羅云+楊明+李舒宇+游雅麗+張婧+廖正根
[摘要]建立銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量測定方法,探索銀翹散水煎液煎煮過程揮發(fā)性成分的變化規(guī)律,為闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學(xué)內(nèi)涵提供研究基礎(chǔ)。制備不同煎煮時(shí)間銀翹散水煎液,采用GC-MS定性分析其中揮發(fā)性成分的組成并測定薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量,考察不同煎煮時(shí)間對(duì)銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分含量的影響。結(jié)果顯示,銀翹散水煎液中的揮發(fā)性成分主要來源于薄荷、荊芥、連翹3味藥材;隨著煎煮時(shí)間的延長,銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度均先增大后逐漸減??;浸泡30min后,剛煮沸時(shí),煮沸5,10,15,20,30,40,50,60 min時(shí),銀翹散水煎液中薄荷酮的質(zhì)量濃度分別為0.058,0.268,0.216,0.073,0.065,0.048,0.048,0.041,0.038,0.034 mg·L-1,薄荷腦的質(zhì)量濃度分別為0.965,2.847,3.633,2.420,1.539,1.189,1.273,1.188,0.905,0.663 mg·L-1。,胡薄荷酮的質(zhì)量濃度分別為0.355,0.522,0.598,0.477,0.374,0.374,0.339,0.355,0.248,0.251 mg·L-1,3種成分總濃度分別為1.377,3.637,4.446,2.970,1.979,1.611,1.660,1.583,1.191,0.947 mg·L-1。結(jié)果表明,煎煮時(shí)間對(duì)銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分含量影響較大,煮沸約5min時(shí),香氣大出,水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度較大,煮沸15min后,香氣變淡,水煎液中3種揮發(fā)性成分濃度明顯變小,提示銀翹散“香氣大出即取服”傳統(tǒng)煎煮方法具有一定的科學(xué)依據(jù)。
[關(guān)鍵詞]銀翹散;水煎液;揮發(fā)性成分;香氣大出;科學(xué)內(nèi)涵;含量測定
中藥煎煮方法和提取工藝的合理性對(duì)保證中藥的臨床療效至關(guān)重要,提取終點(diǎn)的判斷一直是困擾研究者的技術(shù)難題,尤其對(duì)于含揮發(fā)性組分的解表類中藥。銀翹散為辛涼解表的中醫(yī)經(jīng)典名方,由金銀花、連翹、薄荷、荊芥、牛蒡子、桔梗、淡竹葉、淡豆豉、甘草、蘆根等組成,具有疏風(fēng)解表、清熱解毒功效,用于風(fēng)熱感冒、發(fā)熱頭痛、咳嗽口干、咽喉疼痛。原方作者吳鞠通認(rèn)為“香氣”是銀翹散的主要有效成分之一,長時(shí)間的煎煮可能會(huì)使“香氣”大量揮發(fā),導(dǎo)致臨床療效降低,故特別強(qiáng)調(diào)其煎煮方法為“香氣大出,即取服,勿過煮,肺藥取輕清,過煮則味厚而人中焦矣”。然而,銀翹散類方現(xiàn)代中藥制劑大多需要長時(shí)間煎煮提取,這與其傳統(tǒng)煎煮用藥經(jīng)驗(yàn)相悖而受到較多質(zhì)疑。那么,銀翹散原方所強(qiáng)調(diào)的“香氣大出即取服”科學(xué)內(nèi)涵何在?如何將其傳統(tǒng)煎煮方法轉(zhuǎn)化用于類方制劑的提取工藝?這些均是當(dāng)前亟待解決的關(guān)鍵問題。
銀翹散為煮散劑,臨床服用其水煎液,水煎液中香氣和非香氣成分的濃度變化對(duì)臨床療效均有較大的影響。因此,研究銀翹散水煎液在煎煮過程中化學(xué)成分的變化規(guī)律,可為闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學(xué)內(nèi)涵和合理制定銀翹散煎煮工藝提供科學(xué)依據(jù)。根據(jù)菲克擴(kuò)散理論,揮發(fā)性組分蒸發(fā)速度與濃度成正比,藥液中揮發(fā)性組分濃度越大,揮發(fā)性組分蒸發(fā)速度越大,故推測“香氣大出”之時(shí),藥液中“香氣”的濃度也最大,但目前尚未有相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)這一假說。
