到線性化載體；之后用T4連接酶將雙鏈目的片段與線性化載體Px458質(zhì)粒連接，反應(yīng)條件為：37℃ 5 min，21℃ 5 min，共6個(gè)循環(huán)。得到含有能夠結(jié)合廣東小耳花豬基因組中靶標(biāo)位點(diǎn)片段的CRISPR/Cas9載體；將載體轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂板，37℃恒溫倒置培養(yǎng)14 h；挑取生長(zhǎng)良好的單克隆送至生工生物工程有限公司測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，選取載體構(gòu)建成功的單克隆擴(kuò)大搖菌，提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 廣東小耳花豬PEF原代細(xì)胞獲取與培養(yǎng) 廣東小耳花豬PEF原代細(xì)胞從35日齡胚胎組織中分離獲得。首先，將羊膜包裹的胎兒分別用碘酒、PBS浸泡清洗；之后用消毒的鑷子撕破羊膜流出羊水，將胎兒暴露出來(lái)放在加有少量PBS的培養(yǎng)皿中；去除胎兒的頭、尾、四肢以及內(nèi)臟，剩余背部組織塊；用剪刀將組織塊剪碎，后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基（含20%血清）混勻，置于CO2培養(yǎng)箱。3 d后可見(jiàn)PEF細(xì)胞從組織塊中滲出。之后觀察細(xì)胞，適時(shí)換液傳代。

1.2.4 PEF細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選取生長(zhǎng)良好、密度在80%左右的細(xì)胞進(jìn)行電轉(zhuǎn)。首先消化細(xì)胞，PEF細(xì)胞用PBS清洗兩遍，加入適量胰酶，置于CO2培養(yǎng)箱1 min，顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈圓形且漂浮時(shí)即可加入含20%血清的培養(yǎng)基終止消化。之后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，1 600 r/min離心 5 min，棄上清，加入適量PBS重懸細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。原則上電轉(zhuǎn)100 μL體系每個(gè)樣需要的細(xì)胞數(shù)量為1×106～5×106，需要載體質(zhì)粒5～10 μg。細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)樣品數(shù)量計(jì)算需要的重懸液體積，在細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞重懸液R，再分裝至1.5 mL離心管中；隨后在每份細(xì)胞中加入等質(zhì)量的含有不同gRNA的CRISPR/ Cas9載體質(zhì)粒，靜置3 min；另外，在電轉(zhuǎn)杯中加入3～5 mL電轉(zhuǎn)緩沖液E2。最后，使用電轉(zhuǎn)儀，按照1 650 V、10 ms、3 次脈沖的程序電轉(zhuǎn)細(xì)胞，電轉(zhuǎn)完的細(xì)胞加入預(yù)先準(zhǔn)備好的六孔板中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后換液，用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況；48 h后過(guò)流式細(xì)胞儀，根據(jù)CRISPR/Cas9載體上攜帶的綠色熒光標(biāo)記，篩選中靶細(xì)胞。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分選 電轉(zhuǎn)培養(yǎng)的細(xì)胞用PBS清洗2遍，胰酶消化，經(jīng)濾網(wǎng)過(guò)濾到流式管中。上機(jī)，根據(jù)CRISPR/Cas9載體攜帶的綠色熒光蛋白標(biāo)記篩選中靶細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.6 T7E1試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)分選的細(xì)胞培養(yǎng)至足夠數(shù)量，提取細(xì)胞基因組（QIAGEN試劑盒），用T7E1上下游引物（具體序列見(jiàn)表2）進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出CRISPR/Cas9載體切割位點(diǎn)上下游共500 bp左右的片段，將目的片段切膠回收（OMEGA試劑盒），之后進(jìn)行退火，400 ng膠回收產(chǎn)物，另添加2 μL buffer2、補(bǔ)充雙蒸水至20 μL，反應(yīng)條件為：95℃ 10 min；95～85℃（-2.0℃/min）；85℃ 1 min；85～75℃（-0.3℃/min）；75℃ 1 min；75～65℃（-0.3℃/min）；65℃ 1 min；65～55℃（-0.3℃/min）；55℃ 1 min；55～45℃（-0.3℃/min）；45℃ 1 min；45～35℃（-0.3℃/min）；35℃ 1 min；35～25℃（-0.3℃/min）；25℃ 1 min；25～4℃（-0.3℃/min）。在退火完成后的20 μL體系中加入0.5 μL T7E1酶，按照37℃ 40 min的反應(yīng)條件進(jìn)行酶切。最后恒壓跑膠（120 V，90 min），在EB中浸泡10 min顯色后，用曝光儀曝光條帶。通過(guò)軟件IMAGE J對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，用以下公式：切割率=1-（1-切除片段所占百分比）0.5計(jì)算切割效率。

