血小板源性生長(zhǎng)因子在富血小板血漿治療高原地區(qū)脊柱結(jié)核病中的作用機(jī)制研究※

李釗偉，李澤清，唐保明，李春亮，趙 磊，楊?lèi)?ài)榮

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；3.青海省人民醫(yī)院骨科；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系)

血小板源性生長(zhǎng)因子在富血小板血漿治療高原地區(qū)脊柱結(jié)核病中的作用機(jī)制研究※

李釗偉1，李澤清1，唐保明1，李春亮3，趙 磊4，楊?lèi)?ài)榮△2

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科；2.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；3.青海省人民醫(yī)院骨科；4.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系)

目的 觀察富血小板血漿對(duì)高原地區(qū)脊柱結(jié)核病治療的影響，了解血小板源性生長(zhǎng)因子在富血小板血漿治療高原地區(qū)脊柱結(jié)核病的作用機(jī)制。方法 收集本院自2013年3月～2016年3期間青海本地脊柱結(jié)核患者，根據(jù)患者術(shù)中是否經(jīng)PRP治療分為PRP組和非PRP組，術(shù)后給予相同治療，并于術(shù)后連續(xù)4周每周復(fù)查各組患者CRP、ESR值；12只家兔隨機(jī)分為兩組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)，每組6只，無(wú)菌操作去除各組家兔椎體側(cè)方1 cm×1 cm骨組織，用咬骨鉗將其咬碎備用，實(shí)驗(yàn)組骨組織與預(yù)先制備好的PRP混合，并植入對(duì)應(yīng)家兔骨缺損處；對(duì)照組骨組織與等體積的生理鹽水混合，并植入對(duì)應(yīng)家兔骨缺損處，術(shù)后分籠常規(guī)飼養(yǎng)。8周后無(wú)菌獲取各組適量骨缺損處組織，置于液氮速凍再移至-80 ℃冰箱暫存，采用Western Blot技術(shù)檢測(cè)各組骨缺損處組織PDGF、AP-1以及IL-6蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果 PRP組(n=61)和非PRP組(n=57)治療脊柱結(jié)核病均達(dá)到治愈，但PRP組術(shù)后復(fù)發(fā)感染、血腫以及竇道均比非PRP組少；術(shù)前PRP和非PRP組ESR、CRP值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但PRP組和非PRP組術(shù)后2、3、4周ESR和CRP值變化差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且均隨術(shù)后時(shí)間延長(zhǎng)而降低。12只家兔，造模前后無(wú)感染和死亡，均進(jìn)入結(jié)果分析，無(wú)托失值；家兔PRP組和對(duì)照組骨缺損處組織PDGF、AP-1以及IL-6蛋白的表達(dá)水平變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且PRP組三種蛋白表達(dá)水平均明顯升高。結(jié)論 血小板源性生長(zhǎng)因子可能通過(guò)PDGF、AP-1以及IL-6蛋白改變發(fā)揮減少脊柱結(jié)核患者術(shù)后并發(fā)癥的作用，提高富血小板血漿治療高原地區(qū)脊柱結(jié)核病術(shù)后傷口愈合效果。

