羽裂報(bào)春苣苔的組織培養(yǎng)研究

閆海霞 關(guān)世凱 黃昌艷 鄧杰玲 何荊洲 張自斌 卜朝陽(yáng)

摘 要 以羽裂報(bào)春苣苔的葉片為外植體，通過(guò)研究不同滅菌方法、不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度對(duì)組織培養(yǎng)的影響，建立了羽裂報(bào)春苣苔的組織培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：羽裂報(bào)春苣苔適宜的外植體滅菌方法為采用75%酒精滅菌20 s，無(wú)菌水沖洗3次；然后用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次；再用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，成活率為55.40%。不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)100.00%。在適宜的增殖培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L上，增殖系數(shù)高達(dá)8.61；在生根培養(yǎng)基MS+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.1 g/L上，生根率達(dá)100.00%，生根時(shí)間為19.10 d。移栽基質(zhì)為泥炭 ∶ 珍珠巖 ∶ 河沙=4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V），移栽成活率為99.60%。

關(guān)鍵詞 羽裂報(bào)春苣苔；組織培養(yǎng)；二次滅菌；活性炭

中圖分類(lèi)號(hào) Q949.778.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Tissue Culture of Primulina pinnatifida

YAN Haixia， GUAN Shikai， HUANG Changyan， DENG Jieling，

HE Jingzhou， ZHANG Zibin， BU Zhaoyang*

Flower Research Institute， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning， Guangxi 530007， China

Abstract With the leaves of Primulina pinnatifida as the explants， the tissue culture technique system of P. pinnatifida was studied based on the effects of sterilization methods， plant growth regulator types and concentrations. The results showed that the suitable method for the sterilization of the explants was the leaves were sterilized in 75% alcohol for 20 seconds， then soaked in 0.1% HgCl2 for 6 minutes， and soaked in 0.1% HgCl2 for another 6 minutes. The survival rate of the explants was 55.40%. The suitable culture medium for adventitious bud induction was MS+6-BA 1.0-2.0 mg/L+NAA 0.01-0.1 mg/L， the most suitable culture medium for adventitious bud multiplication was MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+activated carbon 0.1 g/L， and the multiplication coefficient was 8.61. The optimum culture medium for rooting culture was MS+IBA 0.5 mg/L+activated carbon 0.1 g/L， and the rooting rate was 100%. For the cultivation， the suitable ratio of transplanting medium of the in vitro plantlets was peat ∶ perlite ∶ sand 4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V）， and the survival rate of transplanting of the in vitro plantlets reached 99.60%.

Key words Primulina pinnatifida； tissue culture； secondary sterilization； activated carbon

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.015

羽裂報(bào)春苣苔（Primulina pinnatifida）屬苦苣苔科報(bào)春苣苔屬的多年生草本植物[1]，中國(guó)是該種的分布中心，主要分布點(diǎn)為廣西、廣東北部、貴州東南部、湖南南部、江西、福建西部、浙江南部和西部。羽裂報(bào)春苣苔畏熱，忌陽(yáng)光直射，需要較高的空氣濕度和土壤濕度，因此常見(jiàn)于海拔600～1 500 m的谷林中石上或溪邊。全草可供藥用，用于治療跌打損傷等癥；此外，還具有極高的觀賞價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

目前有關(guān)羽裂報(bào)春苣苔的研究極少，僅在資源調(diào)查中有涉及[2-3]。羽裂報(bào)春苣苔可以采用種子繁殖或葉片扦插，但種子細(xì)小，采收及播種較繁瑣，且繁殖速度慢，系數(shù)小。而組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖周期短、繁殖系數(shù)大，后代整齊一致，并且能保持母本的優(yōu)良性狀，已被廣泛應(yīng)用于該屬的其他植物上[4-14]，但未見(jiàn)關(guān)于羽裂報(bào)春苣苔組織培養(yǎng)的報(bào)道。本研究以羽裂報(bào)春苣苔的葉片為外植體，對(duì)其開(kāi)展組織培養(yǎng)技術(shù)研究，擬建立其組織培養(yǎng)快速繁殖體系，以便生產(chǎn)大量的種苗應(yīng)用于生產(chǎn)和資源保護(hù)。

