劉標(biāo)　易鳴　張依?！⊥跽瘛〕坛选畹挛摹〕叹A　付正仙　王進(jìn)

摘要：為了更好地保護(hù)和開發(fā)利用威寧綿羊這一優(yōu)良地方品種，本實(shí)驗(yàn)利用威寧綿羊構(gòu)建DNA池，設(shè)計(jì)4對(duì)引物擴(kuò)增威寧綿羊IGF-1基因外顯子及部分內(nèi)含子序列。將PCR產(chǎn)物純化并進(jìn)行雙向測(cè)序，通過(guò)DNAStar生物軟件分析確定多態(tài)性位點(diǎn)。利用在線生物信息學(xué)軟件分析多態(tài)位點(diǎn)對(duì)IGF-1基因RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、類胰島素生長(zhǎng)因子1的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，在擴(kuò)增的IGF-1基因中篩選到3個(gè)SNPs：Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，其中Exon4-A27T為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的精氨酸（Arg）變?yōu)榻z氨酸（Ser）；Exon2-T87C多態(tài)位點(diǎn)均未改變氨基酸的編碼，為同義突變；Intron1-A4387C在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。

關(guān)鍵詞：威寧綿羊；IGF-1基因；SNPs

中圖分類號(hào)：Q812

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）02-00082-04國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.018

Abstract：In order to protect and utilize the fine local variety， DNA pool of Weining sheep was constructed. 4 primers were designed to amplify exon and intron sequences of IGF-1 gene in Weining sheep . Products of PCR were purified and bidirectional sequenced to determine the SNPs. Influence of polymorphic sites on the RNA secondary and tertiary structure of IGF-1 gene was analyzed by online bioinformatics software. The result showed that 3 SNPs were detected in IGF-1 gene， namely Exon2-T87C， a synonymous mutation； Exon4-A27T， a missense mutation which changed the code of Arg into Ser； and Intron1-A4387C， a noncoding mutation in the intron.

Key words：Weining sheep； IGF-1 gene； SNPs

威寧綿羊的主產(chǎn)區(qū)為貴州省威寧縣，有悠久的飼養(yǎng)歷史，屬藏系山谷型粗毛綿羊。威寧綿羊體質(zhì)結(jié)實(shí)，個(gè)體矮小，生長(zhǎng)速度慢，繁殖能力差，生產(chǎn)性能低下。因此，對(duì)威寧綿羊的育種工作，特別是分子輔助育種對(duì)威寧綿羊的保護(hù)和開發(fā)利用具有重要意義。

類胰島素生長(zhǎng)因子（IGF）與胰島素原相似，是一種單鏈多肽，包括IGF-1和IGF-2。IGF-1能夠促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，并且對(duì)胎兒的生長(zhǎng)也有一定的作用，Breier B H等[1]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因缺失會(huì)使小鼠初生重下降。前人研究發(fā)現(xiàn)人類IGF-1基因5′調(diào)控區(qū)多態(tài)性與高度近視、身高肥胖和疾病的發(fā)生具有顯著相關(guān)性[2-4]。王明輝[5]通過(guò)研究IGF1-FoxO通路發(fā)現(xiàn)基因間的互作效應(yīng)會(huì)對(duì)豬的生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生影響。張春香[6]通過(guò)對(duì)山羊IGF-1基因的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)性顯著影響山羊的初生重和周歲體重。孫偉[7]以不同發(fā)育時(shí)期的湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)湖羊背最長(zhǎng)肌中IGF-1基因的表達(dá)變化進(jìn)行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1基因和湖羊背最長(zhǎng)肌肌纖維的密度之間呈顯著負(fù)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建威寧綿羊DNA池[8] （Sham P， 2002），篩選類胰島素生長(zhǎng)因子1基因的SNP位點(diǎn)，并對(duì)多態(tài)位點(diǎn)作生物信息學(xué)分析，利用軟件估算等位基因頻率，研究SNP位點(diǎn)對(duì)類胰島素生長(zhǎng)因子1基因的mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和類胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究類胰島素生長(zhǎng)因子1對(duì)威寧綿羊生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能的影響提供一定的參考。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用到的動(dòng)物是貴州省畢節(jié)市威寧縣綿羊，共采取了80只威寧綿羊血樣，采樣后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

