細胞間粘附分子5對抗阿糖胞苷抑制分析

楊和平　張貴強　謝榮漢

【摘要】目的 分析細胞間粘附分子5（ICAM-5）對抗阿糖胞苷的抑制作用。方法 將轉(zhuǎn)染ICAM-5基因的PAJU-TLN細胞株與轉(zhuǎn)染空載體的PAJU-NEO細胞株分別添加阿糖胞苷培養(yǎng)，并于24 h、48 h與72 h時觀察兩組細胞株的形態(tài)變化、存活率與凋亡率。結(jié)果 兩組細胞株均受到阿糖胞苷一定程度的抑制，與PAJU-NEO細胞株相比，PAJU-TLN細胞在72 h受到阿糖胞苷抑制的形態(tài)損害較輕，24 h、48 h、72 h的存活率明顯高于PAJU-NEO細胞株組，且凋亡率低于PAJU-NEO細胞株組。結(jié)論 ICAM-5在PAJU細胞表達后具有對抗阿糖胞苷抑制的作用，其能減輕細胞毒性，減少細胞凋亡，能夠保護和營養(yǎng)神經(jīng)。

【關(guān)鍵詞】粘附分子5；PAJU細胞；阿糖胞苷；保護作用

【中圖分類號】R733.72 【文獻標(biāo)識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2016.30.0.02

細胞間粘附分子5（Intercellular adhesion molecule-5，ICAM-5）是指參與細胞與細胞之間及細胞與細胞外基質(zhì)之間相互作用的分子之一，是一種表達于神經(jīng)元的糖蛋白，因其特異性地表達于端腦內(nèi)，故又被稱作端腦素[1]。臨床研究認為，ICAM-5具有促進神經(jīng)元生長、營養(yǎng)神經(jīng)、抗神經(jīng)元凋亡的作用，可以對抗神經(jīng)系統(tǒng)的毒性損害[2]。而阿糖胞苷（arabinocytidine，Ara-C）是一種作用于細胞S增殖期的嘧啶類抗代謝藥物，可通過抑制細胞的DNA合成，來干擾細胞的增殖，臨床多將該藥應(yīng)用于急性白血病的治療中[3]。但Ara-C對神經(jīng)元有一定的毒副作用，可能會誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡，從而影響患者的智力。因此，臨床亟需采取有效措施來解決這一問題。鑒于ICAM-5具具有神經(jīng)元保護作用，本文就分析ICAM-5具對抗阿糖胞苷抑制的機制，現(xiàn)作如下

報道。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）基本器械設(shè)備：無菌操作室、凈化臺、倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡倒置相差光學(xué)顯微鏡（TS100）、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、水純化系統(tǒng)、離心管、培養(yǎng)板、移液管及其他小器械（2）試劑：阿糖胞苷、胎牛血清、青/鏈霉素溶液（100×）、胰蛋白酶、L-谷氨酰胺（200 mmol/L）、DMEM/F12（體積比1：1）、HEPES（1 mmol/L）、二甲基亞砜、MTT、Hoechst、羊抗人ICAM-5多克隆抗體及兔抗羊異硫氰酸熒光素等；（3）細胞株：人ICAM-5常表達的人源性神經(jīng)母細胞瘤細胞株P(guān)AJU細胞（PAJU-TLN）、無ICAM-5表達且轉(zhuǎn)染空載體的人源性神經(jīng)母細胞瘤細胞株P(guān)AJU細胞（PAJU-NEO）。

1.2 方法

（1）細胞維持培養(yǎng)：將PAJU-TLN與PAJU-NEO均置于全培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)，全培養(yǎng)基由青/鏈霉素溶液、HEPES、胎牛血清、L-谷氨酰胺、DMEM等試劑融合而成，PH值為7.3。將上述兩組細胞株置入全培養(yǎng)基中，并在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔3～5d更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗操作。

