王偉 盧珊 葛冰 郜愛玲 金荷仙

摘 要 為篩選出大苞鞘石斛組培快繁體系各階段最適培養(yǎng)基配方，以大苞鞘石斛無菌苗莖段為外植體，通過正交試驗研究不同因素對大苞鞘石斛植株再生的影響。結果表明：擬原球莖誘導最適培養(yǎng)基為1/2MS+2，4-D 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，誘導出的擬原球莖直徑1.5 mm時將其從莖段上剝離，并接入原培養(yǎng)基繼續(xù)誘導15～20 d；擬原球莖增殖最適培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，繼代周期25～30 d；擬原球莖分化最適培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，分化培養(yǎng)需40 d；將分化的無菌苗繼代于花寶2號3 g/L+蛋白胨2 g/L+IBA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%生根誘導效果最好，培養(yǎng)45 d；生根壯苗最佳培養(yǎng)基為花寶1號3 g/L+蛋白胨2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭1 g/L，培養(yǎng)50 d。

關鍵詞 大苞鞘石斛；組織培養(yǎng)；再生體系；擬原球莖

中圖分類號 Q943.1 文獻標識碼 A

Abstract In order to study the effects of different factors on the tissue culture and plant regeneration of Dendrobium wardianum， three kinds of factors of three levels were used by an orthogonal design. The stem segments of D. wardianum were used as the explants for tissue culture. Results showed that the optimum PLBs induction medium was 1/2MS+2，4-D 0.2 mg/L+Sugar 30 g/L. When the shoot bud diameter reached to 1.5 mm， it must be detached and transferred to the same media for 15-20 days. The optimum medium for PLBs proliferation was 1/2MS+NAA 1 mg/L+Sugar 30 g/L+CW 10% and the appropriate subculture cycle was about 25 to 30 days. The optimum PLBs differentiation medium was 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+Sugar 30 g/L+CW 10%. The aseptic seedling which obtained from the former culture stage was cultured on the root induction media of Hyponex No.2 3 g/L+Peptone 2 g/L+IBA 1 mg/L+Sugar 30 g/L+CW 10% for 45 days. The optimal medium of strong plantlets and rootage was Hyponex No.1 3 g/L+Peptone 2 g/L+Sugar 30 g/L+Activated carbon 1 g/L.

Key words Dendrobium wardianum； tissue culture； regeneration system； PLBs

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.04.011

大苞鞘石斛（Dendrobium wardianum L.）又名騰沖石斛，藥用商品名為扁黃草[1]，含dendrowardine等生物堿[2]、多糖[3]、氨基酸及微量元素等活性成分[4-5]，產于中國云南高海拔地區(qū)，常附生于樹干上，對生境要求苛刻，自然狀態(tài)下繁育率極低，加之常被作為觀賞植物和中藥材使用，因此被盜挖者過度采集，野生資源數量已非常稀少。針對該現狀，對大苞鞘石斛種質資源的保護和研究逐漸引起了各界學者的重視，研究重點主要集中在組織培養(yǎng)等人工快速繁育技術的探索，通過該技術可加速種群擴繁與品種改良，Luan等[6]發(fā)現1/2MS培養(yǎng)基中添加萘乙酸（NAA）0.5 mg/L、椰乳20%、蔗糖30 mg/L可作為大苞鞘石斛無菌播種培養(yǎng)基；張小娟等[7]認為大苞鞘石斛擬原球莖可在MS（或B5）+ NAA 0.5 mg/L+6-芐基腺嘌呤（6-BA）0.2 mg/L+香蕉2.5%+椰乳2.5%+蔗糖25 g/L中進行懸浮培養(yǎng)；吳元玲等[8]、劉曉東等[9]對大苞鞘石斛擬原球莖超低溫保存技術體系進行了研究與探討；Sharma等[10]將大苞鞘石斛擬原球莖制作為人工種子且可在MS培養(yǎng)基上全部萌發(fā)；陳娜[11]、卓孝康等[12]，初步探討了大苞鞘石斛快繁體系的構建，為實現大苞鞘石斛種質資源的保護及再生奠定了基礎。