表2 MSTN敲除位點(diǎn)擴(kuò)增引物

1.2.7 測(cè)序分析 將上一步切膠回收的產(chǎn)物連接到PMD18載體中，反應(yīng)體系為：膠回收產(chǎn)物1μL、SolutionⅠ 5 μL、PMD18載體1 μL，補(bǔ)充雙蒸水至10 μL。反應(yīng)條件為：16℃水浴30 min。隨即進(jìn)行轉(zhuǎn)化，30 μL感受態(tài)DH5α與5 μL連接產(chǎn)物混合，依次進(jìn)行如下步驟：冰上放置25 min，42℃ 45 s，冰上放置2 min，加入1 mL無(wú)抗液體LB，37℃ 220 r/min搖菌1 h；8 000 r/min離心2 min，棄上清800 μL，其余混勻，涂板。12～16 h后挑取單克隆送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與野生型廣東小耳花豬MSTN基因組進(jìn)行比對(duì)，明確CRISPR/Cas9載體在MSTN基因中的突變位置和突變類型。

2 結(jié)果與分析

2.1 CRISPR敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染廣東小耳花豬PEF細(xì)胞

電轉(zhuǎn)PEF細(xì)胞后24 h，利用熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況，可見(jiàn)綠色熒光表達(dá)率較高（圖2A）；48 h通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分選細(xì)胞，根據(jù)表達(dá)的綠色熒光可將CRISPR/Cas9切割質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞分選出來(lái)，分析可見(jiàn)熒光率，即轉(zhuǎn)染成功的效率均在30%以上（圖2B）。

圖2 CRISPR敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染廣東小耳花豬PEF細(xì)胞

2.2 T7E1酶切鑒定

從圖3可以看出，試驗(yàn)設(shè)計(jì)的6條gRNA 中5條發(fā)生了切割，其中3條發(fā)生了有效切割。由于gRNA2-1和gRNA2-2與陰性對(duì)照相比有部分條帶重疊，且后續(xù)測(cè)序結(jié)果顯示在發(fā)生的所有突變中有一部分是本身就存在于基因組中的突變，因此gRNA2-1和gRNA2-2的切割效率不能準(zhǔn)確計(jì)算，從而認(rèn)為它們發(fā)生無(wú)效切割。綜合3次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，切割效率如下：gRNA1-1為26.0%，gRNA1-2為17.0%，gRNA3-3為28.3%。

圖3 T7E1酶切鑒定結(jié)果

2.3 TA克隆測(cè)序分析

后續(xù)選取切割效率較高的gRNA1-1和gRNA3-3做TA克隆，并送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果（圖4）表明，gRNA1-1發(fā)生突變的類型有4種，全部為切割位點(diǎn)附近堿基的缺失，差別在于缺失的堿基數(shù)目差異；gRNA3-3發(fā)生突變的類型有1種，即切割位點(diǎn)單堿基的缺失。經(jīng)計(jì)算，兩條gRNA的突變效率分別如下：gRNA1-1為50%，gRNA3-3為61.5%。