高原脊柱結(jié)核 血小板源性生長(zhǎng)因子 富血小板血漿

脊柱結(jié)核在青藏高原居民中發(fā)病率、凸畸形發(fā)生率和截癱等嚴(yán)重并發(fā)癥幾率都較高[1]。目前國(guó)內(nèi)外治療脊柱結(jié)核的主流方法為藥物抗癆基礎(chǔ)上，行病灶清除植骨融合內(nèi)固定手術(shù)治療，但術(shù)后易有結(jié)核感染復(fù)發(fā)、竇道形成等并發(fā)癥。在主流方法基礎(chǔ)上加入富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)輔助治療是我們正在探索的新的治療手段，PRP是通過(guò)離心自體血而得到的含有高濃度血小板的血漿，能加速多種組織修復(fù)愈合，并有良好的抗感染作用。PRP主要成分之一血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet-derived growth factor，PDGF)是一種重要的血管形成刺激因子，在組織生長(zhǎng)、修復(fù)和再生過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。PDGF可刺激、提高體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6，IL-6)的轉(zhuǎn)錄水平，但此作用在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中少見(jiàn)有報(bào)道[2]。激活子蛋白-1(activator protein 1，AP-1)是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控IL-6的表達(dá)[3]。本文在回顧性分析PRP治療高原地區(qū)脊柱結(jié)核病的效果的基礎(chǔ)上，用成熟家兔建立脊柱椎體骨缺損模型，檢測(cè)PRP的最主要成分PDGF在脊柱椎體骨缺損愈合中發(fā)揮的作用機(jī)制，為高原地區(qū)脊柱結(jié)核治療探索新的方法，并提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 患者一般資料和觀察指標(biāo)

2013年3月至2016年3月，在青海大學(xué)附屬醫(yī)院手術(shù)治療脊柱結(jié)核病例118例，其中男性39例，女性79例?；颊咂骄挲g53.55±4.7歲，均來(lái)自青海省高海拔地區(qū)，平均居住海拔3487米，67%為藏族等少數(shù)民族。脊柱結(jié)核分布節(jié)段為頸椎結(jié)核4例、胸椎結(jié)核41例、腰胸段結(jié)核12例、腰椎結(jié)核58例，腰骶段結(jié)核3例?；颊呔弦韵录怪Y(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)有不同程度的頸、背部疼痛，胸腹部及肢體放射痛，部分有盜汗、午后低熱、體重減輕等結(jié)核典型癥狀；(2)病灶標(biāo)本經(jīng)Bactec960系統(tǒng)快速結(jié)核菌培養(yǎng)陽(yáng)性或者病理檢查確診結(jié)合；(3)X線片、CT及MR檢查符合脊柱結(jié)合改變。治療后觀察術(shù)后四周C反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP)、血沉(Erythrocyte Sedimentation Rate，ESR)及竇道、感染和血腫是否發(fā)生等。

1.2 患者手術(shù)治療方法

1.2.1 術(shù)前準(zhǔn)備

對(duì)患者的一般情況、生化指標(biāo)進(jìn)行常規(guī)檢查以評(píng)估患者對(duì)手術(shù)的耐受程度。所有患者進(jìn)行四聯(lián)抗癆治療3周以上，每周復(fù)查ESR，患者結(jié)核中毒癥狀減輕，ESR持續(xù)降低并達(dá)40 mm/h以下時(shí)手術(shù)。

1.2.2 PRP采集制備輸注

術(shù)前自患者肘部取外周靜脈血20～60 mL，離心(350g×5min)后收集 PRP，將其再次離心(50g×5min)濃縮至 4～12 mL。所用材料為3.8% 檸檬酸鈉抗凝(美國(guó)sigma公司)；5 mL 離心管(德國(guó)GIBCO公司)，XL90 超速低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)。

1.2.3 術(shù)中治療

患者均采用全身麻醉，根據(jù)患者病變部位具體情況，行前路或后路病灶清除、植骨、內(nèi)固定術(shù)治療。將患者分為PRP組和對(duì)照組，PRP組在手術(shù)入路縫合后將收集的PRP注射到脊柱患處。

1.2.4 術(shù)后處理

術(shù)后PRP組和對(duì)照組處理相同：病灶行病理檢查，術(shù)后繼續(xù)抗癆治療10～12個(gè)月。術(shù)后連續(xù)4周每周復(fù)查CRP、ESR。

