呂朝耕+王升+楊婉珍+劉談+郭蘭萍

[摘要] 用不同濃度2-氨基磷酸茚（AIP），并結(jié)合茉莉酸甲酯（MeJA）處理新疆紫草懸浮細(xì)胞，測(cè)定不同處理組、不同處理時(shí)間細(xì)胞中迷迭香酸及乙酰紫草素、脫氧紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、異戊酰紫草素等次生代謝物的含量，考察AIP抑制苯丙氨酸通路后對(duì)紫草懸浮細(xì)胞中次生代謝物合成、積累的影響。結(jié)果顯示MeJA處理能夠明顯促進(jìn)新疆紫草細(xì)胞中次生代謝物的合成積累；AIP處理能夠抑制新疆紫草細(xì)胞中上述次生代謝物的積累，并在二者聯(lián)合處理時(shí)能一定程度上抵消MeJA的促進(jìn)作用，且抑制作用的強(qiáng)弱與處理劑量、處理時(shí)間存在正相關(guān)性。表明苯丙氨酸途徑在紫草素類(lèi)化合物生物合成中具有重要作用，可為通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)方式生產(chǎn)紫草素類(lèi)化合物的代謝調(diào)控及紫草素類(lèi)化合物生物合成等進(jìn)一步研究提供參考。

[關(guān)鍵詞] 新疆紫草；2-氨基磷酸茚；次生代謝；紫草素

Secondary metabolic responses to treatment of 2-aminoindan-2-

phosphonic acid in cell lines from Arnebia euchroma

LV Chao-geng1， WANG Sheng1， YANG Wan-zhen1，2， LIU Tan 1， GUO Lan-ping1*

（1. National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，

State Key Laboratory Breeding Base of Dao-di Herbs，Beijing 100700， China；

2. School of Traditional ChineseMedicine，Capital Medical University，Beijing 100069， China）

[Abstract] The accumulation of rosmarinic acid， acetylshikonin， deoxyshikonin， β， β′-dimethylacrylshikonin and isovalerylshikonin was investigated in cell suspension cultures of Arnebia euchroma （Royle） Johnst under the influence of 2-aminoindan-2-phosphonic acid （AIP）， an inhibitor of phenylalanine ammonia lyase （PAL）， and of the effector methyl jasmonate （MeJA）. The results showed that methyl jasmonate promoted the accumulation of rosmarinic acid and shikonin derivatives. Conversely， 2-aminoindan-2-phosphonic acid suppressed the formation of rosmarinic acid， which indicated that AIP， indeed， was able to inhibit the phenylpropanoid pathway in A. euchroma. Meanwhile， the content of total shinkonins and other four kinds of shikonin derivatives， though varied in degrees， was also inhibited. And the inhibition was dose-dependent and time-dependent. Acetylshikonin responsed most rapidly to the treatment of AIP， the content reduced after 24 h of treatment and decreased to only half of those untreated control 48 h after teratment. β， β′-Dimethylacrylshikonin， difffer from acetylshikonin， responded much slowly to the treatment， inhibition could only be observed 96 h later. These suggest that phenylpropanoid pathway plays an important role in the shikoninsbiosynthesis， and this study provides a reference for the further research in metabolic regulation of producing shikonins by cell culture technology and biosynthesis pathways of shikonin derivatives. Still， shikonins biosynthesis pathways is complicated， the exact dose- and time-effect relationship of AIP and interaction between AIP and other effectors like MeJA need further research.

