響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素的微波提取工藝

崔建強(qiáng)，唐 靜，王 燕，張 爽

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 710246)

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響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素的微波提取工藝

崔建強(qiáng)，唐 靜，王 燕，張 爽

(陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 710246)

以木犀草素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素微波提取工藝。確定最優(yōu)提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、微波提取時(shí)間70 s、料液比1∶20(g∶mL)、微波功率1 000 W，在此條件下，木犀草素得率可達(dá)到0.713%。該方法設(shè)計(jì)合理，可用于花生殼中木犀草素的提取。

木犀草素；響應(yīng)曲面法；微波提取

花生(Arachis hypogaea)，一年生草本植物，在我國(guó)已有500多年種植歷史，多個(gè)省份均有種植，產(chǎn)量和種植面積位居世界前列[1]。花生殼含有黃酮類(lèi)物質(zhì)木犀草素[2]，木犀草素具有抑菌、抗炎、抗氧化等[3]多種生理功能。近年來(lái)，微波提取技術(shù)因提取效率高、能耗低、提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[4]被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物有效物質(zhì)的提取。響應(yīng)曲面法是目前較為先進(jìn)的提取工藝優(yōu)化方法[5-6]。目前，對(duì)花生殼中木犀草素的提取工藝優(yōu)化大多采用正交實(shí)驗(yàn)法，尚未見(jiàn)到響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素微波提取工藝的報(bào)道。鑒于此，作者在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以木犀草素得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素微波提取工藝，擬為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用花生殼資源提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

花生殼，市售。

無(wú)水乙醇，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；石油醚(沸程60～90 ℃)，分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海友思生物技術(shù)公司。

WF-4000型微波快速反應(yīng)系統(tǒng)，上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司；FA1104型電子分析天平、FW-100D型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津鑫博得儀器有限公司；KQ2200DB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 花生殼前處理

取新鮮的花生殼，清洗，干燥，用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成一定粒徑的粗粉，用石油醚超聲脫脂2次(每次20min，溫度40 ℃，功率200W)，得到花生殼干粉。

1.3 花生殼中木犀草素的提取

按照一定料液比(花生殼干粉與乙醇的比例)稱(chēng)取一定質(zhì)量的花生殼干粉加到100 mL一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇中，搖勻，靜置2 h；在微波快速反應(yīng)系統(tǒng)中于一定功率、70 ℃下提取一定時(shí)間；待溶液溫度降至室溫后抽濾，收集濾液，濾渣再在相同條件下提取1次；合并濾液，加熱干燥使其揮醇并濃縮成浸膏，用石油醚對(duì)浸膏進(jìn)行超聲脫脂處理，干燥使石油醚揮干，用醇溶水沉法純化，濃縮，干燥，得木犀草素粉末。

1.4 木犀草素得率的測(cè)定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

精密稱(chēng)取2.0 mg干燥至恒重的木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用無(wú)水乙醇定容，搖勻后備用。

1.4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在200～600 nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素在351 nm處出現(xiàn)最大吸收。因此，以351 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別精密量取木犀草素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定351 nm處吸光度，以吸光度(y)為縱坐標(biāo)、木犀草素濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程。

1.4.4 木犀草素得率的計(jì)算

精密稱(chēng)取一定量的木犀草素粉末，加入一定量的無(wú)水乙醇超聲溶解，配成不同濃度的待測(cè)溶液，測(cè)定其吸光度(每種濃度測(cè)定3次)，根據(jù)擬合的線性回歸方程計(jì)算木犀草素含量，按下式計(jì)算木犀草素得率。

式中：m0為木犀草素含量，mg；V為樣液總體積，mL；V0為測(cè)定所用樣液的體積，mL；m為花生殼干粉質(zhì)量，g。

1.5 提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

在乙醇用量為100 mL、提取溫度為70 ℃的條件下，分別考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(50%、60%、70%、80%、90%)、微波功率(300 W、450 W、600 W、750 W、900 W)、微波提取時(shí)間(40 s、50 s、60 s、70 s、80 s)、料液比(1.5∶100、2.5∶100、5.0∶100、7.5∶100、10.0∶100，g∶mL)對(duì)木犀草素得率的影響。