1 材料與方法

1.1 材料

羽裂報(bào)春苣苔來(lái)自廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所。

1.2 方法

1.2.1 外植體的消毒滅菌 2016年3～4月份，取羽裂報(bào)春苣苔的葉片，用洗衣粉溶液浸泡25～30 min后在流水下沖洗干凈（30 min），并用軟毛刷輕輕刷洗葉片；然后轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)；先用棉球蘸取75%酒精拭擦葉片表面，無(wú)菌水沖洗3次，將葉片按照表1的滅菌方法進(jìn)行滅菌，每種滅菌劑滅菌后均要用無(wú)菌水沖洗3次，使用0.1%升汞滅菌過(guò)程中要輕輕震蕩使升汞充分接觸葉片；將葉片切成3 cm×3 cm大小，接入MS培養(yǎng)基，每種滅菌方法處理數(shù)量為50個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3次，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照時(shí)間為每天14～16 h，下同。連續(xù)15 d觀察污染、成活情況，并統(tǒng)計(jì)、計(jì)算污染率、成活率：

污染率/%=污染數(shù)/接種數(shù)×100；

成活率/%=未污染的成活數(shù)/接種數(shù)×100。

1.2.2 初代培養(yǎng) 將已成活的葉片切成1.5 cm×1.5 cm大小，接入初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種數(shù)量為50個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3次；培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計(jì)發(fā)生不定芽的葉片數(shù)量，并計(jì)算誘導(dǎo)率。

誘導(dǎo)率/%=葉片發(fā)生不定芽的數(shù)量/接種數(shù)×100。

1.2.3 增殖培養(yǎng) 將具有2片以上葉片的不定芽切取下來(lái)，接入增殖培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種數(shù)量為50個(gè)，每個(gè)處理重復(fù)3次；培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)新芽數(shù)量，并計(jì)算增殖系數(shù)。

增殖系數(shù)=產(chǎn)生新芽數(shù)/接種數(shù)。

1.2.4 生根培養(yǎng) 將增殖培養(yǎng)獲得的具有3～4片葉的組培芽，接種在不同的生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種數(shù)量為50個(gè)，重復(fù)3次；培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)生根的植株數(shù)以及生長(zhǎng)情況，并計(jì)算生根率。

生根率/%=生根植株數(shù)/接種數(shù)×100。

1.2.5 煉苗移栽 將組培苗移出培養(yǎng)室后在自然條件下煉苗4～5 d；洗凈培養(yǎng)基移栽到不同的基質(zhì)上，每種基質(zhì)移栽數(shù)量為50株，每個(gè)處理重復(fù)3次，澆透定根水后，將移栽小苗置于有遮陽(yáng)網(wǎng)的蔭棚下，透光率為40%～50%；采用間歇性噴霧系統(tǒng)控制空氣相對(duì)濕度，每2 h噴霧1次，噴霧時(shí)間每次40 s，確?？諝庀鄬?duì)濕度在85%以上，早晚分別澆透水1次；移栽后7～10 d即可成活，成活率達(dá)100%。培養(yǎng)20 d后，統(tǒng)計(jì)成活的植株數(shù)以及生長(zhǎng)情況，并計(jì)算移栽成活率。

移栽成活率/%=移栽成活植株數(shù)/移栽數(shù)×100。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)（Duncan′s多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體的消毒滅菌

由表2可看出，L3的污染率顯著低于L1，其成活率顯著高于L1；L6的污染率顯著低于L4，其成活率顯著高于L4；L9的污染率和成活率均顯著低于L7；L2的污染率顯著高于L3，其成活率顯著低于L3；L5、L6的污染率無(wú)顯著差異，但L5的成活率顯著高于L6；L8的污染率和成活率顯著高于L9。由此表明，采用升汞一次滅菌時(shí)，當(dāng)酒精滅菌時(shí)間為10～20 s時(shí)，隨著升汞滅菌時(shí)間的增加，污染率顯著下降，成活率顯著上升；當(dāng)酒精滅菌時(shí)間為30 s時(shí)，污染率和成活率均顯著下降。采用升汞二次滅菌時(shí)，當(dāng)酒精滅菌時(shí)間為20～30 s時(shí)，二次滅菌的成活率顯著上升。由此可知，羽裂報(bào)春苣苔的外植體宜采用升汞二次滅菌法，即先用75%酒精滅菌20 s，無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，成活率為55.40%。

