楊天龍 王淑玲 顧招兵 朱仁俊 劉旭川 張春勇 楊舒黎 毛華明 冷靜

摘要：【目的】從分子生物學(xué)水平對獨龍牛的瘤胃纖維素酶基因資源進行篩選及酶學(xué)特性研究，為后續(xù)開發(fā)利用新的纖維素酶提供參考依據(jù)，也為揭示瘤胃微生物降解纖維素的作用機理打下基礎(chǔ)?！痉椒ā刻崛—汖埮Ａ鑫肝⑸镏械拇笃位蚪MDNA，構(gòu)建瘤胃微生物基因組文庫，并進行纖維素酶活性篩選，篩選獲得的高活性基因經(jīng)測序后進行生物信息學(xué)分析與酶學(xué)性質(zhì)研究?！窘Y(jié)果】從獨龍牛瘤胃中共獲得20352個陽性克隆，白斑率達92%，構(gòu)建的瘤胃微生物基因組文庫容量899.6 Mb，空載率1.82%。從瘤胃微生物基因組文庫篩選獲得2個具有纖維素酶活性的陽性克?。˙1和B2），其中，B1基因序列長1230 bp，編碼409個氨基酸，基因編碼產(chǎn)物與來自Ruminococcus albus纖維素酶基因編碼產(chǎn)物（β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，GenBank登錄號P23661.1）的覆蓋率高達99%，其同源性高達97%；B2基因序列長1002 bp，編碼333個氨基酸，基因編碼產(chǎn)物與Uncultured microorganism纖維素酶基因編碼產(chǎn)物（纖維糊精酶，GenBank登錄號ADB80112.1）的覆蓋率高達99%，其同源性為83%。B1和B2基因可在Rosetta原核表達宿主菌中成功誘導(dǎo)表達，B1纖維素酶的最適pH為6.0，最適溫度40 ℃；B2纖維素酶的最適pH為6.0，最適溫度40～50 ℃?！窘Y(jié)論】從構(gòu)建的獨龍牛瘤胃微生物基因文庫中篩選獲得2株具有較高活力的纖維素酶（B1和B2），其中，B1為β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，而B2為新的纖維糊精酶，可為纖維素的體外降解提供新型材料。

關(guān)鍵詞： 獨龍牛瘤胃；基因文庫；纖維素酶；克隆

中圖分類號： S823.89 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）05-0901-06

Gene clone of Gayal rumen bacteria cellulase

YANG Tian-long 1， WANG Shu-ling 1， GU Zhao-bing 2， ZHU Ren-jun2， LIU Xu-chuan 2， ZHANG Chun-yong 1，2， YANG Shu-li1，2， MAO Hua-ming 1，2， LENG Jing 1，2 *

（1 Yunnan Provincial Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science， Kunming 650201， China； 2 College of Animal Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract：【Objective】Rumen bacteria cellulase gene resources of Gayal were selected and enzymatic characteristics were studied from molecular biology level， so as to provide reference for development and utilization of new cellulases， and lay foundation for revealing the machenism of cellulose degradation. 【Method】Large fragment genome DNA was extracted from Gayal rumen microorganisms to establish rumen microorganism gene library and select cellulase activity. The selected genes with high activity were sequenced， and studied in bioinformatics and enzymatic characteristics. 【Result】20352 positive clones were obtained， the white spot rate reached 92%， the library capacity was 899.6 Mb， no load rate was 1.82%. Two positive clones with cellulase activity were obtained（B1 and B2）. B1 gene sequence length was 1230 bp， encoding 409 amino acids， the coverage rate of its encoding product and encoding product from Ruminococcus albus cellulase gene（β-1，4-endoglucanase， GenBank accession number P23661.1） reached 99%， and their homology was up to 97%. B2 gene sequence length was 1002 bp， encoding 333 amino acids， coverage rate of its encoding product and encoding product from Uncultured microorganism cellulase gene（cellodextrinase， GenBank accession number ADB80112.1） reached 99% and homology was 83%. B1 and B2 genes could be induced in Rosetta prokaryotic expression host bacteria. The optimum conditions for B1 cellulase were pH 6.0 and temperature 40 ℃， and for B2 cellulase were pH 6.0 and temperature 40-50 ℃. 【Conclusion】Two strains with high-activity cellulase（B1 and B2） are selected from rumen microorganism gene library established. B1 is β-1，4-endoglucanase and B2 is cellodextrinase. They can serve as new materials for degradation of crude fiber in vitro.