1.5.2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，找出對(duì)木犀草素得率影響最大的3個(gè)因素，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)，根據(jù)響應(yīng)曲面構(gòu)建的三維圖確定最優(yōu)的微波提取工藝。

2 結(jié)果與討論

2.1 木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1 木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of mignonette

由圖1可知，木犀草素在0.002～0.010 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素得率的影響

在提取溫度為70 ℃、微波功率為1 000 W、料液比為1∶20(5.0 g花生殼干粉∶100 mL乙醇，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～90%，下同)、微波提取時(shí)間為70 s的條件下，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)木犀草素得率的影響Fig.2 Effect of volume fraction of ethanol on mignonette yield

由圖2可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，木犀草素得率先升高后降低，在乙醇體積分?jǐn)?shù)約為80%時(shí)得率較高。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～70%時(shí)，水含量較高，易溶于水的糖類(lèi)、蛋白質(zhì)易溶出，導(dǎo)致提取液腐敗變質(zhì)，得率較低；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)80%后，水含量過(guò)低不利于微波發(fā)揮作用，提取液顏色變淺，得率降低，同時(shí)，脂溶性成分溶出率提高也給后續(xù)的精制帶來(lái)較大的困難。綜合考慮，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%較為適宜。

2.2.2 微波功率對(duì)木犀草素得率的影響

稱(chēng)取5.0 g花生殼干粉，按1∶20的料液比加入80%乙醇100 mL，在提取溫度為70 ℃、不同微波功率下提取70 s，考察微波功率對(duì)木犀草素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 微波功率對(duì)木犀草素得率的影響Fig.3 Effect of microwave power on mignonette yield

由圖3可以看出，隨著微波功率的增大，木犀草素得率不斷升高，在600 W以后上升趨勢(shì)較緩?？赡苁且?yàn)?，在微波輻射的過(guò)程中，溶質(zhì)吸收微波的能力逐漸趨于飽和，故微波功率增大到一定程度時(shí)，對(duì)木犀草素的溶出影響不大。因此，微波功率不是影響木犀草素得率的關(guān)鍵因素。由于本實(shí)驗(yàn)所用微波儀的最大功率為1 000 W，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)微波功率均為1 000 W。

2.2.3 微波提取時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響

稱(chēng)取5.0 g花生殼干粉，按1∶20的料液比加入80%乙醇100 mL，在提取溫度為70 ℃、微波功率為1 000 W下分別提取不同時(shí)間，考察微波提取時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可以看出，隨著微波提取時(shí)間的延長(zhǎng)，木犀草素得率先升高后降低，在微波提取時(shí)間為70 s時(shí)，得率達(dá)到最高。這可能是由于，長(zhǎng)時(shí)間的微波輻射使木犀草素有所變性，或者是產(chǎn)生的熱效應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，使溶劑有所揮發(fā)，減少了木犀草素的溶出。因此，選擇微波提取時(shí)間為70 s較為適宜。

2.2.4 料液比對(duì)木犀草素得率的影響

分別稱(chēng)取花生殼干粉1.5 g、2.5 g、5.0 g、7.5 g、10.0 g，加入80%乙醇100 mL，在提取溫度為70 ℃、微波功率為1 000 W、微波提取時(shí)間為70 s的條件下，考察料液比對(duì)木犀草素得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖4 微波提取時(shí)間對(duì)木犀草素得率的影響Fig.4 Effect of microwave extraction time on mignonette yield

圖5 料液比對(duì)木犀草素得率的影響Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on mignonette yield

由圖5可以看出，隨著料液比的增大，木犀草素得率先驟降再緩緩下降。表明在溶劑用量一定時(shí)，加入的花生殼干粉越少，木犀草素得率越高。這是因?yàn)?，濃度差較大利于有效物質(zhì)的溶出。但是，在實(shí)際應(yīng)用中，溶劑用量過(guò)大，回收時(shí)耗時(shí)耗能，增加回收成本。綜合考慮，選擇料液比為5.0∶100(即1∶20)較為適宜。

2.3 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波提取時(shí)間、料液比作為自變量，以木犀草素得率為因變量(即響應(yīng)值)，通過(guò)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)[7]，構(gòu)建三維數(shù)學(xué)模型來(lái)優(yōu)化木犀草素的微波提取工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平見(jiàn)表1，響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.2 數(shù)學(xué)模型的建立及顯著性的檢驗(yàn)結(jié)果

