煙屬野生種主要植物學(xué)性狀及黑脛病抗性評價

何彬　楊志新　方敦煌　李勇　陳學(xué)軍

摘 要 鑒定了煙屬植物野生種生育期等植物學(xué)性狀特性，評價了供試材料對黑脛?。?號及1號生理小種）的抗性，為開展遠(yuǎn)緣雜交花期相遇及親本選配提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。在玻璃溫室內(nèi)，本研究針對66份煙屬植物野生種的生育期等7個植物學(xué)性狀的調(diào)查，檢測了煙堿及鉀含量，并對黑脛病（0號及1號生理小種）抗性進(jìn)行了評價。結(jié)果表明：供試材料播種到開花時間（DF）為35.00～357.00 d，平均121.67 d；種子千粒重（TSW）為0.02～0.20 g，平均0.09 g；株高（PH）為11.20～292.75 cm，平均119.19 cm；花冠長度（CL）為1.22～11.50 cm，平均3.98 cm；花冠直徑（CD）0.67～7.80 cm，平均2.37 cm；最大葉長（MLL）為6.79～61.15 cm，平均25.17 cm；最大葉寬（MLW）為0.65～35.51 cm，平均11.84 cm。煙堿含量為0.03%～1.81%，平均0.34%；鉀含量為0.32%～7.11%，平均3.56%。篩選到N. alata PI42334等11份資源同時抗黑脛病0及1號生理小種。

關(guān)鍵詞 煙屬植物資源；植物學(xué)性狀；黑脛病抗性

中圖分類號 S572 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The morphological variation of 66 Nicotiana accessions from 50 species were assessed based on 7 morphological traits. The leaf nicotine and potassium concentration of fresh tobacco leaf by kill-enzyme torrefaction method were measured. The evaluation of the accessions for their resistance to Phytophthora parasitica var. nicotianae（race 0 and race1）was conducted. The results showed that the days from sowing to flower（DF）were observed from 35.00 to 357.00 d with an average of 121.67 d. The 1000-seed weight（TSW）varied from 0.02 to 0.20 g with an average of 0.09 g. The plant height（PH）ranged from 11.20 to 292.75 cm with an average of 119.19 cm. The corolla length（CL）ranged from 1.22 to 11.50 cm with an average of 3.98 cm. The corolla diameter（CD）varied from 0.67 to 7.80 cm with an average of 2.37 cm. The maximum leave length（MLL）varied from 6.79 to 61.15 cm with an average of 25.17 cm， while the maximum leave width（MLW）varied from 0.65 to 35.51 cm with an average of 11.84 cm. The leaf nicotine concentration was measured from 0.03% to 1.81% with an average of 0.92%， potassium concentration measured from 0.32% to 7.11% with an average of 3.56%. Eleven wild tobacco accessions were resistant to black shank race 0 and race 1 after black shank disease inoculation. This work provided an important contribution to help breeders in the future on the direction of interspecific crossing attempts.

Key words Genus Nicotiana； morphological trait； black shank

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.008

煙屬種質(zhì)資源（Genus Nicotiana）包含76個種， 除人工馴化栽培的普通煙草（Nicotiana tabacum L.）和黃花煙草（N. rustica L.）外，其余均為煙屬野生種質(zhì)資源[1]（簡稱煙草野生種）。

黑脛病是土傳病害，主要為害煙草根及莖部，是中國煙葉生產(chǎn)的主要病害，每年造成近1億元的損失[2]。而煙草野生種擁有抗煙草黑脛病、TMV等主要病害、耐旱等逆境脅迫及具有特殊香氣等優(yōu)良性狀[3-4]，因此充分鑒定、挖掘并利用煙草野生種的優(yōu)良基因，成為培育優(yōu)質(zhì)、抗病品種的關(guān)鍵。