2.2 初代培養(yǎng)

由表3可知，9個(gè)處理之間的誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異，均為100.00%，而每個(gè)處理的誘導(dǎo)時(shí)間卻有所不同。Y1的誘導(dǎo)時(shí)間顯著高于其余處理；Y2、Y3、Y4、Y5的誘導(dǎo)時(shí)間顯著高于Y6、Y7、Y8、Y9的誘導(dǎo)時(shí)間，而Y2、Y3、Y4、Y5之間的誘導(dǎo)時(shí)間無(wú)顯著差異；Y6、Y8、Y9之間的誘導(dǎo)時(shí)間無(wú)顯著差異。上述結(jié)果表明，附加了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度的培養(yǎng)基對(duì)不定芽的誘導(dǎo)率影響不大，但對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間有影響?？梢?jiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑不是羽裂報(bào)春苣苔不定芽誘導(dǎo)的必要因素，但卻決定著不定芽誘導(dǎo)時(shí)間的長(zhǎng)短，一定濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）有利于縮短誘導(dǎo)時(shí)間。在培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L上，不定芽誘導(dǎo)率為100.00%，長(zhǎng)勢(shì)良好，培養(yǎng)時(shí)間為20.30～24.50 d（圖1、圖2）。

2.3 增殖培養(yǎng)

由表4可看出，J1、J2、J3的增殖系數(shù)存在顯著差異，其中，J3的增殖系數(shù)顯著高于J1、J2，為8.61；J6的增殖系數(shù)顯著低于J4、J5；J7的增殖系數(shù)顯著低于J8、J9；J3、J6、J9的增殖系數(shù)存在顯著差異。由此表明，在含有0.1 mg/L活性炭的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加而顯著增加；在含有0.5 mg/L活性炭的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)隨6-BA濃度的增加先上升后下降，增加趨勢(shì)不明顯但下降較顯著；當(dāng)活性炭含量為1.0 mg/L時(shí)，增殖系數(shù)的增加趨勢(shì)逐漸不顯著；在含有2.0 mg/L 6-BA的培養(yǎng)基上，增殖系數(shù)隨活性炭含量的增加有顯著變化，呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢(shì)，但仍以活性炭為0.1 mg/L的增殖系數(shù)最高?？梢?jiàn)，不同的6-BA濃度以及活性炭含量，對(duì)羽裂報(bào)春苣苔不定芽增殖的影響無(wú)明顯的規(guī)律性，但在培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L上，其增殖系數(shù)最高，為8.61，植株長(zhǎng)勢(shì)好且健壯，是適宜的增殖培養(yǎng)基（圖3、圖4）。

2.4 生根培養(yǎng)

從表5可知，S2、S3、S4的生根率顯著高于其他處理，均為100.00%；S8的生根率顯著高于S5、S6、S7，為92.20%；S5的生根率顯著低于其他處理，為79.00%，且其生根時(shí)間最長(zhǎng)，為29.90 d；S2、S3、S4的生根時(shí)間顯著低于其他處理，其中S3的生根時(shí)間最短，為19.10 d。由此可知，添加了吲哚丁酸（IBA）的培養(yǎng)基有利于植株的生根，同時(shí)有利于縮短生根的時(shí)間。綜上可知，羽裂報(bào)春苣苔的最佳生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.1 g/L，生根率達(dá)100.00%，生根時(shí)間需要19.10 d，植株長(zhǎng)勢(shì)好且健壯，根多（圖5）。

2.5 煉苗移栽

由表6可看出，不同的移栽基質(zhì)，對(duì)羽裂報(bào)春苣苔的成活率有不同的影響。基質(zhì)M3的成活率顯著高于其他基質(zhì)，為99.60%，且小苗長(zhǎng)勢(shì)好，植株健壯；基質(zhì)M1的成活率顯著低于其他基質(zhì)，為88.60%，小苗長(zhǎng)勢(shì)差，植株細(xì)弱。結(jié)果表明，單一使用泥炭，或者將泥炭與珍珠巖或河沙進(jìn)行混合不利于植株的移栽，而將泥炭、珍珠巖、河沙混合使用，成活率可達(dá)99.60%。綜上可知，羽裂報(bào)春苣苔的適宜移栽基質(zhì)為M3，泥炭 ∶ 珍珠巖 ∶ 河沙=4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V），植株長(zhǎng)勢(shì)好且健壯（圖6）。

