番茄泛素活化酶基因家族進化及表達模式分析

趙秋芳　馬海洋　陳曙　陳宏良　賈利強

摘 要 泛素活化酶是蛋白泛素化所需的第一個酶，在泛素蛋白酶體途徑中發(fā)揮重要作用。本文利用生物信息學方法從番茄基因組中鑒定出2個泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme，UBA）基因，命名為SlUBA1和 SlUBA2。序列分析表明SlUBA1和SlUBA2基因的CDS序列長分別為3 060和3 255 bp，分別編碼1 019和1 084個氨基酸，編碼蛋白分子量為114.15和120.46 ku，分別位于第6和9染色體。2個基因均含有5個內(nèi)含子，編碼蛋白均為酸性、疏水性蛋白；對蛋白二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)2個UBA蛋白均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主；亞細胞定位預測均定位于細胞核。序列比對和進化樹分析表明番茄UBA基因與其他物種UBA基因相似性高，進化過程非常保守。番茄不同組織表達分析結(jié)果表明2個UBA基因在根系和花的表達量較高，果實成熟過程中的表達量相對較低。非生物脅迫試驗結(jié)果表明：SlUBA1基因在低溫、干旱和鹽脅迫下均上調(diào)表達；而SlUBA2基因?qū)Ψ巧锩{迫沒有明顯響應，這些結(jié)果表明SlUBA1基因可能參與番茄對低溫、干旱和鹽脅迫的響應。

關鍵詞 番茄；泛素活化酶基因；進化分析；基因表達

中圖分類號 S641.2 文獻標識碼 A

Abstract Ubiquitin activating enzyme is the first enzyme which combined with ubiquitin and protein， playing an important role in the ubiquitin-proteasome pathway（UPP）. In this study， we identified two ubiquitin activating enzyme（UBA）genes designated as SlUBA1 and SlUBA2 from tomato genome using bioinformatics methods. Sequence analysis of SlUBA1 and SlUBA2 revealed that the CDS lengths waere 3 060 and 3 255 bp respectively， encoding the proteins of 1 019 and 1 084 amino acids with predicted molecular weight of 114.15 and 120.46 ku， located on No.6 and 9 chromosome， separately. The two SlUBA genes both contained 5 introns， encoding acidic and hydrophobic protein. The predicted secondary structure suggested that the main structure of two proteins were alpha helix and random coil； The subcellular localization were predicted in the nucleus. Sequence alignment and phylogenetic tree analysis showed that the UBA genes of tomato had high similarity to the UBA genes in other species and indicated that the evolution process of the UBA family was very conservative. The expression of two SlUBA genes in different tissues were investigated， which were highly expressed in roots and flowers， while had low expression in fruit ripening stage. Abiotic stress treated results showed that the expression levels of SlUBA1 was upregulated under cold， drought and salt stress， while the gene of SlUBA2 had no significant change. These results indicated that SlUBA1 genes may be involved in the response of tomato to low temperature， drought and salt stresses.

Key words Tomato； ubiquitin activating enzyme（UBA）gene； phylogeny analysis； gene expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.016

蛋白質(zhì)作為非常重要的生命大分子，在生命活動的各個方面發(fā)揮著重要的作用。蛋白質(zhì)的合成和降解均影響著生命活動的進行。泛素蛋白酶體途徑（ubiquitin proteasome pathway）是真核生物蛋白高效專一降解的重要調(diào)控機制之一。蛋白泛素化過程主要通過3種酶來完成：首先泛素活化酶（E1）在ATP的幫助下催化泛素分子C末端甘氨酸（Gly）殘基與E1的半胱氨酸（Cys）殘基形成一個高能硫酯鍵，活化的泛素分子通過轉(zhuǎn)酯作用從E1轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶（E2）的Cys殘基上，形成E2-Ub復合物，E2-Ub復合物在 泛素連接酶（E3）協(xié)同作用下，把活化的泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白上[1]。泛素活化酶（E1）是泛素與底物蛋白結(jié)合所需要的第一個酶，在蛋白泛素化過程中發(fā)揮著重要的作用。泛素活化酶（E1）的催化能力很強，在大部分物種中只需要一種E1酶就可以激活泛素化的整個過程[2]。

