尹曙光+劉曉

摘 要：掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)是納米生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新近發(fā)展起來的一種掃描探針顯微鏡技術(shù)，可被用來在生理條件下、高分辨率及非接觸地研究活細胞的表面形貌。掃描用玻璃微探針的性能直接影響掃描探針顯微鏡的分辨率和拓撲成像質(zhì)量，因此玻璃微探針的制備在實現(xiàn)納米生物樣品的高分辨率探測中具有重要的意義。文章運用掃描電子顯微鏡直接觀測玻璃微探針的幾何形狀進而推算電阻值，借助膜片鉗技術(shù)測量微探針實際電阻，并通過應(yīng)用該種玻璃探針對標準樣品進行掃描成像來判斷該微探針是否滿足實驗需要，最終綜合上述數(shù)據(jù)對納米尺度玻璃微探針的性能進行評價。

關(guān)鍵詞：掃描離子電導(dǎo)顯微鏡；納米技術(shù)；玻璃微探針

掃描離子電導(dǎo)顯微鏡（Scanning Ion Conductance Microscopy，SICM）憑借探針跳躍的非接觸掃描方式成為了目前最適合在生理液態(tài)環(huán)境中實時觀察活體生物樣品表面三維拓撲形貌的一種極具應(yīng)用前景的掃描探針顯微鏡技術(shù)[1，2]。它采用交流調(diào)制式負反饋控制技術(shù)和超納米精度的壓電陶瓷控制玻璃微探針在樣品表面以恒定距離掃描，記錄玻璃微探針的運動軌跡即可獲得樣品表面三維形貌[3]。因此，作為SICM感知樣品表面的唯一工具，玻璃微探針針尖的性能成為決定顯微鏡分辨率的關(guān)鍵性因素。

本文中我們對激光熔拉法拉[4]制出的玻璃微探針進行了高分辨率掃描電鏡觀測，獲得探針形態(tài)與針尖尺度參數(shù)，通過公式計算與膜片鉗實測針尖電阻的方法來評價制備出的納米玻璃微探針的性能。

1 微探針性能在掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)中的重要性

微探針是SICM進行納米尺度掃描成像的重要探測工具，其性能的優(yōu)劣直接影響SICM的成像質(zhì)量。此外，不同的掃描對象和掃描環(huán)境條件也對微探針針尖的曲率半徑和縱橫比等性狀提出了不同的要求。因此，對微探針的性能進行評價就顯得十分必要。

SICM玻璃微探針尖端的幾何形狀與采集到的數(shù)據(jù)的真實性密切相關(guān)。如圖1所示，當對臺階狀區(qū)域進行探測時，圓形針尖成像得到的是圓滑臺階（圖1a）；錐形針尖成像得到的是傾斜臺階（圖1b）；當針尖的錐度大于樣品的微觀尺寸時，由于針尖的曲率半徑相對較大，不僅無法準確探測樣品的表面形貌（圖1c）；而且還會產(chǎn)生橫向的位移誤差（圖1d）；針尖的曲率半徑越小，錐度越小，測量結(jié)果將越接近樣品的真實形貌（圖1e）。因此，為了提高測量結(jié)果的精度，在探針制備時，應(yīng)盡量選擇小曲率半徑和小錐度的微探針。

SICM微探針是由硅酸鹽玻璃或石英玻璃微管（外徑1.00mm， 內(nèi)徑0.59mm）拉制而成的纖細的玻璃微探針，也稱為玻璃微電極，為了方便向探針針尖內(nèi)充灌液體一般玻璃微管內(nèi)含導(dǎo)液絲（圖2）。借助掃描電鏡對玻璃微探針針尖的橫截面進行成像可以清晰地觀察到玻璃微管中的導(dǎo)液絲。導(dǎo)液絲是一根玻璃纖維原絲，而每根原絲又由成百上千根單絲組成，它利用毛細現(xiàn)象的引流作用使得液體更容易注入針尖而不形成氣泡。

為了描述的方便，研究人員往往把玻璃微探針人為地分成三個部分，如圖3所示，為普通光學(xué)顯微鏡下觀察到的玻璃微探針。左側(cè)紅框中是探針的尖部，中間的紅框是探針的頸部，右側(cè)的紅框是探針的肩部。因為SICM的分辨率與玻璃微探針尖端內(nèi)徑尺寸為同一數(shù)量級，要達到50-100納米的高分辨率，相應(yīng)的玻璃微探針尖部的內(nèi)徑尺寸應(yīng)在同樣尺度。探針的肩部應(yīng)具有良好的軸對稱性，如果探針的對稱性不好，會使得探針不是垂直于被測樣品之上，導(dǎo)致探針的定位與掃描產(chǎn)生誤差，直接影響負反饋控制的靈敏性。此外，為了減少針尖的振動增加掃描時的穩(wěn)定性，探針的頸部也要盡可能短以增加玻璃探針的剛度。

簡而言之，一支好的SICM微探針應(yīng)具備以下四點：第一，探針針尖的粗細要滿足分辨率的要求；第二，探針要有大的錐角；第三，探針的肩部要軸對稱；第四，探針的頸部要盡可能短。