目前，對大苞鞘石斛無菌播種技術研究較為成熟，但通過外植體誘導擬原球莖的途徑建立快繁體系的研究甚少。通過大苞鞘石斛離體器官誘導擬原球莖，再利用擬原球莖的增殖分化培養(yǎng)獲得大量幼苗，這種快繁方法可建立高效的快繁體系，對推進大苞鞘石斛工廠化育苗、遺傳學和細胞學研究具有重要意義。基于此，本試驗以大苞鞘石斛無菌苗莖段為外植體，通過正交試驗設計，研究不同因素對大苞鞘石斛擬原球莖誘導、增殖與分化、生根誘導、生根壯苗等培養(yǎng)階段的影響，以期篩選出適宜的快繁方案，為大苞鞘石斛種質資源的保育和開發(fā)提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用原植物采自中國云南騰沖地區(qū)，經上海辰山植物園黃衛(wèi)昌高級工程師鑒定為蘭科石斛屬大苞鞘石斛的新鮮植株，用無菌苗是利用以上植株所結蒴果無菌播種，選取長勢健壯，莖長2 cm以上。

1.2 方法

1.2.1 擬原球莖誘導 誘導階段Ⅰ：去除無菌苗葉片和根部，將莖段切為數段，每段保留1～2個具芽點的節(jié)，接入待檢培養(yǎng)基；誘導階段Ⅱ：當芽點生長出擬原球莖后，將其剝離并置于該培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導。設置L9（33）正交試驗設計，研究不同培養(yǎng)基、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）濃度和擬原球莖剝離直徑對擬原球莖誘導的影響，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類[MS、N6、1/2MS（MS培養(yǎng)基大量元素減半）]、2，4-D（0、0.2、1.0 mg/L）和誘導階段Ⅰ擬原球莖剝離直徑（1.0、1.5、2.0 mm）。培養(yǎng)結束時，統(tǒng)計誘導結果。

誘導率/%=（誘導出擬原球莖的外植體數量/外植體總數量）×100

增殖系數=培養(yǎng)后擬原球莖總數量/接種擬原球莖數

1.2.2 擬原球莖增殖與分化 將誘導階段所得擬原球莖稱重，并利用接種勺接入增殖（分化）培養(yǎng)基。設置L9（33）正交試驗設計，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類（MS、1/2MS、N6）、NAA（0.5、1.0、2.0 mg/L）和苯基噻二唑基脲（TDZ）（0、0.02、0.1 mg/L）。培養(yǎng)結束時，統(tǒng)計擬原球莖增殖與分化結果。

鮮重增殖倍數=培養(yǎng)后擬原球莖鮮重/接種擬原球莖鮮重

擬原球莖分化率/%=（分化的擬原球莖數量/擬原球莖總數）×100

1.2.3 無菌苗生根誘導 選取已分化且莖長為15～20 mm的無菌苗（若有根需切除，將叢生芽拆分為單芽）接入生根誘導培養(yǎng)基。設置L9（33）正交試驗設計，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類[花寶1號（花寶1號3 g/L+蛋白胨2 g/L）]、花寶2號[（花寶2號3 g/L+蛋白胨2 g/L）、CHB]、吲哚丁酸（IBA）（0.5、1.0、2.0 mg/L）和6-BA（0、0.1、0.5 mg/L）。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計誘導結果。

生根率/%=（生根株數/總株數）×100

平均生根數（條）=生根根數/生根株數

1.2.4 無菌苗生根壯苗 選取已生根且莖長大于25 mm的無菌苗（若根長大于15 mm需將根切除，將叢生芽拆分為單芽）接入生根壯苗培養(yǎng)基。設置L9（33）正交試驗設計，各因素水平分別為：培養(yǎng)基種類[CHB（C）（CHB+活性炭1 g/L）、花寶1號（C）（花寶1號3 g/L+蛋白胨2 g/L+活性炭1 g/L）、花寶2號（C）（花寶2號3 g/L+蛋白胨2 g/L+活性炭1 g/L）]、IBA（0、0.5、1.0 mg/L）和蔗糖（10、30、50 g/L）。培養(yǎng)50 d后，統(tǒng)計生根情況。