開展煙草野生種植物學(xué)性狀分析，是充分利用野生資源前提和基礎(chǔ)。20世紀(jì)50年代，Goodspeedii等[5]學(xué)者開展了煙草野生種分類學(xué)研究后，之后一些學(xué)者從細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)方法，開展了煙草起源與進(jìn)化方面的研究[6]。隨著學(xué)者對資源調(diào)查的深入，陸續(xù)有新的煙草野生種被發(fā)現(xiàn)[7]。前人多側(cè)重研究煙屬植物進(jìn)化及親緣關(guān)系分析，涉及到的植物學(xué)性狀也僅為零星幾個物種，50份以上的煙草野生種在相同氣候環(huán)境下的植物學(xué)性狀研究未見報道。另外，來自藍(lán)茉莉煙草（N. plumbaginifolia）的高抗黑脛病（0號生理小種）Ph基因，已在煙葉生產(chǎn)得到應(yīng)用和推廣[8]，但隨著抗病品種的推廣，出現(xiàn)了黑脛病的優(yōu)勢生理小種轉(zhuǎn)變快等問題[9]，嚴(yán)重威脅煙葉生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

筆者以從國外新引進(jìn)的66份煙草野生種為材料，在云南氣候條件下開展了生育期等植物學(xué)性狀的分析，并做了煙草野生種黑脛病0號和1號生理小種抗病性鑒定研究，為解決遠(yuǎn)緣雜交花期相遇、篩選適宜的雜交方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對加快煙草野生種中潛在的優(yōu)良基因?qū)朐耘酂煵荩S富現(xiàn)有烤煙資源遺傳多樣性有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為N. acuminata等66份煙草野生種（表1），由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院從德國、巴西和美國等國家科研機構(gòu)以種質(zhì)互換共享的形式引進(jìn)，且每份資源均有對應(yīng)的PI（Plant Introduction）編號及野生種編號TW（Tobacco Wild）所有供試材料PI及TW等對應(yīng)信息均可在美國農(nóng)業(yè)部的種質(zhì)資源信息網(wǎng)（http：//www.ars-grin.gov/）查詢到。所有實驗均在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院實驗室及玻璃溫室內(nèi)進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 植物學(xué)性狀分析及煙堿、鉀含量測定 供試材料統(tǒng)一播種、育苗并定植在溫室。采用隨機排列種植，每份材料種植50株，株行距為0.8 m×0.6 m。對供試材料開展了播種后至開花時間（Days to flowering，DF）、千粒重（Thousand-seeds weight，TSW）、株高（Plant height，PH）、花冠長（Corolla length，CL）、花冠直徑（Corolla diameter，CD）、最大葉長（Max leave length，MLL）、最大葉寬（Max leave width，MLW）等7個主要植物學(xué)性狀測定，上述性狀測定方法參照國家煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[10]進(jìn)行。取花期中下部葉片約20片，曬干后樣品參照國家煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行煙堿含量（Nicotine content，N）和鉀含量（Potassium content，K）測定[10-11]。取同期移栽的烤煙栽培種紅大作對照。溫室溫度控制在16～29 ℃，相對濕度在50%～90%，光照強度為52 000～54 000 lux。

1.2.2 黑脛病0號和1號生理小種抗性鑒定 根據(jù)Gutiérrez等[12]研究方法，篩選、純化后獲得黑脛病0號和1號生理小種。以紅大為感病對照，Beinhart1000-1為抗病對照，將40 d苗齡的供試材料移栽至小花缽，成活7 d后以貼接法接種黑脛病，即在煙株莖干基部劃小傷口并貼接黑脛病菌塊，供試煙苗在25 ℃、70%相對濕度的培養(yǎng)間內(nèi)進(jìn)行抗性鑒定。按照煙草行業(yè)煙草抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行抗、感特性分析。病情指數(shù)0～20為抗病，20.1～40為中抗，40.1及以上為感病。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測定的生育期千粒重等植物學(xué)性狀的均值、最大值、最小值、極差等均在Microsoft Office Excel中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物學(xué)性狀多樣性分析