E1是一種廣泛表達的多肽，大約1 100個氨基酸，含有位置固定的保守的半胱氨酸殘基。1991年首次發(fā)現(xiàn)人的泛素活化酶UBE1，并證實半胱氨酸殘基與泛素活化酶的活性功能相關[3]。目前，泛素活化酶基因己經(jīng)從多種生物中分離得到，包括兔、酵母、小鼠、擬南芥、小麥、煙草、茶樹等[4-10]。酵母基因組編碼單一的泛素活化酶，該基因缺失對酵母是致死的，說明E1蛋白對于酵母細胞的生存是至關重要的[11]。在哺乳動物中，泛素活化酶首次被定位在細胞核和細胞質(zhì)中，并存在2種亞型E1a和E1b[12-15]。在植物中存在多種類型E1基因，在擬南芥中有2個基因編碼泛素活化酶，分別為AtUBA1和AtUBA2，2個基因編碼蛋白存在81%的相似氨基酸[7]。從小麥胚芽中分離到3種類型的 E1蛋白，編碼基因命名為 TaUBA 1-3[8]，在煙草中分離出煙草泛素活化酶基因NtE1A和NtE1B[9]。研究表明植物與酵母和哺乳動物的E1的序列高度保守[16-17]。目前，有關泛素活化酶的研究主要集中在擬南芥、小麥等模式植物中，番茄泛素活化酶的研究仍未見報道。番茄是重要的蔬菜作物，同時也是研究果實成熟和植物逆境脅迫的模式植物。隨著番茄全基因組的測序成功，更多基因資源可供挖掘利用，也為鑒定番茄E1家族基因提供數(shù)據(jù)支持。本研究中，從番茄全基因組數(shù)據(jù)庫中鑒定出2個番茄泛素活化酶（E1）基因，并對其進行理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、序列比對和進化等生物信息學分析，并利用實時熒光定量PCR技術對番茄泛素活化酶基因家族成員在不同組織和逆境脅迫下的表達模式進行分析，以期為后期番茄泛素活化酶的功能鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄品種為測序品種“Heinz 1706”，在番茄營養(yǎng)生長階段取根、莖、 葉，在生殖生長階段取花和各果實發(fā)育階段（包括小果、綠熟果、轉(zhuǎn)色果、紅熟果）樣品。脅迫處理試驗：選取“Heinz 1706”生長飽滿的種子，培養(yǎng)2周后，選取生長一致幼苗各12株進行脅迫處理. 低溫處理：將幼苗置于4 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；干旱處理：將幼苗置于20% PEG-6000溶液中；鹽處理：將幼苗置于200 mmol/L NaCl 溶液中。樣品分別在處理0、1、6、24 h取樣，并用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 番茄泛素活化酶基因家族檢索和鑒定 在擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫Tair（https：//www.arabidopsis.org/）中搜索出已知的泛素活化酶（UBA）基因及其編碼的蛋白序列，根據(jù)擬南芥UBA的蛋白序列在番茄基因組數(shù)據(jù)庫SOL（https：//solgenomics.net/）和Phytozome11.0（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）搜索番茄UBA候選基因，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對候選基因的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域進行鑒定，凡是含有UBA基因保守結(jié)構(gòu)域的蛋白即為番茄UBA成員。在番茄基因組數(shù)據(jù)庫SOL中查出了所有UBA基因的開放閱讀框長度、染色體位置、內(nèi)含子個數(shù)等基本信息；利用在線工具Expasy roteomics Server（http：//web.expasy.org）進行分子量和等電點分析；利用在線SOPMA程序（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）預測候選蛋白的二級結(jié)構(gòu)；利用plant-mploc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）分析番茄UBA基因成員的亞細胞定位，利用GSDS（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）在線工具對基因外顯子-內(nèi)含子作圖。

1.2.2 番茄泛素活化酶序列比對和進化樹分析

利用Clustal X1.83對番茄、擬南芥、小麥的UBA家族氨基酸序列進行多重比對，并用MEGA 6.0構(gòu)建番茄、擬南芥、小麥、小鼠、酵母、人類的UBA家族成員進化樹，分析其進化關系。進化樹采用遺傳距離建樹法的相鄰連接法（Neighbor-Joining，NJ）建樹，對生成的樹進行自檢，重復設定為1 000次。

1.2.3 番茄泛素活化酶基因表達分析 采用植物RNA提取試劑盒（華越洋生物科技有限公司產(chǎn)品）提取番茄總RNA，樣品RNA經(jīng)檢測質(zhì)量和濃度后，利用M-MLV（Rnase H-）逆轉(zhuǎn)錄酶（TaKaRa公司）合成cDNA模板，稀釋備用。根據(jù)番茄UBA基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件進行設計定量引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列詳見表1。利用熒光實時定量 PCR試劑盒為SYBR Green Realtime PCR Master mix（TaKaRa公司），反應體系為10 μL，SYBR Premix Ex TaqTmⅡ，5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，無菌雙蒸餾水2 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，3次重復，采用2-ΔΔCt的方法計算UBA基因的表達水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄UBA家族基因鑒定及理化性質(zhì)分析