圖4 TA克隆測(cè)序結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)旨在獲得廣東小耳花豬MSTN基因失活的細(xì)胞系，以期解除MSTN對(duì)中國(guó)地方豬種廣東小耳花豬肌肉生長(zhǎng)的抑制，使其在保證優(yōu)良肉質(zhì)性狀和口感的前提下，能夠適當(dāng)增加肌肉產(chǎn)量。CRISPR/Cas9技術(shù)的出現(xiàn)與日益成熟的應(yīng)用，為本試驗(yàn)的開(kāi)展提供了較好的技術(shù)保障。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了6條靶向廣東小耳花豬MSTN基因的gRNA，最終篩選出2條突變率較高的gRNA，后續(xù)將進(jìn)一步進(jìn)行體細(xì)胞核移植，為生產(chǎn)MSTN基因編輯豬奠定了基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)最終獲得了gRNA1-1和gRNA3-3突變的廣東小耳花豬PEF細(xì)胞系，突變效率均在50%以上，其中三號(hào)外顯子上突變位點(diǎn)的突變率達(dá)到61.5%。張冬杰等［17］用CRISPR/Cas9定點(diǎn)突變豬MSTN基因獲得38%的突變率；Han等［18］利用CRISPR/Cas9敲除綿羊MSTN基因，所設(shè)計(jì)的3條gRNA得到的平均突變率為19.3%；胡曼等［19］驗(yàn)證了CRISPR/Cas9在雞MSTN基因上的突變效率，編碼了一號(hào)外顯子和二號(hào)外顯子上的兩個(gè)靶點(diǎn)，突變率分別為64.3%和23.3%。與已有相關(guān)數(shù)據(jù)相比，本試驗(yàn)結(jié)果比較樂(lè)觀。較高的突變率表示在一群細(xì)胞中，CRISPR/Cas9系統(tǒng)編輯過(guò)的細(xì)胞數(shù)量較多，細(xì)胞群移植到豬體內(nèi)得到基因編輯豬的可能性較大。我們?cè)谥暗脑囼?yàn)中證明了轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的質(zhì)粒會(huì)在轉(zhuǎn)染21 d后就檢測(cè)不到，即該載體不會(huì)整合進(jìn)細(xì)胞基因組，降低了生物安全問(wèn)題［20］。本試驗(yàn)證明了CRISPR/Cas9技術(shù)在中國(guó)地方豬種基因編輯改造上的可能性，目前該技術(shù)也已成為畜禽育種的新方法之一，試驗(yàn)結(jié)果中取得的較高的突變效率也為進(jìn)一步開(kāi)展體細(xì)胞核移植試驗(yàn)奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯 崔建勛）

Editing MSTN gene of Guangdong Xiaoerhua pig by using CRISPR/Cas9

WANG Min1，HUANG Xiang1，SHI Xuan1，LIU Xiao-feng1，ZENG Jian-hua2，LIU Xiao-hong1，CHEN Yao-sheng1，HE Zu-yong1
（1.State Key Laboratory of Biocontrol，School of Life Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510006，China；2.Guangdong YIHAO Food Co.，Ltd.，Guangzhou 510620，China）

MSTN （Myostatin） gene functions as a negative regulator of muscle growth. Therefore，disrupting the expression of MSTN has been proved as an efficient strategy to improve the muscle mass in livestock and poultry. In this study，we edited the exons of MSTN gene to disrupt its expression in order to increase muscle production of Guangdong Xiaoerhua pig by using the cutting-edge genome editing technology—CRISPR/Cas9. We designed six guide RNAs targeting on loci across three exons of MSTN gene. Through T7E1 assay and TA cloning analysis，we found that three guide RNAs were capable of targeted cutting on MSTN gene efficiently， with the targeting efficiency ranging from 17.0% to 28.3%. The editing efficiency of gRNA1-1 and gRNA3-3 in PEF cells of Guangdong Xiaoerhua pig，were both up to 50%. Particularly，editing efficiency in the third exon was as high as 61.5%. This study provides basis to generate MSTN-edited Xiaoerhua pigs by somatic cell nuclease transfer（SCNT） in future.

MSTN； CRISPR/Cas9； Guangdong Xiaoerhua pig； gene editing

Q789；S813.3

A

1004-874X（2017）02-0141-08

2016-11-15

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2016ZX08006003-006）；廣東省自然科學(xué)基金（2016A0 30313310）；廣東省揚(yáng)帆計(jì)劃項(xiàng)目（2014YT02H042）

王敏（1992-），女，在讀碩士生，E-mail：907825503@qq.com

何祖勇（1981-），男，博士，副教授， E-mail：zuyonghe@foxmail.com

王敏，黃翔，石翾，等.應(yīng)用CRISPR/Cas9編輯廣東小耳花豬MSTN基因［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（2）：141-148.