12DNA池的構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)提取威寧綿羊血樣DNA所用的材料是生物公司提供的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，下一步進(jìn)行電泳用自己配制的1%瓊脂糖凝膠，目的是檢驗(yàn)DNA的提取是否達(dá)到預(yù)估的效果。在完成DNA的提取及電泳后，接下來(lái)測(cè)定所提取的DNA的濃度，用光度計(jì)儀（核心原理是：超微量紫外分光）對(duì)所提取的DNA進(jìn)行檢測(cè)，檢查完濃度后將其濃度稀釋到100ng/μL備用，取3μL混合均勻的威寧綿羊DNA樣品構(gòu)建DNA池。

13目的片段的擴(kuò)增

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢到GenBank登錄號(hào)：NC_0194601為綿羊類胰島素生長(zhǎng)因子1基因的DNA序列，引物的設(shè)計(jì)是利用生物軟件Primer 50做出了4對(duì)特異性引物，并送到生物公司進(jìn)行合成，引物信息見表1。PCR反應(yīng)體系為30μL：15μL 2×Es Taq Master Mix （含染料），3 μL模板DNA （Template DNA），72μL雙蒸水，上、下游引物各為24μL。進(jìn)行PCR反應(yīng)所用儀器是TC-512 PCR儀，PCR擴(kuò)增條件：95攝氏度預(yù)變性5min；95攝氏度變性30s，分別在各對(duì)特異性引物對(duì)應(yīng)的最適溫度（627℃），30μLs的時(shí)間退火，72攝氏度延伸一分鐘，循環(huán)次數(shù)為35，結(jié)束后循環(huán)溫度不變終止延伸5分鐘，4攝氏度溫度保存?zhèn)溆谩?/p>

14序列分析

PCR產(chǎn)物送到立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，比對(duì)測(cè)序結(jié)果、分析確定多態(tài)位點(diǎn)使用DNAstar軟件。

15測(cè)序圖峰高測(cè)量及等位基因頻率估算

多態(tài)位點(diǎn)等位基因估算公式：Pi=Hi/（H1+H2）

式中i=1、2，Pi代表多態(tài)位點(diǎn)的各等位基因頻率，H1和H2分別代表測(cè)序峰圖上此多態(tài)位點(diǎn)各等位基因?qū)?yīng)的峰的高度。

16IGF-1基因的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)及蛋白結(jié)構(gòu)分析

RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)：http：//rnatbiunivieacat/cgi-bin/RNAfoldcgi

蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：https：//npsa-prabiibcpfr/cgi-bin/npsa_automatpl？page=npsa_sopmahtml

蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)：http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index

2結(jié)果與分析

21DNA池的PCR產(chǎn)物測(cè)序

將由4對(duì)引物特異性擴(kuò)增出威寧綿羊IGF-1基因的目的序列送立菲生物技術(shù)有限公司經(jīng)膠回收純化后雙向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與綿羊IGF-1基因DNA序列（GenBank登錄號(hào)：NC_0194601）對(duì)比，確定為綿羊IGF-1基因序列。利用生物軟件分析共發(fā)現(xiàn)3個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，以類胰島素生長(zhǎng)因子1基因每一個(gè)外顯子第1位堿基計(jì)數(shù)為1，多態(tài)位點(diǎn)分別為：Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，見圖1。這些SNPs是否在不同綿羊品種中普遍存在，需要進(jìn)一步研究。SNPs能否造成威寧綿羊生長(zhǎng)性能變化也需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

22SNPs等位基因頻率估算

對(duì)威寧綿羊IGF-1基因三個(gè)多態(tài)位點(diǎn)的等位基因峰高用生物軟件進(jìn)行測(cè)量，各等位基因多態(tài)位點(diǎn)頻率應(yīng)用公式進(jìn)行估算，所得估算結(jié)果呈現(xiàn)在表2中。由此可看出，不同SNP位點(diǎn)等位基因頻率有較大的差異。

23突變前后IGF-1的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

對(duì)突變前后IGF-1基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)利用在線軟件進(jìn)行了檢測(cè)，分析和整理檢測(cè)結(jié)果，其中顯示為：所檢測(cè)的多態(tài)位點(diǎn)并沒有使RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)有顯著的變化情況。但導(dǎo)致RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)最小自由能減小的是突變位點(diǎn)，結(jié)果中-64580 kcal/mol是由-64490kcal/mol所變。影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可能是自由能的改變所致，因而改變后來(lái)蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程以及其相關(guān)功能的表達(dá)，由圖2可知。

