鉛誘導(dǎo)蠶豆根尖細(xì)胞產(chǎn)生的各種染色體畸變研究

張英慧

摘要[目的]研究鉛對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的各種染色體畸變。[方法]用不同濃度的PbCl2溶液培養(yǎng)蠶豆種子，以蒸餾水培養(yǎng)作為對(duì)照，培養(yǎng)4～7 d，每天隨機(jī)取根尖固定、染色、壓片后鏡檢，觀察各種染色體畸變，并統(tǒng)計(jì)相應(yīng)的數(shù)目。[結(jié)果]培養(yǎng)第4～7天，1.0×10-4～5.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的各種染色體畸變數(shù)目都高于對(duì)照組的染色體畸變數(shù)目，且Pb2+濃度越大，染色體畸變數(shù)目越多。[結(jié)論]Pb2+對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變的影響程度與Pb2+處理濃度以及處理時(shí)間有關(guān)。

關(guān)鍵詞鉛；蠶豆；染色體畸變

中圖分類(lèi)號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）35-0130-06

Abstract[Objective] To study the effects of Pb2+ on the different chromosomal aberrations of Vicia faba root tip cells. [Method] Vicia faba seeds were cultured with PbCl2 solutions at different concentration， and distilled water treatment as control. The root tips were fixed， dyed and squashed for microscopic examination. [Result] When seeds were treated with 1.0×10-4-5.0×10-4 mol/L Pb2+ when culturing 4-7 days，the chromosomal aberrations of Vicia faba were higher than the control group.The chromosomal aberrations increased successively with increasing Pb2+ concentration. [Conclusion] The influence degree of Pb2+ on chromosomal aberrations of Vicia faba root tip cells is related to Pb2+ concentration and treating time.

Key wordsPb2+；Vicia faba；Chromosomal aberration

染色體形態(tài)在細(xì)胞周期中是動(dòng)態(tài)變化的，在細(xì)胞周期不同時(shí)相中染色體形態(tài)各不相同。分裂中后期的染色體是研究細(xì)胞遺傳毒理的重要材料。染色體畸變是外界環(huán)境有害因子作用于機(jī)體或培養(yǎng)的細(xì)胞后所致最常見(jiàn)的細(xì)胞染色體損傷指標(biāo)之一，是細(xì)胞遺傳毒理學(xué)研究中最常用的檢測(cè)手段之一。

鉛是植物的非必需元素，當(dāng)它與植物接觸后就會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生一定的毒害作用，輕則使植物體內(nèi)的代謝過(guò)程發(fā)生紊亂，生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，重則導(dǎo)致植物死亡。目前，已有很多關(guān)于鉛對(duì)蠶豆根尖有絲分裂指數(shù)的影響和鉛誘發(fā)蠶豆根尖細(xì)胞微核形成等方面的研究[1]。筆者以蠶豆為試驗(yàn)材料，研究了鉛對(duì)蠶豆根尖細(xì)胞染色體畸變率的影響，以便更好地探討鉛對(duì)植物的毒害機(jī)理。

1材料與方法

1.1材料

供試蠶豆品種為“成胡15”（Vicia faba，2n=12）。

1.2方法

蠶豆種子經(jīng)0.5%次氯酸鈉（分析純，北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）表面消毒，蒸餾水洗凈，分別在10×10-4、2.5×10-4、50×10-4 mol/L PbCl2（分析純，溫州市化學(xué)用料廠）溶液中進(jìn)行水培，以蒸餾水培養(yǎng)作為對(duì)照。每組培養(yǎng)200粒蠶豆，每組用8個(gè)培養(yǎng)皿，每皿25粒，培養(yǎng)時(shí)間為7 d。培養(yǎng)4～7 d，每天定時(shí)從每組中隨機(jī)取出2培養(yǎng)皿蠶豆，切取根尖，改良Carnoys固定液室溫固定，0.1 mol/L鹽酸解離，改良苯酚品紅染色，壓片，Nikon FX-35WA光學(xué)顯微鏡下觀察蠶豆根尖分生組織區(qū)細(xì)胞有絲分裂，每組觀察8個(gè)根尖，每個(gè)根尖觀察500個(gè)以上細(xì)胞（每組共觀察4 000個(gè)以上細(xì)胞），觀察微核和染色體畸變。

2結(jié)果與分析

2.1鉛處理蠶豆根尖細(xì)胞后導(dǎo)致多種類(lèi)型的染色體變異

鉛處理蠶豆根尖細(xì)胞后可導(dǎo)致多種類(lèi)型的變異，包括微核的出現(xiàn)和染色體畸變，染色體畸變包括染色體斷片、染色體橋、落后染色體、多極分裂和染色體環(huán)等多種類(lèi)型。正常的蠶豆根尖細(xì)胞如圖1、2所示。