1.3 脊柱椎體骨缺損模型及組織提取方法

用12只家兔(體重2.5～3.0kg，雌雄不限)建立脊柱椎體骨缺損模型，隨機(jī)分兩組(每組6只)，即PRP治療組和對(duì)照組。兩組家兔分別腹腔內(nèi)注射5%利多卡因10 mL，待麻醉完全后將家兔置于手術(shù)架上，取腹部正中缺口，剝離腹部淺層肌肉，打開(kāi)腹膜后用腹壁拉鉤牽開(kāi)腸道及軟組織，暴露椎體前方，用小號(hào)骨鑿去除椎體側(cè)方1 cm×1 cm骨組織，去除的骨組織用咬骨鉗咬碎，PRP治療組骨組織與預(yù)先制備好的PRP混合后植入骨缺損處，對(duì)照組混合相同體積的生理鹽水。絲線小心地間斷封閉切口，造模成功手術(shù)之后將家兔分籠正常飼養(yǎng)。飼養(yǎng)八周后切開(kāi)手術(shù)部位取一定量骨缺損處組織。所有取出的組織標(biāo)本立即置液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。

1.4 Western Blot檢測(cè)方法

用組織總蛋白質(zhì)提取試劑盒提取骨缺損組織總蛋白質(zhì)，檢測(cè)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜后用5% BSA封閉1 h，加入一抗(PDGF為1：300，AP-1為1：500，IL-6為1：500，β-acting為1：10000)4 ℃過(guò)夜。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入HRP標(biāo)記的二抗(1：10000)37 ℃搖床孵育1 h，TBST 洗膜3次(10min/次)，然后顯色。將膠片進(jìn)行掃描、拍照，經(jīng)Bio-Rad Quantity one 4.4.0圖像分析系統(tǒng)采集圖像，采用β-acting作為內(nèi)參，以光密度比值表示該蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

2.1.1 患者術(shù)后情況

根據(jù)術(shù)后隨訪資料，按照脊柱結(jié)核臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)，PRP組和非PRP組均達(dá)到治愈，但非PRP組有1例(1.63%)術(shù)后切口邊緣部分壞死，愈合不良，局部分泌物培養(yǎng)陰性，換藥3周而愈。且非PRP組感染復(fù)發(fā)1例(1.75%)、竇道發(fā)生4例(7.02%)、術(shù)后血腫3例(5.26%)；PRP組感染復(fù)發(fā)1例(1.64%)，血腫1例(1.64%)，無(wú)竇道發(fā)生，兩組顯著性檢驗(yàn)結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.1.2 患者ESR和CRP檢測(cè)結(jié)果

PRP組和非PRP組術(shù)前ESR和CRP比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)；兩組術(shù)前、術(shù)后2、3、4周比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)Western Blot檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)結(jié)果

家兔PRP組和對(duì)照組骨缺損處組織PDGF、AP-1和IL-6三種蛋白質(zhì)表達(dá)檢測(cè)結(jié)果可以看出，和對(duì)照組相比，PRP組的AP-1和IL-6三種蛋白質(zhì)表達(dá)水平均明顯升高(圖1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表2)。

表1 PRP組和非PRP組患者術(shù)前、術(shù)后2周、3周、4周CRP和ESR比較Table 1 Comparison of ESR and CRP between PRP group and non-PRP group before and 2，3，4 weeks after the surgery

圖1 PDGF、AP-1和IL-6蛋白在PRP組和對(duì)照組的表達(dá)結(jié)果圖
Figure 1 The expression of PDGF、AP-1 as well as IL-6 protein in PRP group and control group

表2 PDGF、AP-1和IL-6蛋白在PRP組和對(duì)照組的表達(dá)結(jié)果Table 2 The expression of PDGF、AP-1 as well as IL-6 protein in PRP group and control ±s)

3 討論

研究成果表明，與組織創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)的生長(zhǎng)因子有血小板衍生生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及表皮生長(zhǎng)因子等[4，5]，其作用機(jī)制主要是通過(guò)影響肉芽組織的生長(zhǎng)、血管再生、再上皮化，決定組織創(chuàng)傷修復(fù)的速度[6，7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，血小板衍生生長(zhǎng)因子可促進(jìn)骨組織損傷的修復(fù)，然而機(jī)制并不清楚。