[Key words] Arnebia euchroma；2-aminoindan-2-phosphonic acid；secondary metabolites；shikonin

紫草科軟紫草屬新疆紫草Arnebia euchroma （Royle） Johnst是傳統(tǒng)中藥材紫草Arnebiae Radix的重要來(lái)源，其有效成分的含量高，臨床療效好，具有廣泛的藥理作用[1]。

新疆紫草中主要次生代謝物包括萘醌類(lèi)的紫草素類(lèi)化合物，紫草呋喃等呋喃類(lèi)化合物和迷迭香酸等酚酸類(lèi)化合物[1]，其中紫草素類(lèi)化合物為其主要活性成分。通常認(rèn)為紫草素類(lèi)化合物生物合成途徑為苯丙氨酸（PP）途徑-甲羥戊酸（MVA）途徑/甲基磷酸赤蘚糖醇（MEP）途徑的復(fù)合途徑，紫草呋喃來(lái)自于紫草素類(lèi)衍生物生物合成的中間產(chǎn)物。迷迭香酸生物合成途徑在丹參、紫蘇等植物中研究更為清晰，目前認(rèn)為迷迭香酸生物合成途徑包含了2條平行的苯丙氨酸支路和酪氨酸支路[2-4]（圖1）。

2-氨基磷酸茚（AIP）是一種苯丙氨酸的結(jié)構(gòu)類(lèi)似物，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而特異性地抑制苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性，從而達(dá)到對(duì)PP途徑的抑制性調(diào)控[5-6]。在已有報(bào)道AIP處理可以抑制硬紫草中迷迭香酸合成[7]的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)AIP處理新疆紫草紅色系懸浮細(xì)胞，考察抑制PP途徑對(duì)新疆紫草細(xì)胞中紫草素類(lèi)化合物合成、積累的影響，探索PP途徑在新疆紫草紫草素合成中發(fā)揮的作用。考慮到懸浮細(xì)胞材料本身培養(yǎng)狀態(tài)與酶活性的不穩(wěn)定，避免出現(xiàn)PP途徑本身處于低活性狀態(tài)下AIP處理后出現(xiàn)假陰性結(jié)果，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道茉莉酸甲酯（MeJA）可以增強(qiáng)PP途徑活性、促進(jìn)新疆紫草細(xì)胞次生代謝物合成與積累[2，8]的現(xiàn)象，本研究設(shè)計(jì)考察了AIP結(jié)合MeJA處理懸浮細(xì)胞后，AIP對(duì)活性上調(diào)狀態(tài)下PP途徑的調(diào)控作用，作為參考。

1 材料

新疆紫草愈傷細(xì)胞取自中國(guó)科學(xué)院植物研究所葉和春研究員處，并由本實(shí)驗(yàn)室保存并繼代為懸浮細(xì)胞。

超高效液相色譜儀（UPLC）：Waters ACQUITY UPLCTM系統(tǒng)（美國(guó)Waters公司，包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、Empower 3色譜工作站）；UPLC Column：ACQUITY UPLC HSS T3 C18（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm）；熒光酶標(biāo)儀（Thmeral，Varioskan Flash）；電子精密天平（SartoriusBS2202S）；球磨儀（Retsch公司，MM 400混合型球磨儀）；電熱干燥箱（上海恒科儀器有限公司，DHG-9145AZ）；超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技有限公司）；及其他常規(guī)組織培養(yǎng)所需設(shè)備等。

AIP（購(gòu)自愛(ài)拓化學(xué)有限公司，純度97%）；茉莉酸甲酯（購(gòu)自Aldrich化學(xué)試劑公司，純度95%）；迷迭香酸、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素（購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院），乙酰紫草素（購(gòu)自上海同田生物科技公司），脫氧紫草素、異戊酰紫草素（購(gòu)自日本TCI化成株式會(huì)社），純度均 ≥ 98%；色譜純甲醇、乙腈（購(gòu)自Fisher Chemical公司）；培養(yǎng)基配制所需試劑等為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 材料處理