Key words： Gayal rumen； genomic library； cellulase； clone

0 引言

【研究意義】纖維素和半纖維素在自然界中儲備量極大，是含量最多的可再生資源，其開發(fā)利用被認為是緩解能源問題的最有效途徑之一（陳富榮等，2010）。纖維素酶是指能有效降解纖維素的一系列酶總稱（范東等，2016），根據(jù)其組成與功能一般分為內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。這3種酶通過協(xié)同作用可將纖維素進行有效降解（Jeffries et al.，2007）。纖維素酶除了在降解纖維素類生物質(zhì)方面發(fā)揮重要作用外，在其他工業(yè)領(lǐng)域也具有很高的應(yīng)用價值，如在飼料、食品、紡織、造紙、環(huán)保、醫(yī)藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用（Cha et al.，2007；Li et al.，2009）。纖維素酶的來源非常廣泛，原生動物、微生物（細菌、真菌、古菌、放線菌等）均具有合成與分泌纖維素酶的能力（Bhat and Bhat，1997），但因其穩(wěn)定性、活性、靈敏度等的局限，目前尚無法滿足工業(yè)生產(chǎn)需求（Ko et al.，2011）。因此，需要發(fā)掘新型高效纖維素酶以解決粗纖維和生物燃料轉(zhuǎn)化的瓶頸問題。【前人研究進展】至今，有關(guān)反芻獸瘤胃微生物的分離鑒定研究已有較多報道。Krause和Russell（1996）通過多樣性分析，發(fā)現(xiàn)從瘤胃中分離獲得的主要微生物有20多種；Stevenson和Weimer（2007）通過16S rRNA檢測，發(fā)現(xiàn)黃色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌等優(yōu)勢菌僅占瘤胃微生物的很小一部分。采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法，自然界99%的微生物無法在實驗室中分離培養(yǎng)（Kellenberger，2001），進而限制了人們對瘤胃微生物種類及作用的認識。宏基因組學(xué)、宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新型組學(xué)技術(shù)不依賴分離培養(yǎng)，可直接用于研究瘤胃微生物的DNA和RNA。朱雅新等（2007）成功構(gòu)建了荷斯坦奶牛瘤胃微生物元基因組BAC文庫，并從BAC文庫中篩選出16個具有淀粉酶活性的陽性克隆和26個具有纖維素酶活性的陽性克隆。姜海琴等（2015）從已構(gòu)建的安徽白山羊基因文庫中篩選出1個新型纖維素酶基因，以pET28a（+）為載體、大腸桿菌BL21（DE3）為表達宿主菌，經(jīng)1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)7 h后融合蛋白大量表達。此外，還可通過組學(xué)手段研究微生物的結(jié)構(gòu)與功能。Güllert等（2016）采用宏基因組與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合的方法分析工業(yè)沼氣罐、奶牛瘤胃和大象糞便，結(jié)果顯示，沼氣罐中厚壁菌門（Firmicutes）∶擬桿菌門（Bacteroidetes）為2.8∶1.0，在大象糞便中為1.0∶1.0，在牛瘤胃中為1.4∶1.0，因此認為厚壁菌門與擬桿菌門比例越接近1.0∶1.0，越能提高纖維素的水解能力?！颈狙芯壳腥朦c】獨龍牛主產(chǎn)于我國云南貢山縣獨龍江一帶，以竹子、蘆葦、雜草等粗纖維含量高的植物為食。由于長期生活在惡劣的環(huán)境下，獨龍牛形成了耐粗飼、抗高寒等極強的抗逆特性（Deng et al.，2007；Xi et al.，2007），但這種特性是否與其瘤胃微生物密切相關(guān)（Krause et al.，2003）仍有待進一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過構(gòu)建獨龍牛瘤胃微生物的宏基因文庫，從分子生物學(xué)水平對獨龍牛的瘤胃纖維素酶基因資源進行篩選及酶學(xué)特性研究，以期為后續(xù)開發(fā)利用新的纖維素酶提供參考依據(jù)，也為揭示瘤胃微生物降解纖維素的作用機理打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 獨龍牛瘤胃微生物基因文庫構(gòu)建