平均生根數/條=生根根數/生根株數

平均根長/mm=根長總和/根總數量

1.2.5 培養(yǎng)條件 利用智能人工氣候箱進行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（23±1）℃，光照強度約2 000 Lux，光照時間16 h/d。以上待檢培養(yǎng)基每個處理分別接種8瓶，重復3次，pH5.6，附加蔗糖30 g/L（生根壯苗階段除外），椰乳10%（原球莖誘導、生根壯苗階段不添加），瓊脂7.6 g/L。

1.2.6 煉苗移栽 將生根壯苗培養(yǎng)瓶開蓋置于空調溫室[溫度（27±2）℃，光照強度約500 Lux，相對濕度60%～80%]中培養(yǎng)7 d，將苗取出洗凈，用1 000倍百菌清溶液浸泡20 min，水苔包裹其根部后種植于松皮1份、珍珠巖1份、蘭石0.5份的混合基質中（基質經高壓蒸汽滅菌消毒），并在溫室中按常規(guī)水肥管理進行苗期養(yǎng)護。

1.3 數據處理

用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件對各觀測指標進行方差分析和極差分析。

2 結果與分析

2.1 不同因素對擬原球莖誘導的影響

外植體在6 d啟動，節(jié)間部位隆起，9 d擬原球莖可見并繼續(xù)膨大，20 d擬原球莖直徑1.5 mm左右時（圖1-A），需將其從莖段上剝離，并繼續(xù)在原培養(yǎng)基中誘導。剝離并轉接3 d擬原球莖啟動，一周后增殖為8個（圖1-B），15～20 d接入增殖、分化培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)。方差分析結果表明，2，4-D對擬原球莖誘導試驗中誘導率的影響達到顯著水平，而各因素對增殖系數的影響未達到顯著水平（表1）。對擬原球莖誘導，比較各因素R值可知，對大苞鞘石斛擬原球莖增殖系數起主導作用的為擬原球莖的剝離直徑；影響擬原球莖誘導率的三因素主次程度為2，4-D>培養(yǎng)基>剝離直徑（表2）。根據各因素水平均值（ki）大小，可初步推斷影響擬原球莖誘導的最優(yōu)水平組合為1/2MS、2，4-D 0.2 mg/L、剝離直徑1.5 mm，此條件下，增殖系數為12.42，誘導率達91.67%。

2.2 不同因素對擬原球莖增殖與分化的影響

誘導出的擬原球莖團繼代后15～25 d生長最快，形成桑葚狀聚合體（圖1-C），培養(yǎng)30 d后，最早生成的擬原球莖開始分化為苗（圖1-D），而新增殖出的無芽點的擬原球莖則繼續(xù)增殖。由方差分析結果可知，NAA對鮮重增殖倍數、分化率和株高影響達到顯著差異水平（表1）。通過比較表3的R值可知，各因素中對大苞鞘石斛擬原球莖增殖與分化起主導作用為NAA。擬原球莖增殖最佳水平組合為1/2MS、NAA 1 mg/L和TDZ 0 mg/L，擬原球莖鮮重增殖倍數最大，達7.35；擬原球莖分化的最佳配方為1/2MS、NAA 0.5 mg/L和TDZ 0 mg/L，利用該水平組合在相同培養(yǎng)條件下進行驗證試驗，結果顯示擬原球莖分化率為35.71%，分化苗株高為14.39 mm，具有2葉，色澤深綠，長勢旺盛且整齊，適合作為生根誘導階段的外植體進行培養(yǎng)。