參照已有報(bào)道及預(yù)實(shí)驗(yàn)，選定20 μmol·L-1為MeJA處理濃度，20 μmol·L-1為低濃度AIP處理，200 μmol·L-1為高濃度AIP處理。AIP，MeJA以甲醇配制成母液并稀釋。以培養(yǎng)至第13天的新疆紫草紅色系懸浮細(xì)胞為材料，分別以終濃度20 μmol·L-1AIP，200 μmol·L-1 AIP，20 μmol·L-1 AIP+20 μmol·L-1 MeJA，200 μmol·L-1 AIP+20 μmol·L-1 MeJA，20 μmol·L-1 MeJA，甲醇（CK）為6個(gè)處理組處理。于處理后0，24，48，72，96 h分別取樣，真空抽濾，置平皿中于電熱干燥箱40 ℃烘干。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

2.2 供試品制備

精密稱取0.02 g新疆紫草干細(xì)胞，研磨粉碎后加入1.5 mL甲醇，25 ℃超聲提取60 min，離心，取上清液，0.22 μm濾膜過(guò)濾制樣。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 總紫草素測(cè)定 以脫氧紫草素標(biāo)定總萘醌，測(cè)定新疆紫草細(xì)胞中紫草素類(lèi)化合物的含量。以2.2項(xiàng)中制得供試品適量，稀釋一定倍數(shù)，以紫外-可見(jiàn)分光光度法在520 nm處測(cè)定吸光度，按脫氧紫草素所得標(biāo)準(zhǔn)曲線（表1）計(jì)算，即得。

2.3.2 UPLC測(cè)定各成分含量 參照本實(shí)驗(yàn)室建立的新疆紫草次生代謝物測(cè)定方法[2]，測(cè)定懸浮細(xì)胞中迷迭香酸、乙酰紫草素、脫氧紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、異戊酰紫草素含量。系統(tǒng)為ACQUITY UPLC；色譜柱為HSS T3超高效液相柱（Waters Corporation，Milford，MA，USA，2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.1%甲酸-水（B）；梯度洗脫：10%～35% A，0～4 min；35%～60% A，4～4.3 min；60%～72% A，4.3～10 min；72%～80% A，10～11 min；流速0.5 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量1 μL。標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍見(jiàn)表1。

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2013和OriginPro 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與處理。

3 結(jié)果與分析

3.1 各處理對(duì)新疆紫草細(xì)胞中總紫草素合成積累影響

各測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。CK組中總紫草素含量在24～96 h隨時(shí)間而升高，各處理組處理24 h內(nèi)即表現(xiàn)出相應(yīng)作用。其中，MeJA可以促進(jìn)新疆紫草紅色系懸浮細(xì)胞中紫草素的合成與積累，與已有報(bào)道相一致，24 h取樣中MeJA處理組總紫草素含量即達(dá)到2.05%，高于CK組的1.79%，且處理后72 h內(nèi)促進(jìn)作用隨時(shí)間增強(qiáng)，最高時(shí)MeJA處理組相比CK組含量提高0.52%。比較AIP處理組與CK組，48 h后AIP處理組逐漸表現(xiàn)出明顯的抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間而增強(qiáng)，最高時(shí)含量相差達(dá)1.08%。AIP處理組與AIP+MeJA處理組相比，后者總紫草素含量則高于前者，而AIP+MeJA處理組與MeJA處理組比較，MeJA處理組的總紫草素含量更高，表明AIP處理可以部分消除MeJA的促進(jìn)作用。AIP處理組內(nèi)部比較，高濃度處理組相比低濃度處理組在96 h表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，而在72 h之前，二者并無(wú)明顯差異。

