惠慧 張學(xué)坤+趙建軍+艾尼江

摘要：為明確新疆北疆早熟棉區(qū)黃萎病病菌的菌落類型及培養(yǎng)特性，于棉花黃萎病發(fā)病高峰期采集北疆早熟棉區(qū)典型發(fā)病地的病株進(jìn)行分離和鑒定，并測(cè)定其生物學(xué)特性。結(jié)果表明：所有供試菌株均為菌核型；25、20 ℃分別為菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢的最適溫度，33 ℃時(shí)絕大部分菌株仍能緩慢生長(zhǎng)，并產(chǎn)生少量孢子；pH值在4～9范圍內(nèi)菌株均可生長(zhǎng)，pH值在5～7范圍內(nèi)菌株生長(zhǎng)較快；6.25%的菌株致死溫度、時(shí)間為65 ℃、10 min，37.50%的菌株致死溫度、時(shí)間為60 ℃、10 min，56.25%的菌株致死溫度、時(shí)間為55 ℃、10 min。

關(guān)鍵詞：北疆；早熟棉區(qū)；棉花；黃萎??；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)： S435.621.2+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）04-0066-04

新疆是我國(guó)最大的優(yōu)質(zhì)商品棉生產(chǎn)基地，2012年該地區(qū)種植棉花面積為165萬hm2，棉花產(chǎn)量為308萬t，占全國(guó)總產(chǎn)量的比例首次超過50%，已連續(xù)20年實(shí)現(xiàn)棉花面積、單產(chǎn)、總產(chǎn)和調(diào)出量全國(guó)第一[1]。近年來，棉花黃萎病在新疆主要植棉區(qū)大范圍發(fā)生，發(fā)病程度中度及中度以上的病田占48.1%，重病田占 24.1%，嚴(yán)重威脅新疆棉花的可持續(xù)發(fā)展[2]。北疆棉區(qū)的黃萎病發(fā)生程度較南疆重[3]，由于北疆棉區(qū)雜交棉品種較少，自2013年開始從黃河流域棉區(qū)大量引入雜交棉種子，而黃河流域棉區(qū)落葉型黃萎病已普遍發(fā)生，導(dǎo)致新疆棉花落葉型黃萎病種群明顯增加[4]。目前，北疆棉區(qū)黃萎病發(fā)生面積不斷擴(kuò)增、急性枯死型癥狀明顯增加，生長(zhǎng)中后期有些棉田甚至絕產(chǎn)，這主要與黃萎病擴(kuò)展迅速且黃萎病病菌易受環(huán)境影響產(chǎn)生新的致病類型、土壤中病原菌的逐年累積、強(qiáng)致病力類型菌株增多等有關(guān)[5]。

針對(duì)北疆早熟棉區(qū)黃萎病發(fā)病日趨嚴(yán)重的情況，本研究有針對(duì)性地采集了典型發(fā)病地的病株進(jìn)行分離和鑒定，并測(cè)定其生物學(xué)性狀，了解北疆早熟棉區(qū)黃萎病病菌的菌落類型及培養(yǎng)特性，為北疆棉花抗病育種、品種合理布局及病害防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株的分離純化

[JP2]2013—2014年于棉花黃萎病發(fā)病高峰期，在北疆第五師、第七師和第八師各選取5個(gè)典型重病地采集病株，[JP3]進(jìn)行病原菌分離、純化與保存；對(duì)照菌株V991由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。

1.2不同溫度對(duì)菌株生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

將直徑為5 mm的菌塊接種于PDA平板上，分別置于15、20、25、30、33 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，重復(fù)3次。用十字劃線法測(cè)量恒溫培養(yǎng)第5、第10天的菌落直徑；觀察記載 25 ℃ 條件下培養(yǎng)第15天的菌落形態(tài)，然后在每皿中加入 10 mL 無菌水，洗下的孢子液用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定其濃度。

1.3不同pH值對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響

將直徑為5 mm的菌塊分別接種于pH值為4、5、6、7、8、9的PDA平板上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)，10 d后測(cè)量其菌落直徑，重復(fù)3次。