2.3 不同因素對生根誘導的影響

接入7 d，無菌苗根莖處可見不定根，25 d節(jié)間伸長開始高生長，部分幼苗生長出分蘗，45 d可繼代（圖1-E、F）。方差結果顯示，各因素對生根誘導的影響具有一定差異性，培養(yǎng)基對平均根數的影響達到顯著水平，而6-BA對生根率的影響達到顯著水平（表1）。根據表4各因素R值大小可知，影響生根率強弱的因素表現為6-BA>培養(yǎng)基>IBA；對平均根數影響大小排序為培養(yǎng)基>6-BA>IBA。生根誘導的最佳培養(yǎng)配方為花寶2號、IBA 1 mg/L和6-BA 0 mg/L，生根率達100%，平均根數為4.75條。

2.4 不同因素對生根壯苗的影響

觀察顯示，接入5～25 d無菌苗根系生長明顯，20～40 d高生長旺盛節(jié)間伸長快，少部分植株老化死亡，并由新生萌蘗接替生長，35～50 d莖稈明顯增粗（圖1-G）。由方差分析結果可知，培養(yǎng)基對莖高影響達到極顯著性水平，對莖粗影響達到顯著水平（表1）。由表5各因素R值大小可知，培養(yǎng)基對于莖高、莖粗、平均根長的影響起主導作用，而影響平均根數各因素的主次程度為蔗糖>培養(yǎng)基>IBA。大苞鞘石斛生根壯苗階段的最佳培養(yǎng)配方組合為花寶1號（C）、IBA 0 mg/L和蔗糖30 g/L。該條件下，無菌苗莖高達42.49 mm，莖粗3.26 mm，平均根數4.32條，平均根長41.43 mm。

2.5 移栽馴化培養(yǎng)

煉苗移栽培養(yǎng)30 d后，莖基部老葉易黃化脫落，69%植株已生出1片新葉，新生葉質地硬且厚（圖1-H），根生長明顯，新生根3.1條/株，且新生根易吸附于樹皮上生長，成活率為92%。

3 討論

大苞鞘石斛可利用多種組織器官誘導擬原球莖，如Sharma等[13]、陳娜[11]成功利用大苞鞘石斛莖尖、無菌萌發(fā)的種胚、幼苗根頸等誘導出了擬原球莖及可轉化為擬原球莖的愈傷組織；而本試驗成功利用大苞鞘石斛莖節(jié)上尚未分化的腋芽來誘導擬原球莖。本試驗結果顯示，在莖段上誘導出的擬原球莖需在直徑1.5 mm時剝離母體，若直徑過大或不剝離會直接分化成苗，過小則會增加死亡率；剝離母體后，誘導時間需控制在15～20 d，過長則會導致擬原球莖團變異或死亡。李守嶺等[14]研究結果發(fā)現，利用齒瓣石斛莖段誘導擬原球莖無需剝離即可在莖節(jié)處增殖，可能是由于培養(yǎng)條件（如激素種類）或外植體基因型導致。

擬原球莖增殖分化階段為石斛屬植物擴繁的關鍵時期，研究表明，外源激素、碳源類型和濃度[15-16]、多胺類物質[17-18]、光照條件[19]、超聲處理[20]和低溫處理[15]都對石斛擬原球莖增殖分化有促進作用。其中，激素處理是最常使用的方法，研究者常添加細胞分裂素并配合一定量的生長素提高增殖分化效果，王一諾等[21]認為重唇石斛增殖效果最佳激素組合為6-BA 2.0 mg/L+6-糠氨基嘌呤（KT）0.2 mg/L+NAA 0.4 mg/L，徐玲等[22]發(fā)現鐵皮石斛擬原球莖分化添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L效果最好。但本試驗結果顯示，大苞鞘石斛僅添加NAA 1 mg/L擬原球莖增殖效果最好，NAA 0.5 mg/L分化效果最好，該結果與尹明華等[23]研究結果相似，認為NAA濃度低有利于鐵皮石斛擬原球莖分化，濃度提升有利于增殖。