24突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

采用在線軟件預(yù)測(cè)威寧綿羊IGF-1基因突變前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示：突變前后蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。

24突變前后蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用在線預(yù)測(cè)軟件對(duì)威寧綿羊類胰島素生長(zhǎng)因子1突變前后的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明多態(tài)位點(diǎn)未導(dǎo)致威寧綿羊的類胰島素生長(zhǎng)因子1三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變（圖3）。

3討論

類胰島素生長(zhǎng)因子1分子結(jié)構(gòu)與胰島素分子類似，生物學(xué)功能和胰島素相似。Wang[9]以中國(guó)西南地區(qū)的十幾個(gè)山羊品種為試驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行研究，研究結(jié)果顯示古蘭馬羊 IGF-1基因微5′側(cè)翼區(qū)的多態(tài)和產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，對(duì)初生重的影響未達(dá)到顯著水平。曹海洋[10]通過(guò)對(duì)IGF-1基因與小尾寒羊體尺、產(chǎn)羔數(shù)及血液理化性質(zhì)等性狀的關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因和這些性狀有顯著關(guān)聯(lián)效應(yīng)，認(rèn)為IGF-1基因能夠作為小尾寒羊生產(chǎn)性狀的分子標(biāo)記。因此，對(duì)威寧綿羊類胰島素生長(zhǎng)因子1基因的研究有望改變威寧綿羊生產(chǎn)性能差，綿羊個(gè)體之間差距大的情況，對(duì)威寧綿羊種質(zhì)資源的保護(hù)和育種提供幫助。

本次研究在威寧綿羊IGF-1基因中檢測(cè)得到3個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)： Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，其中Exon4-A27T為錯(cuò)義突變，導(dǎo)致編碼的精氨酸（Arg）變?yōu)榻z氨酸（Ser）；Exon2-T87C多態(tài)位點(diǎn)均未改變氨基酸的編碼，為同義突變；Intron1-A4387C在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。通過(guò)對(duì)四個(gè)SNP位點(diǎn)的等位基因頻率的比較發(fā)現(xiàn)，不同SNP位點(diǎn)等位基因頻率有較大的差異。Exon2-T87C、Exon4-A27T位點(diǎn)導(dǎo)致IGF-1基因RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能發(fā)生變化，可能影響RNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，錯(cuò)義突變位點(diǎn)Exon4-A27T未導(dǎo)致蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。

參考文獻(xiàn)：

[1]Breier B H， Gluckman P D， Bass J J Plasma concentrations of insulin-like growth factor-I and insulin in the infant calf： ontogeny and influence of altered nutrition[J] Journal of endocrinology， 1988， 119（1）： 43-50

[2]莊文娟 中國(guó)人群 IGF-1 基因多態(tài)性與高度近視的相關(guān)性研究[J] 重慶： 重慶醫(yī)科大學(xué)， 2012

[3]楊銳睿 重慶市中學(xué)生身高， 肥胖相關(guān)基因多態(tài)性與生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系研究 [D] 北京： 北京體育大學(xué)， 2012

[4]胡貴川，馮將，鮮思美，等貴州黑山羊IL-2基因的克隆及序列分析[J]山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2016（5）：25-29

[5]王明輝 候選基因集法及 IGF1-FoxO 通路與豬生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)聯(lián)研究[D] 上海：上海交通大學(xué)， 2011

[6]張春香， 羅海玲， 陳喻， 等 IGF-1 基因內(nèi)含子 4 多態(tài)性與南江黃羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)系[J] 中國(guó)草食動(dòng)物， 2008， 28（5）： 14-16

[7]孫偉， 李達(dá)， 馬月輝， 等 湖羊GHR和IGF-1基因表達(dá)的發(fā)育性變化及其與肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)[J] 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 45（22）： 4678-4687

[8]Sham P， Bader JS， Craig I， et al， DNA pooling： a tool for large-scale association studies[J] Nature Reviews Genetics， 2002，3（11）： 862-871

[9]WANG P， Ying T A N， ZHANG B， et al DNA Polymorphisms of 5′-Flanking Region of Insulin-Like Growth Factor 1 Gene and Their Association with Reproduction Traits in Goats[J] Agricultural Sciences in China， 2011， 10（10）： 1609-1617

[10]曹海洋 小尾寒羊ADPN和IGF1基因多態(tài)性及其遺傳效應(yīng)分析[D] 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2013