供試煙屬植物資源的植物性性狀測定表明（表2、表3，圖1），播種到開花時間變幅為35～357 d，極差達(dá)322 d，播種到開花時間最長的是N. wigandioides PI 302471為357 d，而最短的是N. rosulata PI 244628僅為35 d。千粒重的變幅為0.02～0.20 g，極差為0.18 g，千粒重最高的是N.rustica PI 243561為0.20 g，最低的是N. otophora PI 555542為0.02 g。自然株高的變幅為11.20～292.75 cm，極差為281.55 cm，株高最高的是N. knightiana PI 555527為292.75 cm，株高最低的是N. corymbosa PI 114824為11.20 cm?；ü陂L的變幅為1.22～11.50 cm，極差為10.28 cm，花冠最長的是N. longiflora PI 555531為11.50 cm，最短的是N. linearis PI 555530為1.22 cm?；ü谥睆降淖兎鶠?.67～7.80 cm，極差為7.13 cm，花冠直徑最大的是N. sanderae PI 555578為7.80 cm，最小的是N. linearis PI 555530為0.67 cm。最大葉長的變幅為6.79～61.15 cm，極差為54.36 cm，葉片最長的是N. kawakamii PI 459106為61.15 cm，最短的是N. benthamiana PI 555478為6.79 cm。最大葉寬的變幅為0.65～35.51 cm，極差為34.86 cm，葉片最寬的是N. knightiana PI 555527為35.51 cm，最窄的是N. linearis PI 555530僅為0.65 cm。

供試材料煙堿含量的變幅為0.03%～1.81%，其中N. arentsii PI 555475煙堿含量最高為1.81%，N. plumbaginifolia PI 555548和N. simulans PI 271992的最低為0.03%，而栽培煙煙堿含量平均為0.96%。鉀含量的變幅為0.32%～7.11%，其中N. stocktonii PI 555538的鉀含量含量最高為7.11%，N. miersii PI 555537的最低為0.32%，而栽培煙晾干煙葉鉀含量為2.23%。

2.2 煙屬野生種黑脛病0號及1號生理小種鑒定

煙屬野生種黑脛病0號和1號生理小種抗病性鑒定結(jié)果表明（表4），N. alata PI 42334、N. debneyi、N. debneyi PI 503320、N. knightiana PI 555527、N. longiflora PI 555531、N. paniculata PI 555545、N. repanda PI 555552、N. rustica var. pavonii PI 243561、N. suaveolens PI 230960、N. suaveolens PI 555500、N. sanderae PI 555579、N. sanderae PI 555581、N. sanderae PI 555576及N. stocktonii PI555560等10個煙屬野生種資源資源種的14份資源抗黑脛病0號生理小種；其余材料均感0號生理小種。N. alata PI 42334、N. benthamiana PI 555478、N. debneyi、N. forgetiana PI 555501、N.kawakamii PI 459106、N. knightiana PI 555527、N. longiflora PI 555531、N. paniculata PI 555545、N. rustica var. pavonii PI 243561、N. stocktonii PI 555538、N. suaveolens PI 230960、N. suaveolens PI 555500、N. sanderae PI 555579、N. sanderae PI 555581、N. sanderae PI 555576等15份煙屬野生資源抗黑脛病1號生理小種； N. repanda PI 555552中抗1號生理小種；其余材料均感1號小種。N. alata PI 42334等11份煙屬野生資源同時抗黑脛病0號和1號生理小種。

3 討論

煙草主要起源于美洲及澳洲，中國主要通過引種來擴大煙草基因庫[13]。對野生種的植物學(xué)性狀進(jìn)行系統(tǒng)分析，仍為現(xiàn)代育種研究的最基本和必要的手段。本文研究了50個種66份煙草野生種千粒重等主要植物學(xué)性狀特性，綜合各性狀的平均值、最大值、最小值和極差等數(shù)據(jù)可見，煙草野生種有豐富的多樣性，這為有效利用煙草野生種提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