為鑒定番茄UBA家族基因，本研究采用擬南芥的氨基酸序列作為靶序列，利用BLASTP方法對番茄基因組數(shù)據(jù)庫和Phytozome11.0進行檢索，并對候選基因進行結(jié)構(gòu)域檢測，最終鑒定出2個番茄UBA基因，SGN編號為Solyc06g007320.2.1和Solyc09g018450.2.1，分別命名為SlUBA1和SlUBA2。番茄UBA基因家族的CDS長度、氨基酸數(shù)目、內(nèi)含子個數(shù)、分子量以及等電點、不穩(wěn)定指數(shù)、疏水性和脂肪系數(shù)等理化性質(zhì)均非常相似（表2、圖1）。

SlUBA1位于第6染色體，基因方向為反向，CDS序列長度3 060 bp，編碼1 091個氨基酸，5個內(nèi)含子，編碼蛋白分子量為114.15 ku，等電點為5.05，不穩(wěn)定指數(shù)為31.88，平均疏水性（GRAVY）-0.233， 脂肪系數(shù)（AI）86.15。SlUBA2位于第9染色體，基因方向為正向，CDS序列長度3 255 bp，編碼1 084個氨基酸，5個內(nèi)含子，編碼蛋白分子量為120.46 ku，等電點為4.99，不穩(wěn)定指數(shù)為34.33，平均疏水性（GRAVY）-0.232，脂肪系數(shù)（AI）85.48（表2）。

蛋白二級結(jié)構(gòu)分析（表3）表明：2個UBA蛋白的二級結(jié)構(gòu)均由α-螺旋，擴展鏈結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角，無規(guī)則卷曲4種形式組成，且以α-螺旋所占比例最高，其次為無規(guī)則卷曲，而β-轉(zhuǎn)角所占比例最小。蛋白質(zhì)亞細胞定位預測結(jié)果表明2個番茄UBA蛋白均定位于細胞核中。

2.2 番茄UBA家族基因序列比對和進化樹分析

對不同物種中UBA蛋白序列進行完全比對發(fā)現(xiàn)SlUBA1和SlUBA2與擬南芥、小麥中UBA蛋白的同源性非常高，而且具有非常保守的序列和結(jié)構(gòu)。序列比對發(fā)現(xiàn)SlUBA1與AtUBA2、AtUBA1、TaUBA1、TaUBA3蛋白序列一致性分別為78%、80.6%、78.8%、74.6%；SlUBA2與AtUBA2、AtUBA1、TaUBA1、TaUBA3的一致性分別為74%、74.5%、76.1%、72.3%。SlUBA1和SlUBA2之間的一致性達80.3%（表4）。

為了更好的了解E1基因家族成員與其他真核生物E1基因間的進化關系，利用已知的人類、小鼠、酵母、擬南芥、小麥和番茄的UBA蛋白共10個序列構(gòu)建了系統(tǒng)進化樹（圖2）。系統(tǒng)發(fā)育進化樹中SlUBA1和SlUBA2與擬南芥和小麥UBA聚在一起，驗證UBA基因進化過程的保守性，且UBA基因的祖先在單雙子葉植物分離之前就已存在。另外發(fā)育樹植物、動物和酵母等真核生物中的UBA基因大都聚集在一起，這也說明UBA基因進化過程具有很高的保守性。

2.3 番茄UBA家族基因在番茄不同組織中的表達模式分析

為了更好了解SlUBA基因的潛在功能，分析了SlUBA基因在不同發(fā)育時期的時空表達模式，詳見圖3。SlUBA基因在番茄8種組織/器官中均有表達，但其表達模式有所差異。SlUBA1在根系中表達量最高，其次為花，在小果中表達量最低，表達量最高約為最低的3倍。SlUBA2在花中的表達量最高，其次為根，在綠熟果的表達量最低，表達量最高約為最低的4倍。

2.4 番茄UBA家族基因在非生物脅迫下的表達分析

圖4所示為番茄UBA家族基因在低溫、干旱和鹽脅迫下的表達量變化。4 ℃低溫脅迫處理下，SlUBA1基因表達量在1～6 h下降，24 h達到最高值，為對照處理的2.95倍；在干旱脅迫下，SlUBA1表達量在1 h迅速增加到最大值，為對照的2.45倍，隨后6～24 h表達水平逐漸下降；鹽脅迫處理SlUBA1呈逐漸上升的趨勢，24 h表達量最高，為對照的3.5倍。相對SlUBA1表達量的變化，SlUBA2在各脅迫處理下均未見顯著的表達量變化。這些實驗結(jié)果表明SlUBA1可能響應低溫、干旱和鹽脅迫，而SlUBA2對非生物脅迫沒有明顯響應。