鉛對(duì)蠶豆根尖分生組織細(xì)胞有絲分裂產(chǎn)生影響，在細(xì)胞周期中的間期、前期、中期、后期及末期均發(fā)現(xiàn)異?，F(xiàn)象。

2.1.1微核。細(xì)胞分裂間期的異常主要表現(xiàn)為微核，各組間期微核占間期異常的百分比均為100%，其中有單微核和雙微核（圖3，4），有些細(xì)胞只見(jiàn)微核（圖5）。細(xì)胞分裂前期和中期也有微核的出現(xiàn)。細(xì)胞分裂后期的微核有的位于分向兩極的2組染色體之間（圖6），有的位于2組染色體一側(cè)（圖7），有的位于細(xì)胞邊緣（圖8，9）。

2.1.2

染色體斷片。有絲分裂后期許多細(xì)胞中出現(xiàn)了染色體斷片，有的細(xì)胞含有1個(gè)斷片（圖10），有的細(xì)胞含有2個(gè)斷片（圖11），有的細(xì)胞含有3個(gè)斷片（圖12），數(shù)量最多的是1個(gè)細(xì)胞含有1個(gè)斷片。

2.1.3

染色體橋。染色體橋的形成是細(xì)胞分裂異常和染色體畸變的主要特征之一。橋是由于染色體斷裂再融合形成的，當(dāng)2個(gè)染色單體的著絲粒已經(jīng)分別移向相對(duì)的兩極后，二者的臂仍黏在一起，形成后期橋。Pb2+誘發(fā)的蠶豆根尖細(xì)胞的染色體橋有單橋（圖13）、雙橋（圖8）、三橋（圖9）等類(lèi)型。

2.1.4落后染色體。有絲分裂后期，正常細(xì)胞的染色體都移向兩極，而經(jīng)過(guò)Pb2+處理的細(xì)胞有個(gè)別染色體或染色體片段滯留于兩極之間（圖14，15，16），與染色體的主體部分移向兩極的速度和進(jìn)程不同。也有些落后染色體不是滯留在兩極中間，而是偏在一側(cè)，有三極分裂的趨勢(shì)（圖17）。

2.1.5染色體環(huán)。染色體環(huán)是由于染色體斷裂再融合形成的，在細(xì)胞分裂中期（圖18）和分裂后期（圖19，20）均有染色體環(huán)出現(xiàn)。

2.1.6多極分裂。正常的有絲分裂后期，染色體在紡錘絲的牽引下，均等地分向兩極，而經(jīng)Pb2+處理的蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂后期則出現(xiàn)了不均等的三極異常分布的分裂相（圖21，22，23），還有四極分裂（圖16），有些細(xì)胞高達(dá)六極分裂（圖24）。此外，在染色體的多極分裂相中還發(fā)現(xiàn)個(gè)別染色體游離在各極之間（圖16）。

2.2鉛處理蠶豆根尖細(xì)胞后各種類(lèi)型的染色體畸變數(shù)目

對(duì)有絲分裂后期各種類(lèi)型的染色體畸變數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，每個(gè)處理組觀察染色體400組左右，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表1～4所示，從表中可以看出，各種類(lèi)型的染色體畸變中，以染色體斷片的比例最大，其次是染色體橋和落后染色體，再次是多極分裂，所占比例最小的是染色體環(huán)。培養(yǎng)第4天，1.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的67.24%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的13.79%、10.34%、6.90%、1.72%；25×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的70.49%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的8.20%、11.48%、6.56%、328%；5.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的70.27%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的9.46%、10.81%、676%、270%（表1）。培養(yǎng)第5天，1.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的73.02%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的1111%、11.11%、4.76%、0%；2.5×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的62.03%，染色體橋、落

后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸

變數(shù)的

10.13%、17.72%、6.33%、3.80%；5.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的62.79%，染色體橋、落后染

色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的1279%、15.12%、6.98%、2.33%（表2）。培養(yǎng)第6天，1.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的67.57%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的13.51%、12.16%、405%、270%；2.5×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的59.66%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的13.45%、1765%、420%、504%；5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的63.01%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的1507%、1233%、616%、3.42%（表3）。培養(yǎng)第7天，1.0×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的68.18%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的1667%、6.06%、6.06%、3.03%；2.5×10-4 mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的69.89%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的11.83%、11.83%、4.30%、215%；5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)占總?cè)旧w畸變數(shù)的64.44%，染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)分別占總?cè)旧w畸變數(shù)的15.56%、11.11%、519%、370%（表4）。