3 討論

羽裂報(bào)春苣苔沒(méi)有明顯的地上莖，選取莖段做外植體對(duì)母株的傷害極大；花梗也可作為適宜的外植體，但花梗在花期才能取用，取材時(shí)間受到了限制；此外，植物帶苞片的花蕾也能作為外植體進(jìn)行組培快繁[13]，但同樣存在取材時(shí)間受限的問(wèn)題。綜上考慮可知，葉片取材不受時(shí)間、季節(jié)的限制，對(duì)植株的傷害也極小，是理想的外植體類(lèi)型。但以葉片為外植體進(jìn)行滅菌時(shí)，由于葉片布滿(mǎn)茸毛、大量外生菌隱藏于茸毛中并滋生[15]，滅菌時(shí)間不好把握，容易造成外植體受滅菌劑毒害而死亡或外植體因消毒不徹底而被污染。因此，苦苣苔外植體的表面消毒具有一定的困難，外植體在培養(yǎng)過(guò)程中污染率較高、成活率較低。以往的文獻(xiàn)報(bào)道中，均采用一次滅菌，用70%酒精表面消毒30～45 s，用無(wú)菌水沖洗3次后再放入0.1%升汞浸泡滅菌5～8 min，并不停振蕩，最后再用無(wú)菌水沖洗5～8次[16-18]。這種一次滅菌的方法雖然操作過(guò)程簡(jiǎn)單，但成活率較低。本研究采用升汞二次滅菌的方法對(duì)葉片進(jìn)行滅菌。先用75%酒精滅菌20 s，無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，主要是為了降低升汞對(duì)葉片的毒害，從而提高外植體的成活率。采用本滅菌方法，成活率可達(dá)55.40%。

苦苣苔科植物的葉片扦插繁殖容易，因此在組培中的植株再生及生根也較容易，但仍需要一定的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑刺激，才能達(dá)到快速獲得組培苗的目的。在現(xiàn)有的苦苣苔科植物的組織培養(yǎng)研究結(jié)果中，多數(shù)培養(yǎng)基均添加了細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素，以此來(lái)進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)和繼代增殖培養(yǎng)，如6-BA和NAA。本研究得出羽裂報(bào)春苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L，這與前人的研究結(jié)果是一致的。如王俐等[19]在進(jìn)行貓耳朵的組織培養(yǎng)時(shí)，在MS培養(yǎng)基上添加6-BA 3.0 mg/L和NAA 0.2 mg/L，出芽率達(dá)到100%；此外，還有MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.1 mg/L[13，20]以及MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L[21-22]也取得較好的培養(yǎng)效果。由此表明，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是影響苦苣苔科植物組織培養(yǎng)的重要影響因子；另外，在進(jìn)行羽裂報(bào)春苣苔的初代培養(yǎng)時(shí)，不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑也可誘導(dǎo)出不定芽，但所需時(shí)間較長(zhǎng)，可見(jiàn)6-BA和NAA對(duì)不定芽的誘導(dǎo)起促進(jìn)作用。

本研究以葉片為外植體，建立了羽裂報(bào)春苣苔的組織培養(yǎng)體系，適宜的外植體滅菌方法如下：采用75%酒精滅菌20 s，無(wú)菌水沖洗3次，然后用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，再用0.1%升汞滅菌6 min，無(wú)菌水沖洗3次，成活率為55.40%；不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0～2.0 mg/L+NAA 0.01～0.10 mg/L，誘導(dǎo)率達(dá)100.00%；適宜的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+活性炭0.1 g/L，增殖系數(shù)高達(dá)8.61；生根培養(yǎng)基為MS+IBA 0.5 mg/L+活性炭0.1 g/L，生根率100.00%，生根時(shí)間需要19.10 d；移栽基質(zhì)為泥炭 ∶ 珍珠巖 ∶ 河沙=4 ∶ 1 ∶ 1（V ∶ V ∶ V），移栽成活率為99.60%。

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