對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式的回歸方程擬合，得到回歸方程模型為：Y=-4.47383+0.10651A+0.029868B+0.015158C+5.28375AB+8.84852AC-17.4716BC-19.80843A2-6.11295B2-17.95291C2(R2=0.9697，P<0.0001)。采用響應(yīng)面的ANOVA進(jìn)行回歸參數(shù)分析，檢驗(yàn)回歸方程模型和各項(xiàng)參數(shù)的顯著性，結(jié)果如表3所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design

表2 響應(yīng)曲面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.2 Results of response surface methodology

表3 響應(yīng)面回歸方程模型的方差分析

Tab.3 Variance analysis of regression requation model for response surface

2.3.3 交互作用的分析和優(yōu)化

用Design-Expert 8.0.6軟件得出乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波提取時(shí)間和料液比3個(gè)實(shí)驗(yàn)參數(shù)兩兩交互作用對(duì)得率影響的趨勢(shì)圖如圖6所示。

由圖6a可以看出，微波提取時(shí)間的響應(yīng)面曲線變化幅度小且較平緩，對(duì)得率影響不明顯；乙醇體積分?jǐn)?shù)的響應(yīng)面曲線振幅較大，對(duì)得率的影響較顯著；二者等高線趨于圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)木犀草素得率無(wú)顯著影響。由圖6b可以看出，料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面曲線振幅都較大，對(duì)得率的影響較顯著，料液比在(2.50～5.00)∶100范圍時(shí)得率較高；二者等高線呈橢圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)得率的影響較明顯。由圖6c可以看出，料液比的響應(yīng)面曲線較陡，微波提取時(shí)間的響應(yīng)面曲線較平緩，說(shuō)明料液比對(duì)得率影響較顯著；二者等高線呈圓形，說(shuō)明二者交互作用對(duì)得率影響不明顯。等高線圖和響應(yīng)面圖分析結(jié)果與方差分析結(jié)果基本一致。

2.3.4 回歸模型驗(yàn)證

從圖6可以看出有最大的響應(yīng)值，通過(guò)軟件分析預(yù)測(cè)最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、微波提取時(shí)間70 s、料液比5.0∶100(即1∶20)。為了檢驗(yàn)該回歸模型是否準(zhǔn)確，分別在預(yù)測(cè)的最優(yōu)提取工藝條件下進(jìn)行5次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，木犀草素得率平均值為0.713%。表明該模型設(shè)計(jì)合理。

圖6 等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 The contour map and the response surface map

3 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法確定花生殼中木犀草素的最優(yōu)微波提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、微波提取時(shí)間70 s、料液比1∶20(g∶mL)、微波功率1 000 W，在此條件下，木犀草素得率為0.713%。

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Optimization on Microwave Extraction Process of Mignonette from Peanut Shells by Response Surface Methodology

CUI Jian-qiang,TANG Jing,WANG Yan,ZHANG Shuang

(SchoolofMedicine,ShaanxiInstituteofInternationalTrade&Commerce,Xianyang710246,China)

Usingmignonetteyieldasanevaluationindex,themicrowaveextractionprocessofmignonettefrompeanutshellswasoptimizedbyasinglefactorexperimentandresponsesurfacemethodology.Theoptimumextractionconditionswereasfollows:ethanolvolumefractionof80%,microwaveextractiontimeof70s,solid-liquidratioof1∶20(g∶mL),andmicrowavepowerof1 000W.Underaboveconditions,mignonetteyieldreached0.713%.Thismethodisfeasible,andcanbeusedtoextractmignonettefrompeanutshells.

mignonette;responsesurfacemethodology;microwaveextraction

陜西省教育廳專(zhuān)項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(16JK2036)，2016年陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院科研項(xiàng)目(SMXY201605)

2016-12-06

崔建強(qiáng)(1979-)，男，陜西西安人，講師，研究方向：藥物分析化學(xué)，E-mail:1030287236@qq.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.04.010

R284.2

A

1672-5425(2017)04-0042-05

崔建強(qiáng)，唐靜，王燕，等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化花生殼中木犀草素的微波提取工藝[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(4)：42-46.