從云南貢山縣（東經(jīng)98°39′99″，北緯27°46′15″，海拔2260 m）采集5頭獨龍牛的瘤胃內(nèi)容物，采集樣品-80 ℃保存。取50 g瘤胃樣品與135 mL DNA提取溶液[100 mmol/L Tris/NaCl，pH 8.0，100 mmol/L EDTA-Na，100 mmol/L NaH2PO4，1.5 mol/L NaCl，1%十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）]混合，參照Rondon等（2015）的方法提取瘤胃微生物大片段基因組DNA。以瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化和回收10～100 kb的DNA，與pCC1BAC載體連接，經(jīng)脫鹽與電轉(zhuǎn)后涂布于LB培養(yǎng)基（氯霉素12.5 μg/mL，X-Gal 40 μg/mL，APTG 0.4 mmol/L）上，構(gòu)建獨龍牛瘤胃微生物基因文庫。

1. 2 文庫纖維素酶基因篩選

對構(gòu)建的獨龍牛瘤胃微生物基因文庫進行庫容量和穩(wěn)定性分析，并采用剛果紅染色法對該文庫進行酶活性篩選（Teather and Wood，1982；鐘國祥等，2015），根據(jù)菌落周圍的水解圈直徑分析其產(chǎn)酶性能。將陽性克隆抽提質(zhì)粒，用Not I于37 ℃下酶切，酶切產(chǎn)物以瓊脂糖凝膠電泳進行檢測；同時用Hind III和BamH I對陽性克隆質(zhì)粒插入片段的多樣性進行檢測。

1. 3 纖維素酶基因表達分析

1. 3. 1 纖維素酶序列分析與鑒定 將篩選出具有纖維素酶活性的陽性克隆送至華大基因公司進行測序，測序結(jié)果通過ExPASy（http：//www.expasy.org/tools/pi_

tool.html）預(yù)測其編碼蛋白的等電點和分子量，采用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）對編碼的蛋白序列進行結(jié)構(gòu)域分析，最后用GenBank數(shù)據(jù)庫中的BLAST進行同源性比對分析。

1. 3. 2 纖維素酶基因克隆與表達 針對從瘤胃微生物基因文庫中篩選獲得的纖維素酶基因設(shè)計特異引物序列進行PCR擴增。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，進行雙酶切鑒定和回收，與pET28-a載體連接后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞，篩選陽性重組質(zhì)粒進行測序，以驗證序列的正確性。

1. 4 酶學(xué)性質(zhì)研究

酶活性測定：采用羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）法測定酶活性，即向25.0 mL具塞試管中加入1.5 mL的1% CMC-Na溶液（以0.2 mol/L HAc-NaAc緩沖液配制，pH 4.6），置于40 ℃水浴中預(yù)熱5 min，加0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液，40 ℃反應(yīng)30 min，加入DNS試劑，沸水浴顯色后定容至25.0 mL，搖勻。以相同條件下沸水浴滅活5 min的酶液為空白對照，在540 nm波長處測定吸光值，然后在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得生成的葡萄糖量。在上述反應(yīng)條件下，1 min水解CMC-Na產(chǎn)生1 μg葡萄糖的酶用量定義為1個酶活性單位，以U表示。

酶最適pH測定：分別配制pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液，按照上述方法測定在40 ℃下不同pH緩沖液中的酶活性。酶最適溫度測定：在酶最適pH條件下測定25、30、35、40、45、50、55和60 ℃等溫度下的酶活性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 獨龍牛瘤胃微生物基因文庫構(gòu)建及纖維素酶基因克隆篩選結(jié)果