（2）建立抑制細胞增殖模式：根據(jù)操作標(biāo)準(zhǔn)配制抑制培養(yǎng)試劑，以0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后，將其置于4℃下避光保存。將備用的阿糖胞苷加入抑制培養(yǎng)液中并作最后配制。將對數(shù)生長期的PAJU-TLN和PAJU-NEO細胞株以胰蛋白酶消化后，將細胞密度調(diào)整至105個/mL。將細胞接種于準(zhǔn)備好的無菌24孔板中，以兩株細胞的維持培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h觀察細胞貼壁及生長情況。分別選取PAJU-TLN與PAJU-NEO中生長良好的復(fù)孔3個，均加入含有阿糖胞苷的抑制培養(yǎng)液培養(yǎng)，連續(xù)觀察到72 h時細胞株死亡為實驗終點。分別取24 h、48 h、72 h三個時間段，在倒置相差顯微鏡下觀察PAJU-TLN與PAJU-NEO細胞株的存活情況。然后棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，以PBS快速洗一遍，加入4%的多聚甲醛固定15～20 min，接著棄去多聚甲醛，再以PBS洗一遍。加入PBST滲透10 min，PBS振洗3次，以5%的BSA封閉30 min。加入羊抗人ICAM-5多克隆抗體，在濕盒37℃感作30 min后，于避光下加入綠色熒光標(biāo)記的兔抗羊異硫氰酸熒光素，在濕盒37℃感作40 min，繼續(xù)避光，于熒光顯微鏡下觀察并照相存檔。

（3）細胞活性測：以105/孔的密度將PAJU-TLN與PAJU-NEO分別接種于96孔板中，分別在加有阿糖胞苷的抑制培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h三個時間段后，各孔分別加入MTT（sigma）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后吸棄培養(yǎng)液，以二甲基亞砜溶解后，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測吸光度值。

（4）細胞核凋亡率檢測：將對數(shù)生長期PAJU-TLN與PAJU-NEO細胞以104密度接種于24孔板中，分別在加阿糖胞苷的抑制培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h定時取出，以PBS洗一遍。用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS振洗2次。以1mg/mL的Hoechst 33258（Sigma）避光染色15 min，封片后繼續(xù)避光，于熒光顯微鏡下觀察拍照，并計算細胞核的凋亡比例。

2 結(jié) 果

2.1 細胞形態(tài)

未添加阿糖胞苷時，PAJU-TLN與PAJU-NEO兩組細胞株在形態(tài)上無明顯差異；添加阿糖胞苷后，隨著時間不斷延長兩組細胞株形態(tài)也在不斷變化（見表1）。至抑制培養(yǎng)72 h，通過更換培養(yǎng)液PAJU-TLN細胞株可重新增殖傳代，而PAJU-NEO細胞株全部消亡，無法復(fù)活。

2.2 細胞存活率與凋亡率

未添加阿糖胞苷時，兩組細胞自然生存率基本一致；添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN組細胞24 h、48 h、72 h存活率明顯大于PAJU-NEO組細胞。

正常培養(yǎng)條件下，經(jīng)過Hoechst 33258細胞核染色，絕大多數(shù)細胞核呈彌散均勻的藍色熒光。添加阿糖胞苷前，兩組細胞凋亡率基本一致。添加阿糖胞苷后，PAJU-TLN組細胞24 h、48 h、72 h凋亡率明顯小于PAJU-NEO組細胞。

3 討 論

目前，臨床雖認為ICAM-5具有營養(yǎng)神經(jīng)、抗神經(jīng)元凋亡的作用，但對其抵抗阿糖胞苷抑制作用尚未見資料報道。文章便以ICAM-5對抗阿糖胞苷抑制為論點，進行試驗分析與論述。通過本次實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染空載體的PAJU-NEO細胞株在使用阿糖胞苷后，細胞形態(tài)明顯改變，72 h后細胞幾乎全部死亡；而轉(zhuǎn)染ICAM-5基因的PAJU-TLN細胞株使用阿糖胞苷后，72 h內(nèi)形態(tài)損害較輕，雖出現(xiàn)細胞凋亡，但72 h仍有一半左右的細胞株存活，且可能繼續(xù)增殖傳代。由此認為，ICAM-5確有抵抗阿糖胞苷毒性，對PAJU細胞進行內(nèi)源性保護和營養(yǎng)神經(jīng)作用。

參考文獻

[1] 楊和平，彭 熠，楊力強，等.端腦素在缺氧環(huán)境中對PAJU細胞的保護作用[J].中國科技信息，2010，10（10）217-219.

[2] 宋琳衍.癌胚抗原相關(guān)細胞粘附分子5、6在膀胱尿路上皮癌組織中的表達及意義[J].中國老年學(xué)雜志，2013，11（33）：5595-5596.

[3] 劉海龍，曲彥明，黃鉑淵，等.葉酸受體介導(dǎo)的阿糖胞苷抑制髓母細胞瘤增殖并促其凋亡的體外實驗研究[J].中華神經(jīng)外科雜志，2015，31（5）：514-518.

本文編輯：劉帥帥