摘要[目的]研究水稻白葉枯病菌fkbM基因?qū)ζ溥\動性的影響。[方法]采用同源置換方法對水稻白葉枯病菌野生型菌株P(guān)XO99A 的fkbM基因進行基因敲除，構(gòu)建突變菌株ΔfkbMXoo，同時構(gòu)建互補菌株ΔfkbMXoo （C）。通過運動性試驗，確定fkbM基因?qū)\動性的影響。[結(jié)果]與野生型菌株P(guān)XO99A相比，ΔfkbMXoo突變體運動性明顯減弱，而互補菌株ΔfkbMXoo （C）能基本恢復(fù)水稻白葉枯病菌的運動性。[結(jié)論]水稻白葉枯病菌fkbM基因突變能減弱水稻白葉枯病菌的運動能力。

關(guān)鍵詞fkbMXoo；運動性；水稻白葉枯病菌

中圖分類號S435.111.4+7文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）05-0144-03

Abstract[Objective] To study the effect of the fkbM gene of Xanthomonas oryzae pv. oryzae on motility.[Method] A deletion mutant of fkbM was generated by homologous recombination ΔfkbMXoo.To construct a complementary strain ΔfkbMXoo （C）.Using motiliy test experiment to confirm the effect of the fkbM gene on motility.[Result]Compared with wild type strain PXO99A，the mutant ΔfkbMXoo displayed reduced motility.In complementary strain ΔfkbMXoo（C），changed phenotypes were restored to certain degree.[Conclusion] The fkbM gene mutation of X.oryzae could reduce motility function of X.oryzae.

Key wordsfkbMXoo；Motility；Xanthomonas oryzae pv.oryzae

作者簡介伍甜（1986—），男，湖南衡陽人，碩士，從事分子生物學(xué)及植物病理學(xué)研究。

收稿日期2016-12-23

水稻白葉枯?。˙acterial blight of rice）是我國水稻的三大病害之一，對水稻危害程度高，這種病害由黃單胞菌屬水稻致病變種（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，簡稱Xoo）侵染引起，屬于細菌性病害。當水稻被白葉枯病菌感染后，通常會引起水稻減產(chǎn)20%～30%，在發(fā)病嚴重的水稻產(chǎn)地可能減產(chǎn)50%以上[1]。細菌通過鞭毛進行游動，鞭毛是細菌最主要的運動器官，細菌的游動性與致病性緊密相關(guān)[2] ，Xoo是單級生鞭毛，fkbM基因位于Xoo鞭毛糖基化島基因簇上，其上游是糖基轉(zhuǎn)移酶〖STBX〗rbfC基因，orfN、orf1和orf2是糖基轉(zhuǎn)移酶基因，rbfC與orfN、orf1和orf2同源性很高[3] 。研究發(fā)現(xiàn)，位于糖基化島中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因〖STBX〗orfN、orf1和orf2對細菌鞭毛運動性有影響[4]。但是fkbM基因?qū)oo運動性的影響尚未有明確研究，該研究探索了fkbM基因?qū)oo運動性的影響，為水稻白葉枯病菌致病機理研究提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒。

水稻白葉枯病菌PXO99A菌株，大腸桿菌（Escherichia coli）DH 5α 菌株及用于互補分析的廣寄主范圍載體 pHM1來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；此次雙交換突變體的載體 pK18mobsacB由中國科學(xué)院微生物研究所劉雙江研究員提供；含慶大霉素（Gentamicin）抗性基因的載體 pBBR1MCS-5來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所；克隆載體 pMD18-T 購買于 TaKaRa（大連）公司。

1.1.2主要生化試劑與儀器。

試驗所用的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶和Taq DNA 聚合酶均購買于 TaKaRa（大連）公司；抗生素均購買于Sigma公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購買于天根生物公司（北京）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購買于北京化工廠。試驗過程中使用的抗生素及其濃度如下：壯觀霉素（Sp）25 μg/mL、氨芐青霉素（Amp）100 μg/mL、慶大霉素（Gm）25 μg/mL。所用儀器主要有電轉(zhuǎn)儀（Bio-Rad公司）；PCR 儀（Biometra 公司）；PerkinElmer lambda 35 型分光光度計（美國珀金埃爾默公司）。

1.2方法

1.2.1fkbM基因突變體自殺載體的構(gòu)建。以PXO99A基因組為模板，運用Primer 5軟件設(shè)計引物，LfkbMR：5′-CGGAATTCGTGGGTGCCAATGCTGTT-3′酶切位點EcoR I，LfkbMF：5′ -CGGGATCCGCCTACATGGGACTCGGGA-3′酶切位點BamH I；RfkbMR：5′-CCAAGCTTGAATGGGAAGCATGTGGC-3′酶切位點Xba I，RfkbMF：5′-GCTCTAGAGCCCAGGAATATTCACGATT-3′酶切位點Hind Ⅲ。