以瓊脂糖凝膠回收試劑盒收集10～100 kb的酶切DNA片段，得到0.1～0.4 μg/mL獨龍牛瘤胃液DNA。然后與酶切處理好的pCC1BAC載體進行連接，經(jīng)脫鹽與電轉(zhuǎn)后最終獲得含20352個陽性克隆的瘤胃微生物基因組文庫，白斑率達92%。

從獨龍牛瘤胃微生物基因組文庫20352個克隆中隨機挑取55個克隆的質(zhì)粒進行Hind Ⅲ酶切，結(jié)果統(tǒng)計得到空載1個（空載率1.82%），構(gòu)建的文庫容量899.6 Mb。隨機挑取插入片段較合適的3個克隆進行4次連續(xù)轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，并對Hind Ⅲ酶切指紋圖譜進行對比分析，未發(fā)現(xiàn)有任何2個克隆的Hind Ⅲ酶切指紋圖譜存在明顯變化，充分證明克隆能穩(wěn)定繁殖。從構(gòu)建的獨龍牛瘤胃微生物基因文庫挑選出5200個克隆，結(jié)果獲得2個具有纖維素酶活性的陽性克隆，分別命名為B1和B2。

2. 2 纖維素酶基因的序列測定分析結(jié)果

將具有纖維素酶活性的2個陽性克隆送至華大基因公司測序，得到的測序峰峰值較單一（圖1）。B1和B2基因經(jīng)驗證測序后，通過NCBI上的ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/）細菌蛋白翻譯尋找開放閱讀框，得知B1纖維素酶編碼基因長1230 bp，編碼409個氨基酸；B2纖維素酶編碼基因長1002 bp，編碼333個氨基酸。ExPASy預(yù)測結(jié)果顯示，B1理論等電點為4.41，分子量45517.64 Da；B2理論等電點為5.11，分子量38934.68 Da。SMART分析結(jié)果表明，B1蛋白的氨基酸序列顯示第1～23個氨基酸是信號肽，第86～373個氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域；B2蛋白的氨基酸序列顯示第1～23個氨基酸是信號肽，第30～331個氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域。BLAST分析得知，B1基因編碼產(chǎn)物與來自Ruminococcus albus纖維素酶基因編碼產(chǎn)物（β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，GenBank登錄號P23661.1）的覆蓋率高達99%，其同源性最高達97%，而與其他來自不同細菌纖維素酶基因編碼產(chǎn)物的同源性均低于90%（圖2）；B2基因編碼產(chǎn)物與Uncultured microorganism纖維素酶基因編碼產(chǎn)物（纖維糊精酶，GenBank登錄號ADB80112.1）的覆蓋率達99%，同源性最高達83%，而與其他來自不同細菌纖維素酶基因編碼產(chǎn)物的同源性均低于70%（圖3）。

2. 3 纖維素酶基因的克隆與原核表達

經(jīng)重組質(zhì)粒pET28a-B1/B2轉(zhuǎn)化的Rosetta原核表達宿主菌，以1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達5 h后收集菌體，經(jīng)超聲波破碎，離心收集沉淀和上清液。分別取80 μL上清液和溶解沉淀，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，發(fā)現(xiàn)重組菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，B1和B2融合蛋白分別在分子量約45.5和38.9 kD處有一條明顯條帶（圖4），而空載體宿主菌在誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后幾乎沒有區(qū)別，與預(yù)期結(jié)果一致。

2. 4 B1和B2融合蛋白的酶學(xué)特性

超聲波破碎后離心收集的上清液用孔徑0.22 μm的濾器過濾，所得液體即為粗酶液，4 ℃保存或直接用于酶活性測定。在40 ℃水浴條件下，分別測定B1和B2纖維素酶在pH為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0和8.0時的酶活性，結(jié)果（圖5）表明，B1和B2纖維素酶的最適pH在6.0左右。在pH 6.0的條件下，分別測定B1和B2纖維素酶在溫度為25、30、35、40、45、50、55、60、65和70 ℃時與底物反應(yīng)30 min的酶活性，結(jié)果（圖6）表明，B1纖維素酶的最適反應(yīng)溫度在40 ℃左右，B2纖維素酶的最適反應(yīng)溫度在40～50 ℃。