IBA為石斛屬植物生根誘導中常用的外源激素，本試驗結果顯示，大苞鞘石斛生根誘導最佳濃度為1 mg/L IBA；而生根壯苗階段則采用無激素培養(yǎng)，可能是由于大苞鞘石斛較易產生不定根，且誘導階段無菌苗體內已有IBA積存。蔗糖在組培中的作用主要為提供碳源和調節(jié)滲透壓，根據培養(yǎng)目的和外植體的不同，蔗糖濃度也需要調整，李璐等[24]研究結果顯示，無激素的1/2MS培養(yǎng)基中添加白糖20 g/L有利于春石斛壯苗生根，添加白糖10 g/L適宜鐵皮石斛壯苗生根，而本試驗中生根壯苗蔗糖最適濃度為30 g/L。

4 結論

本試驗結果表明，（1）誘導階段：以大苞鞘石斛具有1～2個芽點的無菌苗莖段為外植體，接入擬原球莖誘導培養(yǎng)基1/2MS+2，4-D 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L，當節(jié)間誘導出的擬原球莖直徑達1.5 mm時將其剝離，并接入原培養(yǎng)基繼續(xù)誘導15～20 d，誘導率達91.67%；（2）增殖階段：將誘導出的或繼代的擬原球莖團拆散，接入增殖培養(yǎng)基1/2MS+NAA 1 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，繼代周期25～30 d，擬原球莖鮮重增殖倍數達7.35； （3）分化階段：將擬原球莖團接入分化培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+椰乳10%，培養(yǎng)40 d，分化率達35.71%，未分化的擬原球莖團可拆散后繼續(xù)作增殖培養(yǎng)；（4）生根壯苗階段：將分化的無菌苗接入花寶2號3 g/L+蛋白胨2 g/L+IBA 1 mg/L+蔗糖 30 g/L+椰乳10%進行生根誘導，培養(yǎng)45 d，生根率達100%；而后接入花寶1號3 g/L+蛋白胨2 g/L+蔗糖30 g/L+活性炭1 g/L進行壯苗培養(yǎng)，培養(yǎng)50 d即可煉苗出瓶或作為誘導階段的外植體；（5）將生根苗煉苗后種植于松皮1份、珍珠巖1份、蘭石0.5份的混合基質中30 d，新生根3.1條/株，成活率為92%。本試驗為大苞鞘石斛快繁體系的建立及其遺傳轉化體系的建立提供了參考依據。

參考文獻

[1] 管艷紅， 馬 潔， 張麗霞， 等. 西雙版納石斛屬藥用植物資源[J]. 中國野生植物資源， 2004， 23（6）： 38-39.

[2] Glomqvist L， Brandange S， Gawell L， et al. Studies on orchidaceae alkaloids. XXXVII. Dendrowardine， a quaternary alkaloid from Dendrobium wardianum Wr[J]. Acta Chem Scand， 1973， 27： 1 439-1 441.

[3] 王再花， 章金輝， 李 杰， 等. 3種藥用石斛多糖的抗氧化活性比較研究[J]. 華南師范大學學報（自然科學版）， 2015， 47（5）： 65-70.

[4] 李安華， 周志宏， 沈 妍， 等. 大苞鞘石斛化學成分研究[J]. 天然產物研究與開發(fā)， 2012， 24（4）： 479-480.

[5] 章金輝， 王再花， 李 杰， 等. 大苞鞘石斛與鐵皮石斛主要活性成分比較分析[J]. 熱帶作物學報， 2015， 36（12）： 2 192-2 197.

[6] Luan V Q， Thien N Q， Khiem D， et al. In Vitro germination capacity and plant recovery of some native and rare orchids[C]. Proceedings of International workshop on biotechnology in agriculture. Nong Lam University Ho Chi Minh City. Vietnam， 2006： 175-177.

[7] 張小娟， 卓孝康， 胡慶林， 等. 大苞鞘石斛原球莖懸浮培養(yǎng)研究[J]. 中國園藝文摘， 2016， 32（11）： 5-8， 178.