“香氣”主要是指揮發(fā)性成分,銀翹散中含有“香氣”的藥材主要有薄荷、荊芥、連翹、金銀花等,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮是薄荷、荊芥等揮發(fā)油中的主要成分。本研究在前期研究了銀翹散煎煮過程水煎液化學(xué)特征圖譜和5種非揮發(fā)性成分含量變化規(guī)律以及3種揮發(fā)性成分蒸發(fā)規(guī)律的基礎(chǔ)上,建立GC-MS測定銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量測定方法,研究不同煎煮時(shí)間銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的變化規(guī)律,為闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學(xué)內(nèi)涵提供研究基礎(chǔ)。
1材料
Agilent 7890A氣相色譜儀-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司);BT25S電子分析天平(1/10萬),BSAl24S電子分析天平(1/1萬)(德國Sartofi-us公司);MH-2000型可調(diào)式電熱套(北京科偉永興儀器有限公司);JK-5200型超聲波清洗器(功率200w,頻率40kHz,合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)。
薄荷酮對(duì)照品(批號(hào)111705-201105,純度為99.8%)、薄荷腦對(duì)照品(批號(hào)110728-00506,純度為100.0%)、胡薄荷酮對(duì)照品(批號(hào)111706.201205,純度為99.8%)購自中國食品藥品檢定研究院;銀翹散(自制,批號(hào)151125),高純氦氣(江西省南昌市宏偉氣體有限公司);水為雙蒸餾水;其他試劑均為分析純。
2方法與結(jié)果
2.1GC-MS分析條件
2.1.1色譜條件HP-5MS石英毛細(xì)管柱(0.25μmx0.25mmx30m);載氣為高純度氦氣;體積流量1.0mL·min-1;進(jìn)樣量1.0μL;模式為不分流;進(jìn)樣口溫度250℃;接口溫度280℃;程序升溫:50℃保持2min,以2℃·min-1。升至80℃,再以3℃·min-1升至180℃。
2.1.2質(zhì)譜條件EI電離源;電子能量70 eV;離子源溫度230℃;四級(jí)桿溫度150℃;掃描范圍m/z35~500。
2.2對(duì)照品溶液的制備
2.2.1薄荷酮對(duì)照品溶液的制備精密稱取薄荷酮對(duì)照品7.35mg,置10mL量瓶中,加入乙醚使溶解,并定容至刻度,搖勻,即得每1 mL含薄荷腦0.735mg對(duì)照品溶液。
2.2.2薄荷腦對(duì)照品溶液的制備精密稱取薄荷腦對(duì)照品4.76mg,置10mL量瓶中,加入乙醚使溶解,并定容至刻度,搖勻,即得每1mL含薄荷腦0.476mg對(duì)照品溶液。
2.2.3胡薄荷酮對(duì)照品溶液的制備精密稱取胡薄荷酮對(duì)照品15.37mg,置10mL量瓶中,加入乙醚使溶解,并定容至刻度,搖勻,即得每1mL含薄荷腦1.537mg對(duì)照品溶液。
2.2.4混合對(duì)照品溶液的制備取薄荷酮對(duì)照品溶液0.4mL,薄荷腦對(duì)照品溶液3.2mL,胡薄荷酮對(duì)照品溶液0.4mL,混勻,即得混合對(duì)照品溶液,再用乙醚等比稀釋制成不同濃度的混合對(duì)照品溶液,備用。
2.3不同煎煮時(shí)間銀翹散水煎液樣品的制備
按照《中國藥典》2015年版一部銀翹散的處方和制法,稱取金銀花100g、連翹100g、桔梗60g、薄荷60g、淡豆豉50g、淡竹葉40g、牛蒡子60g、荊芥40g、蘆根100g、甘草40g,粉碎成細(xì)粉,過篩,混勻,制成銀翹散。稱取銀翹散110.0g,置2000mL燒瓶中,加入1100mL(10倍量)水,浸泡30min后取樣10mL(S1),加熱提取,約20min后開始沸騰,立即取樣10mL(S2),繼續(xù)加熱,于煮沸后5min(S3),10min(S4),15min(S5),20min(S6),30min(S7),40min(S8),50min(S9),60min(S10)分別取樣10mL,放冷,加乙醚5mL振搖萃取,即得。
2.4銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的定性分析
銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的GC-MS總離子流色譜圖見圖1。經(jīng)計(jì)算機(jī)貯存信號(hào)的檢索及質(zhì)譜圖進(jìn)行解析確定化合物,對(duì)GC-MS總離子流色譜圖進(jìn)行了初步指認(rèn),去除可能為乙醚溶劑中的抗氧劑2,6.二叔丁基對(duì)甲苯酚(BHT,tR=37.14min),采用峰面積歸一化法測定各成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù),共確定色譜峰19個(gè),其中相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1.5%的色譜峰13個(gè),占93.29%。結(jié)合單味藥材揮發(fā)油的色譜圖和質(zhì)譜圖,初步確定了銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分的來源,見表1。其中,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮3個(gè)指標(biāo)成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)較大,分別為1.89%,20.53%,3.27%,可以較好地反映銀翹散水煎液揮發(fā)性成分的變化規(guī)律,故選擇其作為指標(biāo)成分。
2.5分析方法驗(yàn)證
2.5.1系統(tǒng)適用性試驗(yàn)按2.1項(xiàng)下分析條件進(jìn)行檢測,以薄荷腦計(jì)算理論塔板數(shù)大于3000,分離度大于1.5?;旌蠈?duì)照品溶液、銀翹散供試品溶液的色譜圖見圖1。結(jié)果表明,在上述色譜條件下,各所測成分分離度良好。
2.5.2線性關(guān)系考察取不同濃度的混合對(duì)照品溶液,按上述色譜條件進(jìn)樣1μL,記錄色譜峰面積,以進(jìn)樣量x(μg)為橫坐標(biāo),峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并擬合回歸方程,分別為薄荷酮:Y=2953548317X-173781,r=0.999 5;薄荷腦:Y=3064262418X-989 782,r=0.9991;胡薄荷酮:Y,=2839280 785X7-67 237,r=0.9997。結(jié)果表明,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮分別在0.0718~2.30,0.186~11.9,0.150~19.2ng線性關(guān)系良好。2.5.3精密度試驗(yàn)精密吸取混合對(duì)照品溶液1μL,重復(fù)進(jìn)樣6次,測定峰面積積分值,結(jié)果薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為1.6%,0.93%,0.59%,表明儀器的精密度良好。
2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液1μL,進(jìn)樣測定峰面積,每4h測定1次,結(jié)果薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮峰面積的RSD分別為1.6%,1.1%,1.2%(n=7),表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。
2.5.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一銀翹散水煎液6份,按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,精密吸取1μL,注入氣相色譜儀,測得薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的平均濃度為0.216,3.633,0.598mg·L-1,RSD分別為0.64%,0.95%,1.3%,表明方法的重復(fù)性良好。
2.5.6加樣回收試驗(yàn)取同一已知含量的銀翹散水煎液6份,按照100%樣品含量精密加入薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮對(duì)照品溶液,混勻,按2.3項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,進(jìn)樣1μL,測定峰面積,計(jì)算回收率,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的平均回收率為96.9%,98.4%,97.7%,RSD分別為1.6%,1.8%,2.3%,結(jié)果表明加樣回收率良好,方法可行。