擴增fkbM基因的左臂，PCR的擴增程序為先通過95 ℃預(yù)變性3 min，再經(jīng)過30 個循環(huán)擴增（95 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃進行延伸補平10 min。擴增fkbM基因的右臂，PCR的擴增程序為先通過95 ℃預(yù)變性3 min，再經(jīng)過30 個循環(huán)擴增（95 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃延伸補平10 min。通過瓊脂糖凝膠回收，得到左、右臂基因片段，再通過T4連接酶，連接到pMD18-T載體上，熱轉(zhuǎn)化入E.coli 感受態(tài)細胞，通過培養(yǎng)提取，獲得連接后質(zhì)粒，即pMD左臂和pMD右臂，對擴增片段進行測序鑒定后，瓊脂糖凝膠回收質(zhì)粒。使用EcoR I和BamH I酶雙酶切pMD右臂片段，瓊脂糖凝膠回收右臂片段后，與EcoR I和BamH I酶雙酶切的pMD左臂載體進行連接，轉(zhuǎn)化至E.coli 感受態(tài)細胞，得到重組質(zhì)粒 pMD左右臂。EcoR I和Hind Ⅲ酶切消化pMD左、右臂，通過Hind Ⅲ和 Xba Ⅰ 雙酶切得到左右臂片段，瓊脂糖凝膠回收質(zhì)粒后，與通過Hind Ⅲ和Xba Ⅰ 雙酶切 pK18mobsacB質(zhì)粒載體連接，得到的質(zhì)粒含有左右臂pK18mobsacBfkbM后，突變體自殺載體成功構(gòu)建。

1.2.2fkbM基因突變體的構(gòu)建。

（1）配制PSA 固體培養(yǎng)基，采用劃線的方式活化野生型菌株P(guān)XO99A，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，倒置培養(yǎng)2～3 d（防止霉菌污染）。

（2）在培養(yǎng)基中，挑取單個菌落，接種于 3 mL的M210 液體培養(yǎng)基中，200 r/min 、28 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)2 d，進一步活化菌株。

（3） 以1%的接種量轉(zhuǎn)接到500 mL的M210 液體培養(yǎng)基中，200 r/min、28 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長中期（OD600=1.0～1.2）。

（4）將含有菌液的培養(yǎng)基取出，置于冰上，冰浴 20 min，4 ℃、5 000 r/min離心10 min后取出倒出菌體。

（5）經(jīng)過濾膜過濾的10%甘油，先置于冰上預(yù)冷，取出的菌體用預(yù)冷的等體積的甘油輕輕吹洗3次。

（6）將離心機設(shè)置4 ℃、5 000 r/min，對菌體進行離心，收集菌液，去除上清，在離心的最后1次，預(yù)留10%甘油輕輕吹洗，重懸菌體，此時該菌體的密度約為1.0×109個/mL。

（7）用TP管進行分裝，每管約 30 μL，放入液氮速凍，將剩余的感受態(tài)細胞置于-80 ℃冰箱中備用。

（8）吸取20～50 ng 含有左右臂的pK18mobsacBfkbM 質(zhì)粒加入到前期制作好的30 μL PXO99A 感受態(tài)細胞中，用移液槍輕輕吹打混勻質(zhì)粒與感受態(tài)細胞，放入電擊杯中（2 mm-gap），用手輕輕振動，使液體沉降至杯底，然后開始電擊轉(zhuǎn)化（V=2.0 kV，C=25 μF，R=200 Ω），吸取電擊后的混合物加入到含有1 mL LB培養(yǎng)基的TP管中，置于100 r/min 、28 ℃恒溫搖床中，振蕩培養(yǎng) 6 h后，吸取該菌液，均勻涂布于含相應(yīng)抗生素的 PSA或 LB 平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置繼續(xù)培養(yǎng)3～7 d。