1.4菌絲致死溫度的測(cè)定

將直徑為5 mm的菌塊置于加有1 mL無菌水的已滅菌1.5 mL EP管中，分別在溫度為45、50、55、60、65、70 ℃的水浴鍋中處理10 min，然后將菌塊取出置于PDA平板上，10 d后觀察其生長(zhǎng)情況，重復(fù)3次。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

原始數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行處理后，采用SPSS 17.0進(jìn)行方差分析，通過Duncans法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1棉花黃萎病病菌的培養(yǎng)性狀觀察

在北疆早熟棉區(qū)（第五師、第七師、第八師）采集的病株上共分離到65個(gè)菌株，經(jīng)鏡檢鑒定為大麗輪枝菌（Verticillium dahliae Kleb.），然后進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，在每個(gè)師各篩選5個(gè)菌株作為供試菌株。

供試菌株在PDA平板上生長(zhǎng)的菌落大多為圓形或橢圓形，少數(shù)為不規(guī)則形狀。15個(gè)供試菌株及對(duì)照菌株V991均屬于菌核型，可產(chǎn)生大量微菌核，其中9個(gè)菌株（包括V991）的微菌核呈從內(nèi)向外放射狀，占所有菌株的 56.25%；其余7個(gè)菌株的微菌核呈同心輪紋狀，占43.75%；菌絲致密的菌株（包括V991）有13個(gè)，占所有菌株的81.25%；菌絲稀疏的有3個(gè)，占18.75%（表1）。

2.2不同溫度條件對(duì)菌株生長(zhǎng)速度和產(chǎn)孢量的影響

供試菌株在不同溫度條件下，其生長(zhǎng)速度存在差異性。

由表2可見，供試菌株在15～30 ℃條件下均可生長(zhǎng)，但在 33 ℃ 條件下，V1、V2、V5、V15等4個(gè)菌株完全停止生長(zhǎng)，其余菌株生長(zhǎng)極緩慢。在不同溫度條件下供試菌株的產(chǎn)孢量之間差異明顯。由表3可見，15～30 ℃條件下各菌株均可產(chǎn)孢，但在33 ℃條件下菌株V2不產(chǎn)孢，其余菌株均可產(chǎn)孢，但產(chǎn)孢量極少，平均值為0.5×107個(gè)/mL。25 ℃條件下，第五師、第七師和第八師菌株的平均生長(zhǎng)速度最快（圖1），但在20 ℃條件下平均產(chǎn)孢量最多（圖2）。33 ℃條件下菌株生長(zhǎng)速度最慢，產(chǎn)孢量也最少。

2.3不同pH值條件下菌絲的生長(zhǎng)情況

不同pH值條件下菌落生長(zhǎng)情況差異明顯。表4表明：供試菌株在pH值為4～9范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，pH值在5～7范圍內(nèi)生長(zhǎng)速度較快，pH值為4時(shí)生長(zhǎng)速度最慢。

第五師、第七師和第八師的菌株在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)速度最快，pH值為4時(shí)生長(zhǎng)速度最慢。

2.4菌絲致死溫度的測(cè)定

由表5可知，供試菌株中只有V3的致死溫度為65 ℃，時(shí)間為10 min，僅占6.25%；其中有5個(gè)菌株及對(duì)照V991菌絲的致死溫度、時(shí)間為60 ℃、10 min，占37.50%；其余9個(gè)菌絲的致死溫度、時(shí)間為 55 ℃、10 min，占56.25%。第五師5個(gè)菌株中除V3外，V1、V2菌株的菌絲致死溫度、時(shí)間均為 60 ℃、10 min，其余2個(gè)菌株的菌絲致死溫度、時(shí)間均為 55 ℃、10 min；第七師5個(gè)菌株中V7的菌絲致死溫度、時(shí)間為60 ℃、10 min，其余4個(gè)菌株的菌絲致死溫度、時(shí)間均為 55 ℃、10 min；第八師5個(gè)菌株中V11、V13的菌絲致死溫度、時(shí)間為60 ℃、10 min，其余3個(gè)菌株的菌絲致死溫度、時(shí)間均為55 ℃、3討論