3 討論

泛素活化酶是泛素蛋白酶體介導的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng)中關鍵酶，目前已有多個真核生物中的泛素活化酶基因被鑒定出來，但是番茄中仍未見報道。本文通過生物信息學方法共鑒定2個SlUBA基因，其編碼氨基酸分別為1 019和1 084 aa，預測蛋白分子量為114.15和120.46 ku，與已知的擬南芥、小麥和煙草的UBA蛋白相似[7-9]，且2個SlUBA基因的內(nèi)含子數(shù)量和結(jié)構(gòu)也與擬南芥相一致[7]。已有研究表明擬南芥中NtE1A，NtE1B二者氨基酸序列相似度達81%，煙草NtUBA1和NtUBA2氨基酸序列相似度達98%，本研究中序列比對結(jié)果表明SlUBA1和SlUBA2氨基酸序列相似度達80.3%，與擬南芥和煙草的研究結(jié)果相一致。另外番茄與擬南芥和小麥的UBA氨基酸序列相似度在74%～80%之間，表明UBA基因在物種進化過程非常保守，與其他真核生物的進化樹分析結(jié)果這證實了UBA基因進化的保守性。

E1s可以激活泛素分子，是蛋白泛素化途徑中第一個起作用的酶，因此E1基因的表達模式有可能對植物的組織建成和生長發(fā)育有一定的作用。擬南芥中UBA基因在不同組織中均有表達，且UBA在代謝較為活躍的組織細胞中表達量最高，包括維管束中的薄壁細胞、新葉、分生組織、花藥、子房和柱頭等[7]。番茄不同組織中UBA基因的表達模式分析結(jié)果表明：番茄UBA基因在不同組織中均有表達，但其表達量存在差異，2個基因均在根和花中表達量較高，而在果實發(fā)育各個發(fā)育階段表達量相對較低，且在大多數(shù)組織中呈現(xiàn)共表達的模式，這與擬南芥中的研究結(jié)果一致[7]，該研究結(jié)果說明在番茄根系和花的生長發(fā)育需要泛素化途徑，而在果實發(fā)育各個時期需求較小。

研究發(fā)現(xiàn)，高等植物在應對高溫、低溫、干旱等逆境時均會產(chǎn)生各種脅迫蛋白[18]，而泛素蛋白酶體途徑（UPP）可以高效且高度選擇性地對細胞內(nèi)某些蛋白質(zhì)進行部分或完全降解，實現(xiàn)對多種代謝過程的內(nèi)在生理調(diào)節(jié)[19]，在逆境條件下，泛素蛋白酶體降解途徑通過降解不正常的蛋白以維持植物體的氨基酸的數(shù)目；同時通過去除一些限速反應酶和一些調(diào)節(jié)因子來精確調(diào)控生理平衡，以使植物適應外界環(huán)境，抵御外界脅迫。煙草侵染煙草花葉病毒（TMV）和番茄花葉病毒（ToMV）后NtE1A和NtE1B基因上調(diào)表達，侵染黃瓜花葉病毒（CMV）并未上調(diào)表達，另外NtE1A和NtE1B基因在煙草受到機械傷害和水楊酸、茉莉酸、乙酸激素處理后均上調(diào)表達[9]。這一研究結(jié)果表明UBA作為泛素蛋白酶體降解途徑中的一個關鍵酶，其在植物應答逆境脅迫發(fā)揮作用。最新研究結(jié)果表明擬南芥超表達鹽土植物香雪球的LmVHA-E1基因可以顯著提高其耐旱和耐鹽能力[20]，這也證實E1基因響應脅迫環(huán)境中的作用。本研究分析了番茄UBA基因在低溫，鹽和干旱脅迫下的表達差異，結(jié)果表明在低溫、鹽和干旱脅迫下SlUBA1基因均上調(diào)表達，而SlUBA2對低溫、、鹽和干旱等逆境脅迫沒有明顯響應，表明SlUBA1基因表達受非生物脅迫誘導，可以推測在番茄的泛素蛋白酶體途徑中主要是由SlUBA1基因主要負責泛素活化作用。而在煙草中2個E1基因在響應逆境脅迫和應答激素處理時呈現(xiàn)共表達模式[9]，與本研究結(jié)果不一致，說明不同作物的E1基因應答逆境脅迫的模式并不完全相同。

本文通過對番茄UBA基因家族進行全基因組鑒定，共鑒定出2個候選SlUBA成員，并對其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、序列比對和系統(tǒng)進化等進行了生物信息學分析，同時分析了SlUBA在番茄不同組織和非生物脅迫下的表達模式差異，結(jié)果表明SlUBA基因在根和花中表達量較高，在果實發(fā)育階段表達量相對較低；SlUBA1基因能夠被多種非生物脅迫（低溫、干旱、鹽）不同程度誘導表達，而SlUBA2基因表達未受非生物脅迫誘導，可以推測在蛋白泛素化過程中可能是SlUBA1起主要的泛素活化作用。

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