3 討論

纖維素是地球上分布最廣、含量最高的生物質(zhì)和糖類資源。但由于技術(shù)上的局限，人們對纖維素的利用仍然十分有限。反芻動物能高效利用纖維素，這種特有的消化功能是由其瘤胃內(nèi)大量的微生物所賦予。目前，已從牛的瘤胃中提取獲得一些纖維素酶（Liu et al.，2009；Shedova et al.，2009；Bao et al.，2011）。本研究通過提取獨龍牛瘤胃未培養(yǎng)微生物的基因組DNA，成功構(gòu)建了一個宏基因組文庫，隨后進行活性篩選得到2個纖維素酶陽性克隆（B1和B2），經(jīng)原核表達能獲得與預(yù)期結(jié)果一致的目的融合蛋白，說明B1和B2基因能在原核生物中誘導(dǎo)表達。

至今，關(guān)于β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶的研究較多，并證實內(nèi)切葡聚糖酶是影響革蘭氏陰性內(nèi)生細菌定殖的主要因素之一（Reinhold-Hurek et al.，2006）。范曉靜等（2014）研究表明，內(nèi)生芽孢桿菌BS2菌株β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶活力與其在小白菜體內(nèi)的定殖數(shù)量呈正相關(guān)，隨著β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶表達量的增加，內(nèi)生芽孢桿菌BS2菌株的定殖效果越優(yōu)。本研究采用BLAST進行同源性比對分析，發(fā)現(xiàn)B1基因編碼產(chǎn)物與來自Ruminococcus albus纖維素酶基因編碼產(chǎn)物（β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶）的覆蓋率高達99%，其同源性高達97%。表明某些纖維素酶除了專一地對底物直接作用外，在增強定殖效果方面還具有很強的促進作用，可經(jīng)改造后進一步開發(fā)利用。纖維素降解體系是一個多酶協(xié)同作用體系，每種酶都在發(fā)揮各自的作用（Mach-Aigner et al.，2008；Harris et al.，2010；Hori et al.，2011；Langston et al.，2011）。在纖維糊精酶基因研究方面，莊永紅等（2008）將編碼纖維糊精酶DM1（GenBank索引號ACA61162）的催化功能域DNA序列與其他3種菌合成的纖維素結(jié)合功能域和連接橋的DNA序列進行融合，構(gòu)建了3個融合酶基因，并分別在大腸桿菌BL21菌株中得到過量表達，但對纖維素的水解效果不理想。本研究結(jié)果表明，B2基因編碼產(chǎn)物與Uncultured microorganism纖維素酶基因編碼產(chǎn)物（纖維糊精酶）的覆蓋率達99%，同源性達83%；其最適pH在6.0左右，最適溫度在40～50 ℃，其他酶學(xué)特性有待進一步探究。

雖然目前已有纖維素酶在瘤胃中被發(fā)現(xiàn)與利用（朱雅新等，2007；陳富榮等，2010；姜海琴等，2015），且一些纖維素酶經(jīng)改造后可投入生產(chǎn)，但高效纖維素酶缺乏仍是粗纖維利用的瓶頸。本研究篩選獲得的B2基因經(jīng)鑒定為一個新型纖維素酶基因，其編碼產(chǎn)物的酶活力強，具有較高的研究價值，可為纖維素的體外降解提供新型材料。

4 結(jié)論

從構(gòu)建的獨龍牛瘤胃微生物基因文庫中篩選獲得2株具有較高活力的纖維素酶（B1和B2），其中，B1為β-1，4-內(nèi)切葡聚糖酶，而B2為新的纖維糊精酶，可為纖維素的體外降解提供新型材料。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）