從表中還可以看出，染色體斷片數(shù)隨著Pb2+濃度的升高而增大，具有明顯的濃度效應(yīng)，培養(yǎng)第4天，1.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)分別為39、43、52；培養(yǎng)第5天，1.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)分別為46、49、54；培養(yǎng)第6天，1.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)分別為50、71、92；培養(yǎng)第7天，1.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)分別為45、65、87。染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)數(shù)也隨著Pb2+濃度的升高而增大，也具有濃度效應(yīng)，只是效果不如染色體斷片數(shù)明顯。培養(yǎng)第4、5、6天，染色體斷片數(shù)還隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增大，具有時(shí)間效應(yīng)，1.0×10-4mol/L Pb2+培養(yǎng)第4、5、6天的染色體斷片數(shù)分別為39、46、50，2.5×10-4mol/L Pb2+培養(yǎng)第4、5、6天的染色體斷片數(shù)分別為43、49、71，5.0×10-4mol/L Pb2+培養(yǎng)第4、5、6天的染色體斷片數(shù)分別為52、54、92。培養(yǎng)第7天后，1.0×10-4、2.5×10-4、5.0×10-4mol/L Pb2+處理組的染色體斷片數(shù)分別為45、65、87，不但沒(méi)有超過(guò)培養(yǎng)第6天的染色體斷片數(shù)，反而比第6天稍微低一些，原因在于培養(yǎng)第6天后，蠶豆根尖細(xì)胞的有絲分裂水平下降。染色體橋、落后染色體、多極分裂、染色體環(huán)的規(guī)律和染色體斷片的規(guī)律基本一致，在培養(yǎng)第4、5、6天，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，數(shù)目增多，具有時(shí)間效應(yīng)，只是效果不及染色體斷片明顯，培養(yǎng)第7天，和染色體斷片數(shù)一樣，數(shù)目稍低于培養(yǎng)第6天，原因同前。

3討論

已有研究結(jié)果表明，重金屬進(jìn)入植物體后主要積累在根部[2]，產(chǎn)生遺傳毒害的時(shí)間主要是在細(xì)胞分裂間期的DNA和染色體復(fù)制過(guò)程中。Pb2+是生物的非必需元素，也是毒性較強(qiáng)的誘變劑。Pb2+以一種可交換的形式取代或置換Ca2+，并與細(xì)胞膜表面的-SH基結(jié)合，阻止Ca2+的跨膜內(nèi)流，使鈣調(diào)素（CaM）和Ca-ATP酶不能被激活[3]。進(jìn)入細(xì)胞的Pb2+還能與帶負(fù)電的核酸結(jié)合，降低RNA和DNA的活性，引起核酸裂解并影響到細(xì)胞有絲分裂過(guò)程[4-5]。在該試驗(yàn)中，微核率和染色體畸變率都隨著Pb2+濃度的增大而升高，具有非常顯著的濃度效應(yīng)，染色體畸變有斷片、染色體橋、落后染色體、染色體多極分裂和染色體環(huán)等多種形式，其中染色體斷裂具有不可逆的重度毒害作用，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6-7]。微核的形成途徑有兩條：一條途徑是由于前一分裂周期G2期后產(chǎn)生的染色體斷片在分裂過(guò)程中不能與正常染色體協(xié)調(diào)活動(dòng)，在進(jìn)入間期時(shí)，即被排斥于核外形成的；另外一條途徑是由于各種形式的落后染色體、未及中板集合染色體以及染色體分組造成的。染色體畸變的產(chǎn)生可能有幾條途徑：一是由于藥物直接作用于DNA分子，造成DNA斷裂損傷，從而引起染色體畸變；二是由于藥物干擾了DNA、蛋白質(zhì)合成或者RNA轉(zhuǎn)錄，結(jié)果使與染色體運(yùn)動(dòng)有關(guān)的物質(zhì)不能形成，由此形成染色體畸變；三是藥物通過(guò)干擾某些損傷的正常修復(fù)過(guò)程，阻止染色體在正常情況下的重建，而形成新的重接，出現(xiàn)染色體橋、環(huán)、斷片之類(lèi)的重排。

參考文獻(xiàn)

[1] 朱志義，孔志明，錢(qián)衛(wèi)，等.鉛誘發(fā)不同品種蠶豆根尖細(xì)胞微核形成的比較觀察[J].鎮(zhèn)江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，5（1）：17-18.

[2] CHAKRAVARTY B，SRIVASTAVA S.Toxcity of some heavy metals in vivo and in vitro in Helianthus annus[J].Mutation Res，1992，283（3）：287-294.

[3] 文允鎰，張志明，胡蓓，等.鈣與鈣調(diào)素[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1989：63-164.

[4] DEGRAEVE N.Carcinogenic，teratogenic and mutagenic effects of cadmium[J].Mutation Res，1981，86（1）：115-135.

[5] KAZANTZIS G.Mutagenic and carcinogenic effects of cadium[J].Toxicol Environ Chem，1984，8（4）：267-278.

[6] HARTWELL L H，WEINERT T A.Checkpoints：Controls that ensure the order of cell cycle events[J].Science，1989，246（4930）：629-634.

[7] PAULOVICH A G，HARTWELL L H.A checkpoint regulates the rate of progression through S phase S.cerevisiae in response to DNA damage[J].Cell，1995，82（5）：841-847.