炎性反應(yīng)標(biāo)志物是近年研究的一個(gè)方向，以CRP和ESR為代表，其中CRP為重要的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在急性創(chuàng)傷、感染時(shí)血漿中CPR和ESR水平均會(huì)急劇升高，這樣可以影響損傷病灶[8]。

有研究表明[9]，感染組和非感染組患者CRP水平術(shù)后第1、3天有明顯增高趨勢(shì)，第7天則有回落，并以感染組變化更為明顯，表明CRP升高與術(shù)后感染及炎癥程度有關(guān)，且對(duì)判斷臨床術(shù)后感染及炎癥程度有一定意義。王佳[10]、彭麗萍[11]和陳昌博[12]等均得出一致結(jié)論，即CRP、ESR的含量與感染以及炎癥程度呈正相關(guān)。此外，有研究表明，血清中大分子蛋白如CRP和球蛋白等可加快血沉，當(dāng)血清中IL-6含量減少時(shí)，血沉速度自然減緩[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，PRP治療后患者血清中CRP和ESR下降速度較非PRP組快，且術(shù)后傷口感染率、血腫率以及竇道的形成數(shù)目較少，提示PRP可能通過(guò)減少感染以及抗炎作用，導(dǎo)致患者CRP以及ESR值下降，進(jìn)而加快術(shù)后創(chuàng)傷的愈合速度。

PDGF是一種重要的生長(zhǎng)刺激因子，有促進(jìn)新毛細(xì)血管的形成、組織的生長(zhǎng)、修復(fù)再生的作用[13]。研究表明[7，14]，外源性PDGF可以促進(jìn)難愈性皮膚潰瘍損傷創(chuàng)面的愈合，并認(rèn)為高劑量的PDGF可加速上皮移行速率，提早出現(xiàn)肉芽組織、成纖維細(xì)胞以及新生毛細(xì)血管。Kim等[15]研究表明，經(jīng)PRP處理后骨密度增加，由此可知PRP可能促進(jìn)新骨的形成。本研究中家兔經(jīng)PRP處理后骨缺損處PDGF蛋白含量升高，提示PDGF可能是通過(guò)刺激骨缺損處新骨以及新毛細(xì)血管的形成，促進(jìn)骨缺損處的愈合。

AP-1是細(xì)胞內(nèi)的一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子，是由c-Fos和c-Jun組成的異二聚體，它通過(guò)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)多種刺激，包括細(xì)胞因子，生長(zhǎng)因子，細(xì)菌和病毒感染等[13]。研究表明[16，17]，AP-1表達(dá)調(diào)控多種細(xì)胞的生理代謝，包括細(xì)胞分化、增殖和凋亡，且認(rèn)為AP-1表達(dá)升高時(shí)通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)因子的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖。Kido[18]等研究表明，負(fù)荷應(yīng)激下可通過(guò)促進(jìn)FosB AP-1家庭成員的表達(dá)，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)PRP處理后AP-1蛋白表達(dá)升高，可能是通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖，加速骨缺損處組織的愈合。

IL-6是由活化的T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，能使B細(xì)胞前體成熟并產(chǎn)生抗體，與集落刺激因子協(xié)同，能促進(jìn)原始骨髓源細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能[13]。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)PRP處理后骨損傷處組織IL-6表達(dá)水平升高，可能是因?yàn)楦谎“逖獫{制備過(guò)程中沒(méi)有將白細(xì)胞去除，而是保留了全血中絕大部分的淋巴細(xì)胞，還有骨損傷刺激下產(chǎn)生的大量淋巴因子[19]；IL-6升高還有可能與AP-1蛋白表達(dá)升高有關(guān)，AP-1可調(diào)控IL-6的表達(dá)[3]。此外，有研究表明[20，21]，IL-6與TNF-α表達(dá)升高時(shí)均可增強(qiáng)破骨細(xì)胞的破骨功能，加速骨溶解過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)中經(jīng)PRP處理后IL-6表達(dá)升高，說(shuō)明在骨組織損傷之后，機(jī)體可能通過(guò)促進(jìn)AP-1蛋白的表達(dá)，升高IL-6的表達(dá)水平，增強(qiáng)破骨細(xì)胞的活性，加速已損傷骨細(xì)胞的處理過(guò)程，為新骨的形成提供原料。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，血小板源性生長(zhǎng)因子可減少術(shù)后復(fù)發(fā)感染率、血腫以及竇道的形成，促進(jìn)高原脊柱結(jié)核病患者術(shù)后創(chuàng)面愈合，其作用機(jī)制可能通過(guò)升高骨組織損傷處PDGF、AP-1和IL-6三種蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而影響肉芽組織的生長(zhǎng)、血管再生、新骨組織的形成以及損傷骨組織的清除過(guò)程。