3.2 各處理對(duì)新疆紫草細(xì)胞中迷迭香酸合成積累影響

對(duì)照組新疆紫草懸浮細(xì)胞中迷迭香酸含量96 h內(nèi)存在先降低后升高的波動(dòng)。MeJA處理可以明顯提高迷迭香酸含量，最高時(shí)質(zhì)量分?jǐn)?shù)由0.128%提高至0.228%，增幅超過(guò)75%。迷迭香酸對(duì)AIP處理反應(yīng)靈敏，高濃度AIP處理后24 h即能明顯抑制細(xì)胞系中迷迭香酸的合成積累，且抑制作用隨處理時(shí)間增加而增強(qiáng)，96 h時(shí)高濃度處理組含量0.085%相比CK組0.153%降低接近一半。低濃度AIP處理則并沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，表明AIP對(duì)新疆紫草中迷迭香酸合成積累的抑制可能存在劑量相關(guān)性。AIP+MeJA處理組與CK組、MeJA單獨(dú)處理組相比，AIP+MeJA處理組與CK組迷迭香酸含量基本持平，而低于MeJA單獨(dú)處理組，同樣表明AIP可部分抵消MeJA的促進(jìn)作用。

3.3 各處理對(duì)新疆紫草細(xì)胞中各紫草素類(lèi)化合物合成積累影響

乙酰紫草素、脫氧紫草素、β，β′-二甲基丙烯酰紫草素、異戊酰紫草素四類(lèi)紫草素類(lèi)化合物對(duì)處理的反應(yīng)有所差異。其中乙酰紫草素對(duì)各處理反應(yīng)最為靈敏，脫氧紫草素、異戊酰紫草素靈敏度稍低，β，β′-二甲基丙烯酰紫草素變化不明顯。

乙酰紫草素對(duì)處理反應(yīng)靈敏，MeJA處理24 h后即表現(xiàn)出促進(jìn)作用，處理48 h后質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%以上并保持穩(wěn)定，相比CK組最高提高0.12%，提高近一半。無(wú)論低濃度AIP處理組還是高濃度AIP處理組，乙酰紫草素含量均明顯低于CK組，且高濃度處理組含量均低于低濃度處理組，表明AIP對(duì)乙酰紫草素合成積累有明顯的抑制作用，且抑制作用強(qiáng)弱可能存在劑量正相關(guān)性。低濃度AIP+MeJA處理組乙酰紫草素含量均高于AIP處理組，與CK組接近，低于MeJA處理組。而高濃度AIP+MeJA處理組含量與高濃度AIP處理組含量相近，低于低濃度AIP+MeJA處理組，表明200 μmol·L-1的AIP處理濃度對(duì)乙酰紫草素合成積累的抑制作用可能已超過(guò)20 μmol·L-1MeJA的促進(jìn)作用。

脫氧紫草素與異戊酰紫草素在MeJA處理后均表現(xiàn)出促進(jìn)作用，在AIP處理48 h后開(kāi)始表現(xiàn)出較明顯的抑制作用，且抑制作用隨時(shí)間而增強(qiáng)。低濃度與高濃度AIP處理組相比，脫氧紫草素高濃度處理組表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用，但差別并不明顯；異戊酰紫草素在處理后48 h內(nèi)高濃度組比低濃度組含量更低，48 h后差異消失。AIP+MeJA處理組脫氧紫草素與異戊酰紫草素含量72 h后表現(xiàn)出高于AIP處理組，低于MeJA處理組的現(xiàn)象。

β，β′-二甲基丙烯酰紫草素對(duì)各處理反應(yīng)均較遲緩，處理0～72 h內(nèi)各組均未表現(xiàn)出明顯差異，72 h后MeJA處理組開(kāi)始相對(duì)CK組表現(xiàn)出一定促進(jìn)作用，96 h后AIP處理組表現(xiàn)出抑制作用，且AIP+MeJA處理組β，β′-二甲基丙烯酰紫草素含量高于AIP處理組而低于MeJA單獨(dú)處理組。