2 微探針的掃描電鏡觀測與電阻測量

我們使用美國Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微電極拉制儀拉制硼硅酸鹽或石英玻璃微電極毛細管來制備SICM微探針。為了檢測該玻璃微探針尖端內(nèi)徑尺寸是否達到了50-100 nm，是否具備良好幾何形態(tài)，我們將拉制好的玻璃微探針進行噴金處理后，用導(dǎo)電膠帶粘到載物臺上，借助LEO1530VP 型掃描電鏡直接觀測玻璃微探針針尖的形狀。

掃描電鏡成像得到的玻璃微探針成像顯示探針針尖形狀對稱（圖4），利用掃描電鏡分析軟件測量出玻璃微探針尖端內(nèi)半徑（ri）為27nm，外半徑（ro）為60nm （圖4A、B）。該玻璃微探針的內(nèi)壁半角θ為2.7°。通過下面的玻璃微探針電阻計算公式，可以估算出該玻璃微探針在充灌電極內(nèi)液后的理論電阻值。

公式中：Rp為玻璃微探針電阻，ξ為玻璃微探針內(nèi)液（0.15mol/L KCl）的電導(dǎo)率，ri為玻璃微探針針尖的內(nèi)半徑，θ為玻璃微探針針尖的內(nèi)壁半角。采用該公式估算得到該玻璃微探針的電阻約為130MΩ。

采用上述的拉制條件，拉制多根具有相近針尖形狀的玻璃微探針進行膜片鉗電阻測量的實驗。將充灌有0.15mol/L KCl的玻璃微探針連接到商用膜片鉗Multiclamp 700B 放大器上，通過Clampex 12.0軟件測量得到微探針的實際電阻值為137.6±24.7MΩ（n=16），并且電阻值穩(wěn)定。

根據(jù)掃描電鏡測得的玻璃微探針針尖形狀數(shù)據(jù)計算出的玻璃微探針的電阻值與膜片鉗測得的玻璃微探針的實際電阻進行分析比較，發(fā)現(xiàn)這兩種方法得到的玻璃微探針電阻值基本一致。玻璃微探針的電阻直接影響流入探針針尖離子電流的強度，從而影響到SICM的負反饋掃描控制，用傳統(tǒng)的膜片鉗電阻測量方法分析玻璃微探針性狀的方法更加簡便快捷，可直觀、可靠地判定玻璃微探針的形態(tài)和拉制質(zhì)量。

3 標準樣品的掃描成像

為了檢測上述拉制條件下拉制的玻璃微探針是否滿足實驗需要，我們選擇尖端內(nèi)壁直徑約50nm，電阻值約150MΩ的玻璃微電極作為SICM掃描探針，對標準樣品（Platinum coated calibration grid，10μm pitch，200nm deep，3D reference）進行掃描成像。圖5是一幅40×40μm標準樣品的SICM成像。該圖清晰地呈現(xiàn)出樣品任意相鄰兩孔之間的距離為10μm， 并且深為200nm的標準階臺結(jié)構(gòu)清晰可見。這說明該玻璃微探針完全可以實現(xiàn)高分辨率掃描成像，并且無漂移、拖尾等現(xiàn)象。

4 結(jié)束語

玻璃微探針在SICM中的作用舉足輕重，因為探針的優(yōu)劣會直接影響到SICM的分辨率和負反饋控制的穩(wěn)定性，是實現(xiàn)SICM穩(wěn)定高質(zhì)量成像的基礎(chǔ)。為了實現(xiàn)掃SICM技術(shù)的高分辨生物樣品成像，玻璃微探針的制備是該技術(shù)走向掃描應(yīng)用的第一步，也是最基礎(chǔ)、最重要的一步，必須制備出性能優(yōu)良的納米尺度玻璃微探針。本文對SICM技術(shù)中使用的硼硅酸鹽和石英玻璃微探針針尖形狀進行了觀測，并根據(jù)觀測數(shù)據(jù)推算出了玻璃微探針的電阻值，該電阻值與膜片鉗測得的玻璃微探針電阻基本一致。利用該探針我們得到了標準樣品的高分辨率成像，這表明用Sutter Instrument P-2000型程控水平激光微電極拉制儀拉制的硼硅酸鹽和石英玻璃微探針的性能穩(wěn)定能夠滿足SICM技術(shù)高分辨率掃描的要求。

參考文獻

[1]Novak P，Li C，Shevchuk AI，et al.Nanoscale live-cell imaging using hopping probe ion conductance microscopy.Nat. Meth，2009，6：279-281.

[2]楊茜，劉曉，馬麗穎，等.非接觸式掃描離子電導(dǎo)顯微鏡技術(shù)在探測活體細胞表面微結(jié)構(gòu)中的應(yīng)用[J].電子顯微學(xué)報，2009，28（5）：48

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[3]楊茜，劉曉，張曉帆，等.基于掃描離子電導(dǎo)顯微鏡負反饋掃描控制技術(shù)的高分辨率膜片鉗技術(shù)[J].生理學(xué)報，2010，62（3）：275-283.

[4]Yang X，Liu X，Lu H，et al.Real-time investigation of acute toxicity of ZnO nanoparticles on human lung epithelia with Hopping Probe Ion Conductance Microscopy.Chemical Research in Toxicology，2012，25：297-304.