（9）提取含有突變體質(zhì)粒pK18mobsacBfkbM ，將其電擊轉(zhuǎn)化，導(dǎo)入PXO99A 感受態(tài)細胞中，將電擊后的混合溶液均勻涂布于含Gm 抗性的LB 平板上，通過抗性初步篩選轉(zhuǎn)化子，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)3～7 d，將能夠在Gm 抗性平板上生長的單個菌落挑出，于含10%蔗糖的PSA 平板上劃線培養(yǎng)，再次篩選轉(zhuǎn)化子；最終還能長出的菌落，在同時含有Gm 抗性和10%蔗糖的PSA 平板上繼續(xù)劃線培養(yǎng)，還能繼續(xù)長出菌落，該菌落即為突變菌株。自殺質(zhì)粒pK18mobsacBfkbM 上含有高蔗糖致死基因sac B，通過篩選能在Gm 抗性和高濃度蔗糖平板上生長的菌落，得到fkbMXoo突變體基因，這是通過同源重組，Gm 等位置換了fkbM基因，最終所得突變菌株基因組中不含有自殺載體及高蔗糖致死基因sac B 的序列，最后通過PCR 擴增來驗證突變菌株是否獲取。

（10）從這些長出的菌落中，挑選5個單菌落，繼續(xù)轉(zhuǎn)接到不含Gm抗性的PSA平板上，放入恒溫培養(yǎng)箱中，28 ℃培養(yǎng)，每隔2～3 d，從培養(yǎng)的菌中轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)繼代培養(yǎng)20代。再次驗證突變體，將培養(yǎng)20代后的突變體均勻涂布到含Gm抗性的PSA平板上，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，長出的菌落再次用PCR擴增的方法來檢測突變體的穩(wěn)定性。

1.2.3ΔfkbMXoo互補菌株的構(gòu)建。以PXO99ADNA 為模板，用Primer 5軟件設(shè)計引物，fkbMF：5′-CC〖ZZ（Z〗AAGCTT〖ZZ）〗GCATGGTGCACGGTCCC-3′酶切位點Hind Ⅲ，fkbMR：5′-GC〖ZZ（Z〗TCTAGA〖ZZ）〗TTACTCCGCCCAAGGCGG-3′酶切位點Xba I 。

以PCR 擴增包括自身啟動子的fkbM序列，擴增程序為先通過95 ℃預(yù)變性3 min，再經(jīng)過30 個循環(huán)擴增（95 ℃變性30 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃下對擴增產(chǎn)物進行延伸補平10 min。將擴增出來的PCR產(chǎn)物，直接連接至pMD18-T載體上，然后送公司測序鑒定確認，將確認好的片段連接至pMD18-T載體，采用Hind Ⅲ和Xba I雙酶切，通過凝膠電泳回收約1.2 kb 的目的片段，與經(jīng)過同樣Hind Ⅲ和Xba I雙酶切的pBBR載體進行回收，將目的片段與pBBR載體進行連接，熱擊轉(zhuǎn)化至E.coli 感受態(tài)細胞，然后用含有Amp抗性的LB固體平板進行篩選，挑取單個菌落，進行PCR擴增，得到含有目的片段的條帶，說明構(gòu)建的互補質(zhì)粒成功，將該質(zhì)粒命名為pBBRfkbM質(zhì)粒。通過電擊轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入至ΔfkbMXoo感受態(tài)中，置于100 r/min 、28 ℃恒溫搖床中，振蕩培養(yǎng) 6 h。最后涂布于含Amp抗性的PSA 平板進行陽性轉(zhuǎn)化子篩選，得到的菌株為ΔfkbMXoo的互補菌株ΔfkbMXoo （C）。

1.2.4鞭毛運動性測定。

通過劃線培養(yǎng)，在PSA 平板活化待測菌株，挑取單個菌落，接種于M210 液體培養(yǎng)基中，置于200 r/min、28 ℃恒溫的搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，5 000 r/min離心收集菌體，用無菌水將待測菌液稀釋到OD600=0.5，取1 μL 稀釋后的待測菌液，點接于半固體PSA培養(yǎng)基平板中央位置，至于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)4 d后，觀察待測菌運動情況。

2結(jié)果與分析

2.1ΔfkbMXoo突變體菌株的構(gòu)建驗證

由于野生的PXO99A菌株基因組內(nèi)是不含Gm抗性基因的，因此可以用Gm抗性來篩選突變體；由于突變體插入了Gm抗性基因，因此能夠在含有Gm抗性的PSA固體培養(yǎng)基上生長。挑選5個單個突變克隆，在不含Gm抗性的PSA平板上劃線，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)繼代培養(yǎng)3代，然后取第3代的培養(yǎng)液，在含Gm抗性的PSA平板上進行劃線培養(yǎng)。挑取單菌落，使用引物L(fēng)fkbMR/RfkbMF進行擴增，PCR的擴增程序如下：先通過95 ℃預(yù)變性3 min，再經(jīng)過30個循環(huán)擴增（95 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃進行延伸補平10 min。通過PCR擴增的方法進行驗證，由于Gm抗性基因比所置換的fkbM基因短約500 bp，所以用PXO99A野生型菌種作為模板的擴增條帶要比用突變菌株ΔfkbMXoo菌株擴增條帶小約500 bp（圖 1）。PCR結(jié)果驗證顯示已獲得穩(wěn)定的ΔfkbMXoo菌株。