2.5.7不同煎煮時(shí)間銀翹散水煎液中薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的含量測定取不同煎煮時(shí)間所得銀翹散水煎液樣品,按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定,每份進(jìn)樣2次,以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的平均含量,結(jié)果見表2。
由表2可見,隨著煎煮時(shí)間的延長,水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度均先增大后逐漸減小。浸泡30min后,銀翹散3種揮發(fā)性成分均有不同程度的溶出,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮分別達(dá)到最大濃度的21.6%,26.6%,59.3%,此時(shí)香氣較淡,揮發(fā)性成分并沒有大量揮發(fā);剛煮沸時(shí),薄荷酮的濃度達(dá)到最大值,薄荷腦、胡薄荷酮分別達(dá)到最大濃度的78.4%,87.3%,香氣漸濃,揮發(fā)性成分開始揮發(fā);煮沸5min時(shí),水煎液中薄荷酮的濃度下降至最大濃度的80.4%,而薄荷腦、胡薄荷酮濃度以及3種成分總濃度均達(dá)到最大;此時(shí)通過嗅覺判斷香氣也最濃,提示揮發(fā)性成分蒸發(fā)速度達(dá)到最大;煮沸10min時(shí),薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的濃度分別下降至最大濃度的27.1%,66.6%,79.7%;煮沸15min時(shí),香氣變淡,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的濃度分別下降至最大濃度的24.3%,42.4%,62.6%,3種成分總濃度降至最大濃度的44.5%,提示揮發(fā)性成分已大量蒸發(fā)散失;至煮沸60min時(shí),薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的濃度分別下降至最大濃度的12.6%,18.2%,41.9%,3種成分總濃度降至最大濃度的21.3%,提示揮發(fā)性成分已蒸發(fā)殆盡。
結(jié)果表明,隨著煎煮時(shí)間的延長,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮溶出越來越多,到煮沸5min時(shí),香氣大出,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮大量溶出并揮發(fā),水煎液中濃度達(dá)到最大;隨著煎煮時(shí)間的再延長,薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮大量揮發(fā)散失,至煮沸15min時(shí),香氣變淡,銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分總濃度降至最大濃度的45%以下??梢姡逯髸r(shí)間對(duì)銀翹散水煎液中揮發(fā)性成分含量影響較大,煮沸5min時(shí),香氣大出,水煎液中揮發(fā)性成分的濃度最大,銀翹散“香氣大出即取服”傳統(tǒng)煎煮方法具有一定的科學(xué)依據(jù)。
3討論
金銀花、連翹、薄荷、荊芥等含揮發(fā)性成分的藥材,煎煮時(shí)有效成分易揮發(fā),入藥宜后下,不宜久煎。銀翹散為煮散劑,用的是經(jīng)過粉碎后的藥材飲片,與原藥材飲片相比,粒度更小,擴(kuò)散面積增大,溶出速度加快,溶出物質(zhì)增加,縮短了煎煮時(shí)間,能較好地保留揮發(fā)性成分,有利于提高藥材的利用率和療效。本研究結(jié)果顯示,在同時(shí)入藥的情況下,銀翹散不經(jīng)煎煮,浸泡30min后,揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮均有一定程度的溶出,此時(shí)香氣較淡,揮發(fā)性成分并沒有大量揮發(fā);隨著煎煮時(shí)間的延長,3種揮發(fā)性成分溶出越來越多,到煮沸5min時(shí),香氣大出,3種揮發(fā)性成分大量溶出并揮發(fā),水煎液中濃度也達(dá)到最大;隨著煎煮時(shí)間的再延長,3種揮發(fā)性成分大量揮發(fā)散失,至煮沸15min時(shí),銀翹散水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度已降至最大濃度的44.5%,香氣變淡,提示揮發(fā)性成分已大量蒸發(fā)散失。結(jié)果表明,銀翹散作為煮散劑,在保證揮發(fā)性成分大量溶出的情況下,縮短了煎煮時(shí)間,較好地保留了揮發(fā)性有效成分,有利于提高藥材的利用率和臨床療效。