整體看來(lái)，迷迭香酸在AIP處理后表現(xiàn)出明顯的合成、積累量下降現(xiàn)象且高濃度處理組抑制強(qiáng)于低濃度處理組，表明AIP處理的確對(duì)紫草懸浮細(xì)胞次生代謝的苯丙氨酸途徑表現(xiàn)出抑制作用，進(jìn)而抑制了迷迭香酸的合成與積累，且抑制作用的強(qiáng)弱與處理時(shí)間、處理劑量呈正相關(guān)性。在總紫草素含量分析中發(fā)現(xiàn)，AIP處理組相對(duì)CK組同樣表現(xiàn)出一定的抑制作用，72 h后抑制作用表現(xiàn)更為明顯。更進(jìn)一步，不同紫草素類(lèi)化合物對(duì)AIP處理在反應(yīng)強(qiáng)度、敏感性上表現(xiàn)有較大差異，其中乙酰紫草素對(duì)抑制作用表現(xiàn)尤為明顯；脫氧紫草素與異戊酰紫草素反應(yīng)相似，弱于乙酰紫草素；β，β′-二甲基丙烯酰紫草素AIP處理組相對(duì)CK組沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的抑制作用，但可以部分抵消MeJA的促進(jìn)作用。探討上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因，筆者初步認(rèn)為可能與各成分在細(xì)胞中含量、生理所用及細(xì)胞的自我調(diào)控有關(guān)。即，紫草細(xì)胞本身可能僅需要一定量的某種成分來(lái)維持自身生理功能，而此成分自身含量與需求量相接近，則該成分的合成積累會(huì)在各種調(diào)控下表現(xiàn)出更強(qiáng)的穩(wěn)定性，如β，β′-二甲基丙烯酰紫草素；而有的成分自身需求量較高，且其含量高于自身需求量，則對(duì)各種調(diào)控的反應(yīng)可能會(huì)更為敏感，如乙酰紫草素等，但出現(xiàn)此現(xiàn)象的真正內(nèi)在原因與其具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。

4 討論

由于新疆紫草紫草藥用及工業(yè)上的價(jià)值，近年來(lái)被大量采集，加上本來(lái)就分布狹窄，資源嚴(yán)重受損[9]，而利用細(xì)胞培養(yǎng)、微生物合成等生物工程技術(shù)生產(chǎn)紫草素是當(dāng)前解決紫草素供應(yīng)問(wèn)題的重要研究方向，近年來(lái)在紫草細(xì)胞系培養(yǎng)調(diào)控、功能基因鑒定[10-12]等方面研究已有很多進(jìn)展。

苯丙氨酸途徑在植物次生代謝中有重要作用，與水楊酸、黃酮、萜類(lèi)等的合成密切相關(guān)。而AIP作為苯丙氨酸途徑中關(guān)鍵酶PAL的特異性抑制劑，通過(guò)AIP處理調(diào)節(jié)PP途徑的代謝，進(jìn)而探索該通路在植物整體次生代謝中的作用也有相關(guān)報(bào)道，如Ren等[13]利用AIP處理抑制經(jīng)PP途徑合成的水楊酸合成，考察內(nèi)生菌在白術(shù)根腐病保護(hù)方面的作用；王逸文等[14]考察了AIP與MeJA處理對(duì)高山紅景天愈傷組織生長(zhǎng)和紅景天苷積累的影響，發(fā)現(xiàn)AIP處理可控制PP途徑碳流，間接提高其他通路碳流量，提高紅景天苷的合成等。

本研究通過(guò)結(jié)合AIP與MeJA處理，考察AIP對(duì)新疆紫草懸浮細(xì)胞中PP途徑的抑制作用帶來(lái)的次生代謝物合成積累的變化，為進(jìn)一步了解新疆紫草中PP途徑在紫草素合成中的功能及特性奠定基礎(chǔ)，同時(shí)還可為各代謝途徑之間的相互作用以及代謝通路的代謝分流等問(wèn)題的研究提供參考。本研究中選用高、低2種AIP處理濃度，發(fā)現(xiàn)AIP的抑制作用與處理濃度、處理時(shí)間有正相關(guān)性，但具體的量效、時(shí)效關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。同時(shí)AIP與MeJA等誘導(dǎo)子間的相互作用關(guān)系也有待進(jìn)一步挖掘。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]