Li等[14]學(xué)者開展了37種97份煙草野生種資源的黑脛病1號和2號生理小種抗性鑒定，但沒有開展0號小種的抗性鑒定工作，本文報道了10個煙草種14份材料抗黑脛病0號小種。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，N. debneyi PI unassigned同時抗黑脛病0號和1號小種，而N. debneyi PI 503320 僅抗黑脛病0號小種，而感1號小種；N. stocktonii PI 555538 感黑脛病0號小種、抗黑脛病1號小種，而N.stocktonii PI 555560則相反。有望利用上述材料雜交后，尋找到新的抗源，并應(yīng)用于育種實踐。

Yuan[15]等從N. paniculata種的不同PI材料中，篩選到了新的不同于N基因的TMV新抗源。因此，盡管國外同行早就對煙屬植物資源開展了常規(guī)表現(xiàn)數(shù)據(jù)鑒定、乃至分子標(biāo)記方面的分析，但尚未見到在國內(nèi)生態(tài)條件下相同種不同PI編號煙屬植物資源表型數(shù)據(jù)及黑脛病0號和1號小種抗病性的報道。本研究獲得的上述煙屬野生種的生育期等主要的植物學(xué)性狀、黑脛病0號和1號小種抗病特性等基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為下一步拓展新的抗源、選育抗逆、耐蟲及特異品質(zhì)的育種中間材料提供了理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Chase M W， Knapp S， Cox A V， et al. Molecular systematics， GISH and the origin of hybrid taxa in Nicotiana （Solanaceae）[J]. Annals of Botany， 2003， 92（1）： 107-127.

[2] 黃文昌， 王 毅， 蔡長春， 等. 煙草黑脛病抗性遺傳分析[J]. 中國煙草科學(xué)， 2009， 30（增刊）： 69-74

[3] Heist E， Zaitlin D， Funnell D L， et al. Necrotic lesion resistance induced by Peronospora tabacina on leaves of Nicotiana obtusifolia[J]. Phytopathology， 2004， 94（11）： 1 178-1 188.

[4] Komori T， Myers P N， Yamada S， et al. Comparative study of the Nicotiana species with respect to water deficit tolerance during early growth[J]. Euphytica， 2000， 116（2）： 121-130.

[5] Goodspeed T H. The genus Nicotiana[M]. Chronica Botanica， Waltham Massachusetts， 1954.

[6] Lewis R， Nicholson J. Aspects of the evolution of Nicotiana tabacum L. and the status of the United States Nicotiana germplasm collection[J]. Genetic resources and crop evolution， 2007， 54（4）： 727-740.

[7] Merxmuller H， Buttler K P. Nicotiana in der afrikanischen Namib-ein pflanzengeographisches und phylogenetisches Ratsel[J]. Mitt Bot Miinchen， 1975， 12： 91-104.

[8] Chaplin J F. Transfer of black shank resistance from Nicotiana plumbaginifolia to flue-cured N. tabacum[J]. Tob Sci， 1962， 6： 184-189.

[9] Wang H C， Chen X J， Cai L T， et al. Race distribution and distribution of sensitivities to mefenoxam among isolates of Phytophthora parasitica var. nicotianae in Guizhou province of China[J]. Crop Protection， 2013， 52： 136-140.

[10] 安金月. 煙草行業(yè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)法規(guī)匯編[M]. 長春： 吉林人民出版社， 2002.

[11] 劉劍君， 朱寶川， 梅 芳， 等. 嫁接對烤煙煙堿和鉀含量的影響[J]. 中國煙草學(xué)報， 2013， 19 （6）： 59-64

[12] Gutiérrez W A， Mila A L. A rapid technique for determination of races of Phytophthora nicotianae on tobacco[J]. Plant Disease， 2007， 91（8）： 985-989.

[13] 任 民， 王志德， 牟建民， 等. 我國煙草種質(zhì)資源的種類與分布概況[J]. 中國煙草科學(xué)， 2009， 30（1）： 8-14.

[14] Li B C， Bass W T， Cornelius P L. Resistance to tobacco black shank in Nicotiana Species[J]. Crop Sci， 2006， 46： 554-560.

[15] Yuan X， Yan C， Wu Z， et al. Frequent gain and loss of resistance against tobacco mosaic virus in Nicotiana species[J]. Mol Plant， 2015， 8： 1 813-1 815.