“香氣大出”是指煎煮藥味最濃郁時(shí),是提取終點(diǎn)的嗅覺判斷標(biāo)準(zhǔn),有人認(rèn)為以煮沸20min為宜,也有人認(rèn)為煮沸10~15min為好,還有人認(rèn)為煮沸3~5min最佳。劉亞嫻等以銀翹散為主方治療小兒外感高熱125例,以急性上呼吸道感染最多(95例),煎煮時(shí)間為煮沸后3min即可,一般1~2d即可退熱,并進(jìn)行了免疫調(diào)節(jié)和解熱等相關(guān)藥理實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明,煮沸3~6min,銀翹散的作用最強(qiáng)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn),銀翹散煮沸約5min時(shí),香氣大出,水煎液中5種非揮發(fā)性成分綠原酸、連翹苷、牛蒡苷、甘草苷、甘草酸的濃度均較大,3種揮發(fā)性成分薄荷酮、薄荷腦、胡薄荷酮的蒸發(fā)速度也達(dá)到最大。本研究結(jié)果表明,銀翹散煮沸約5min時(shí),水煎液中3種揮發(fā)性成分的濃度也較大,驗(yàn)證了“香氣大出”之時(shí),水煎液中“香氣”的濃度也最大的推測。研究結(jié)果還表明,銀翹散煮沸約5min時(shí),香氣大出,水煎液中揮發(fā)性成分的濃度較大,蒸發(fā)速度也較大,同時(shí)非揮發(fā)性成分濃度也較大,提示銀翹散“香氣大出即取服”傳統(tǒng)煎煮方法具有一定的科學(xué)依據(jù)。
關(guān)于銀翹散的煎煮方法,還有很多文獻(xiàn)從不同角度進(jìn)行了研究,主要集中在藥效和化學(xué)成分2個(gè)方面。束雅春等以綠原酸、蘆丁、橙皮苷、連翹苷、牛蒡苷5種成分及浸出物含量為指標(biāo),通過單因素考察確定了適宜工藝水平后,采用正交試驗(yàn)優(yōu)選銀翹散傳統(tǒng)煎煮最佳工藝,為規(guī)范臨床中藥湯劑煎煮方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù);同時(shí),通過比較銀翹散在不同煎煮方式下對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗炎解熱作用的影響,探討最佳煎煮方式,結(jié)果表明,傳統(tǒng)砂鍋煎煮藥效優(yōu)于常壓煎藥機(jī)和高壓煎藥機(jī)煎煮,這與5種藥效成分與浸出物含量測定結(jié)果一致,為準(zhǔn)確合理地使用銀翹散湯劑最佳煎煮方式、發(fā)揮最佳臨床療效提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。采用傳統(tǒng)砂鍋煎藥,具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、傳熱快、導(dǎo)熱均勻、散熱慢、火候大小可隨意調(diào)節(jié)、水分蒸發(fā)量小等特點(diǎn)。由于實(shí)驗(yàn)室條件的限制,本研究采用可調(diào)溫電熱套加熱玻璃燒瓶替代傳統(tǒng)砂鍋煎藥方式,玻璃燒瓶化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、傳熱快,可調(diào)溫電熱套導(dǎo)熱均勻、散熱慢,且火候大小可隨意調(diào)節(jié),先大功率煮沸,再調(diào)小加熱功率,保持微沸,水分蒸發(fā)量小,兩者聯(lián)合使用可較好地模擬傳統(tǒng)的砂鍋煎煮。
此外,銀翹散揮發(fā)性成分的組成和香味的構(gòu)成均極為復(fù)雜,低含量成分可能對(duì)香氣的貢獻(xiàn)值較大,由于實(shí)驗(yàn)條件的局限,本研究僅以其中的3種指標(biāo)性成分薄荷酮、薄荷腦和胡薄荷酮含量變化來表征香氣濃淡變化尚有不足之處,有待進(jìn)一步完善,筆者將采用電子鼻等技術(shù)手段量化香氣,為進(jìn)一步闡明銀翹散“香氣大出即取服”的科學(xué)內(nèi)涵提供科學(xué)依據(jù)。