北疆早熟棉區(qū)黃萎病病菌的菌落以菌核型為主，這與以前同類研究結(jié)果[6]基本一致。Pullman等研究表明，30～33 ℃ 會(huì)抑制黃萎病病菌的生長(zhǎng)和孢子的萌發(fā)[7]，本研究結(jié)果與之相似。本研究中33 ℃時(shí)有75%的菌株仍能緩慢生長(zhǎng)，并產(chǎn)生少量孢子，這與張莉等的研究結(jié)果[8]不一致，表明北疆早熟棉區(qū)黃萎病病菌的耐高溫能力可能有所增強(qiáng)，這也可能是造成當(dāng)前新疆棉花黃萎病在高溫期仍然發(fā)病較重的原因之一。30 ℃ 條件下發(fā)現(xiàn)有個(gè)別菌株由菌核型轉(zhuǎn)為菌絲型，這與朱荷琴等研究的高溫脅迫下溫度對(duì)病原菌的培養(yǎng)特性有影響[9]一致。pH值在4～9范圍內(nèi)菌株均可生長(zhǎng)，pH值在5～7范圍內(nèi)菌株生長(zhǎng)速度較快，表明pH值是影響棉花黃萎病病菌生長(zhǎng)的因素之一。6.25%菌株致死溫度、時(shí)間為 65 ℃、10 min，3750%菌株致死溫度、時(shí)間為60 ℃、10 min，56.25%的菌株致死溫度、時(shí)間為 55 ℃、10 min， 表明北疆早熟棉區(qū)黃萎病病菌對(duì)高溫具有一定的耐受性，籍秀琴等認(rèn)為高溫可明顯控制黃萎病的發(fā)生[10]，棉田遭遇連續(xù)高溫容易產(chǎn)生隱癥，但是一旦環(huán)境條件適宜即可暴發(fā)成災(zāi)。

本研究?jī)H從北疆早熟棉區(qū)中的第五師、第七師和第八師采集了15個(gè)重病田的病株，只能代表北疆早熟棉區(qū)局部黃萎病病菌的類型。下一階段的任務(wù)是廣泛采集病樣，進(jìn)行PCR分子鑒定及致病力分化研究，以便為新疆棉花黃萎病的防控提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]新華網(wǎng). 新疆棉花產(chǎn)量首次超過全國(guó)一半[EB/OL]. （2012-12-28）[HJ1.9mm][2015-09-10]http：//news.Xinhuanet.corn/fortune/2012-12/28/e-114194610.htm.

[2]劉海洋，王偉，張仁福，等. 新疆棉花黃萎病發(fā)生調(diào)查及病原菌系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52（1）：65-71.

[3]繆衛(wèi)國(guó)，田逢秀. 新疆棉花枯、黃萎病發(fā)生趨勢(shì)及研究現(xiàn)狀[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2000（增刊1）：107-109.

[4]石磊巖，馮潔，王莉梅，等. 北方植棉區(qū)棉花黃萎病菌生理分化類型研究[J]. 棉花學(xué)報(bào)，1997，9（5）：273-280.

[5]李國(guó)英，張新全，宋玉萍，等. 北疆棉區(qū)棉花黃萎病發(fā)生趨勢(shì)、抗性研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，52（1）：185-190.

[6]李國(guó)英，霍向東，田新莉，等. 新疆棉花黃萎病菌的培養(yǎng)特性及致病性分化的研究[J]. 石河子大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2000，4（1）：9-15.

[7]Pullman G S，Devay J E.Epidemiology of Veticillium wilt of cotton： effects of disease development on plant phenology and line yield[J].Phytopathology，1982，72（5）：554-559.

[8]張莉，馬慧寧，陳文霞，等. 石河子地區(qū)棉花黃萎病菌致病型監(jiān)測(cè)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（16）：4879-4880，4882.

[9]朱荷琴，宋曉軒，簡(jiǎn)桂良. 溫度脅迫對(duì)棉花黃萎病菌致病力的影響[J]. 棉花學(xué)報(bào)，2003，15（1）：33-36.

[10]籍秀琴，馬存. 棉花黃萎病消長(zhǎng)與溫度關(guān)系的分析[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，1980（8）：30-31.