[8] 吳元玲， 申曉輝. 大苞鞘石斛原球莖玻璃化超低溫保存技術的研究[J]. 中國細胞生物學學報， 2011， 33（3）： 279-287.

[9] 劉曉東， 李曉丹， 吳元玲， 等. 大苞鞘石斛原球莖超低溫保存中生理生化變化[J]. 東北林業(yè)大學學報， 2013， 41（7）： 79-84.

[10] Sharma A， Tandon P， Anjani K. Regeneration of Dendrobium wardianum warner （orchidaceae） from synthetic seeds[J]. Indian Journal of Experimental Biology， 1992， 30： 747-748.

[11] 陳 娜. 兩種石斛植物再生體系構建及形態(tài)發(fā)生的研究[D]. 南京： 南京林業(yè)大學， 2008： 13-34.

[12] 卓孝康， 蘭思仁， 彭東輝， 等. 大苞鞘石斛胚組織培養(yǎng)及植株再生研究[J]. 福建林學院學報， 2014， 34（4）： 289-296.

[13] Sharma A， Tandon P. In vitro culture of Dendrobium Wardianum： MorpHogenetic effects of some nitrogenous adjuvats[J]. Indian Journal Plant Physiol.， 1992， 35（1）： 80-85.

[14] 李守嶺， 王應清， 高 燕， 等. 齒瓣石斛原球莖誘導及植株再生技術試驗[J]. 熱帶農業(yè)科技， 2013， 36（3）： 28-29， 46.

[15] Luo J P， Christoph W， Brigitte K. Enhanced micropropagation of Dendrobium huoshanense C.Z. Tang et S.J. Cheng through protocorm-like bodies： The effects of cytokinins， carbohydrate sources and cold pretreatment[J]. Scientia Horticulturae， 2009， 123（2）： 258-262.

[16] Panisa P， Ronnawich S， Pongsathorn C， et al. Improving the micropropagation efficiency of hybrid Dendrobium orchids with chitosan[J]. Scientia Horticulturae， 2010， 124（4）： 490-499.

[17] Wang Y， Luo J P， Wu H Q， et al. Conversion of protocorm-like bodies of Dendrobium huoshanense to shoots： The role of polyamines in relation to the ratio of total cytokinins and indole-3-acetic acidindole-3-acetic acid[J]. Journal of Plant Physiology， 2009， 166： 2 013-2 022.

[18] Wei M， Wei S H， Yang C Y. Effect of putrescine on the conversion of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale to shoots[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2010， 102（2）： 145-151.

[19] Lin Y， Li J， Li B， et al. Effects of light quality on growth and development of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale in vitro[J]. Plant Cell， Tissue and Organ Culture， 2011， 105（3）： 329-335.

[20] Wei M， Yang C Y， Wei S H. Enhancement of the differentiation of protocorm-like bodies of Dendrobium officinale to shoots by ultrasound treatment[J]. Journal of plant physiology， 2012， 169（8）： 770-774.

[21] 王一諾， 李林軒， 韋 瑩， 等. 不同濃度激素配比對重唇石斛組織培養(yǎng)的影響[J]. 北方園藝， 2016（10）： 148-151.

[22] 徐 玲， 陳自宏， 楊曉娜， 等. 不同有機附加物對鐵皮石斛原球莖增殖和組培苗生根壯苗的影響[J]. 云南農業(yè)大學學報（自然科學）， 2016， 30（2）： 250-256.

[23] 尹明華， 聶鳳琴， 胡文韜， 等. NAA和KT對鐵皮石斛原球莖增殖與分化的影響[J]. 黑龍江農業(yè)科學， 2011（8）： 25-26.

[24] 李 璐， 賴鐘雄， 翁 浩. 春石斛和鐵皮石斛試管苗壯苗生根條件的優(yōu)化[J]. 福建農林大學學報（自然科學版）， 2011， 40（1）： 31-36.