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The mechanism study of platelet derived growth factor in the platelet-rich plasma treating spinal tuberculosis in high altitude area※

LI Zhao-wei1，LI Ze-qing1，TANG Bao-ming1，LI Chun-liang3，ZHAO Lei4，YANG Ai-rong△2

(1.Trauma department of orthopedics，Qinghai university affiliated hospital； 2.Qinghai university affiliated hospital； 3.Department of orthopedics，Qinghai Provincial People′s Hospital； 4.Department of preventive medicine；Qinghai University School of Medicine)

Objective By observing the influence of platelet-rich plasma on the treatment of spinal tuberculosis in high altitude area，we sought to test the molecular mechanism of platelet-derived growth factor in the platelet-rich plasma in the treatment of spinal tuberculosis.Methods During 2013/03-2016/03，we enrolled spinal tuberculosis patients in Qinghai University affiliated hospital who were all from Qinghai area.The patients who were under the PRP therapy entered into the PRP group and the rest entered into non-PRP group.Then give them the same treatment postoperatively.Finally，CRP and ESR of each patient in two groups were tested for four weeks.12 rabbits were randomly divided into 2 groups(the experimental group and the control group)，six rabbits in each group.Each rabbit were taken sterile operation to remove vertebral side 1 cm×1 cm bone tissue，rongeur were used to bite it.The bone tissue of PRP group was mixed with PRP which was prepared，implanted it into bone defect of corresponding rabbit；the bone tissue of the control group mixed with same volume of normal saline，implanted it into bone defect of corresponding rabbit；divided in cage raising for 8 weeks.A moderate amount of bone tissue was obtained from the bone lesions，which was firstly placed in liquid nitrogen and then moved to -80 ℃ refrigerator.Western Blot were used to test PDGF，AP-1 and IL- 6 protein level in each group of bone defect tissue.Results All patients of spinal tuberculosis were cured in the PRP group(n=61)and the non-PRP group(n=57)，but the case of infection，hematoma，postoperative recurrence and antrum in PRP group were less than that of the PRP group.There was no significant difference of ESR and CRP value between the PRP group and the non-PRP group preoperatively(P>0.05).The difference of ESR and CRP values had statistical significance(P<0.05)between the PRP group and the non-PRP group after using PRP therapy for 2weeks，3weeks，4 weeks，and the changing speed of ESR and CRP values in PRP group is faster than that of the non-PRP group.12 rabbits have no infection and death after process of model，the changes of PDGF，AP-1 and IL-6 protein expression level in the bone defect tissue of the PRP group and the control group was significantly different(P<0.05)，and those three protein expression levels were significantly increased in PRP group.Conclusions：PDGF may improve PRP treatment of spinal tuberculosis by increasing the expression level of AP-1 and IL-6，to reduce postoperative complications in patients with spinal tuberculosis.

Plateau spinal tuberculosis Platelet-derived growth factor Platelet-rich plasma

※：青海省科技廳自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014-ZJ-761)。Δ：通信作者，教授，Tel：13119762686 李釗偉(1971～)，男，漢族，青海籍，教授

R363.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2017.01.009

2016-10-01