2.2ΔfkbMXoo互補菌株的構(gòu)建驗證

配制PSA 平板（含Gm和Sp雙抗性），對陽性克隆進行篩選，將單個菌落在培養(yǎng)基上劃線，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每3 d轉(zhuǎn)接1次，經(jīng)過3代的連續(xù)繼代培養(yǎng)。從互補菌株中提取質(zhì)粒作為模板，使用引物fkbMF/fkbMR，通過PCR擴增，PCR的擴增程序如下：先通過95 ℃預(yù)變性3 min，再經(jīng)過30個循環(huán)擴增（95 ℃變性30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸5 min），最后在72 ℃進行延伸補平10 min。PCR擴增的目標片段長度約為1.2 kb，通過PCR擴增目的基因（圖2），再進行瓊脂糖凝膠電泳，可以得到大小一致的目的片段，說明重組克隆已進入ΔfkbMXoo 并穩(wěn)定存在，互補菌株為ΔfkbMXoo （C）。

2.3ΔfkbMXoo鞭毛運動性測定

將 PXO99A、ΔfkbMXoo 和ΔfkbMXoo （C）分別接入M210 液體培養(yǎng)基中，置于200 r/min、28 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，用無菌水稀釋菌體至OD600=0.5，取1 μL培養(yǎng)液點接于半固體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 d，觀察各個菌株的運動痕跡，量取各個培養(yǎng)皿中菌體游動的直徑長度。培養(yǎng)4 d后，發(fā)現(xiàn)ΔfkbMXoo 的游動直徑比PXO99A 減小約0.5 cm，喪失了部分游動能力，互補菌株可以基本恢復(fù)至野生型運動水平（圖3），通過20個平板的重復(fù)驗證，發(fā)現(xiàn)結(jié)果重復(fù)性良好，說明fkbM基因的突變使菌體的運動能力下降。

3結(jié)論與討論

fkbM基因存在于Xoo基因中的鞭毛糖基化島的基因簇中，其具體生物學(xué)功能尚不明確，由于其處于鞭毛糖基化島基因簇當中，因此可能對鞭毛蛋白產(chǎn)生影響。該研究成功構(gòu)建了水稻白葉枯病菌鞭毛蛋白糖基化島fkbM基因缺失的突變體，并構(gòu)建了相應(yīng)的互補菌株，發(fā)現(xiàn)fkbM基因缺失能夠減弱Xoo的運動能力。

通過生物信息學(xué)分析，fkbM基因是一個甲基化轉(zhuǎn)移酶，分子量預(yù)測39 ku。通過對水稻白葉枯病菌鞭毛蛋白的提取，SDS-PAGE與Western Blot檢測時發(fā)現(xiàn)，分子量大小為45 ku，說明蛋白存在著修飾。另外發(fā)現(xiàn)fkbM基因突變菌株鞭毛蛋白與rbfC基因突變體鞭蛋白均能夠引起鞭毛蛋白分子量減小。rbfC基因是一個糖基轉(zhuǎn)移酶，根據(jù)現(xiàn)有研究可知，丁香假單胞菌的鞭毛糖基化島基因簇由3個基因〖STBX〗（orf1～orf3）組成，其中orf1和orf2是糖基轉(zhuǎn)移酶基因[4-5]，在丁香假單胞菌缺失糖基轉(zhuǎn)移酶基因后，由于鞭毛蛋白缺少糖基化修飾，鞭毛分子量也減小?？梢酝茰yfkbM基因或rbfC基因的缺失影響了白葉枯病菌鞭毛蛋白糖基化的修飾，進一步導(dǎo)致水稻白葉枯病菌鞭毛蛋白分子量減小。fkbM基因的缺失，影響了鞭毛分子量的大小，同時已知蛋白糖基化能夠影響蛋白的三維結(jié)構(gòu)[6]，可以推測當fkbM基因缺失，鞭毛糖基化過程也受到了影響，從而影響了鞭毛蛋白的構(gòu)象，進一步影響了鞭毛的游動。通過研究fkbM基因?qū)oo運動性的影響發(fā)現(xiàn)，細菌運動性通常與致病性存在緊密聯(lián)系。該研究對水稻白葉枯病菌致病機理提供了新的發(fā)現(xiàn)，能為研究水稻白葉枯病菌致病機理打下基礎(chǔ)。

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