細(xì)菌菌殼作為免疫佐劑的研究進(jìn)展

居自遠(yuǎn)　錢晶　徐小　卜朝陽　郎需龍　王興龍

摘要細(xì)菌菌殼（Bacterial ghosts，BGs）是一種不含細(xì)胞質(zhì)和核酸成分的細(xì)菌空殼。近年來，研究證實BGs表面保留了大量完整的天然免疫模式識別受體的激動劑，可作為免疫佐劑誘導(dǎo)機(jī)體免疫或非免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答。除此之外，BGs還可裝配蛋白和核酸以提高外源抗原的免疫原性。主要介紹了BGs制備技術(shù)、佐劑效應(yīng)機(jī)制以及應(yīng)用潛能的最新研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞細(xì)菌菌殼；制備技術(shù)；免疫佐劑；應(yīng)用潛能

中圖分類號S188文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）31-0151-03

AbstractBacterial ghosts （BGs） are a group of hollow bacterial envelopes containing neither cytoplasm nor nucleotide contents. BGs are proved to retain large amounts of intact ligands of pattern recognition receptors， which functions as adjuvants to induce proinflammatory cytokine production by immune and nonimmune cell. These cytokines will further assist the activation of adaptive immune response. In addition， proteins and nucleotides can also be equipped into BGs to achieve elevated immunogenicity. In this review， recent advances in BGs production， adjuvant function mechanisms and new applications were discussed in detail.

Key wordsBacterial ghosts；Preparation techniques；Immune adjuvants；Application potential

早在1982年，Henrich B等[1]就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌噬菌體裂解酶可使大腸桿菌裂解死亡并且在電鏡顯示下呈現(xiàn)鬼影（Ghosts）模樣，并進(jìn)一步證實其中的裂解E蛋白具有在細(xì)菌細(xì)胞膜上打孔的功能，其被命名為Bacterial Ghosts（BGs）。我國于2004年才開始有BGs的研究報道，有專家學(xué)者將其意譯為細(xì)菌菌影、菌蛻或菌殼[2-4]。如今的BGs是由噬菌體phiX174裂解E蛋白作用革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜后而形成的細(xì)菌空殼形態(tài)[5]。電鏡下的BGs展現(xiàn)了其完整結(jié)構(gòu)，如外膜蛋白、黏附素、脂多糖和肽聚糖等[6]，保留了細(xì)菌表面的有效抗原表位，可作為新型滅活細(xì)菌預(yù)防細(xì)菌性傳染病。目前，已制備了多種不同革蘭氏陰性菌菌殼并證實其具有良好的免疫原性[4，7-25]，而隨著BGs研究的深入，BGs介導(dǎo)的免疫佐劑效應(yīng)機(jī)制以及新型載體遞送平臺的應(yīng)用也越來越受到研究人員的關(guān)注[26]。該研究主要介紹了BGs的制備技術(shù)、佐劑效應(yīng)機(jī)制以及應(yīng)用潛能的最新研究進(jìn)展。

1細(xì)菌菌殼的制備技術(shù)

目前，BGs的制備技術(shù)已應(yīng)用于多種革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌[7，14，23，27]、沙門氏菌[12，18-19，25]、布魯氏菌[4，8，28-29]、維氏氣單胞菌[15]、霍亂弧菌[20]、克雷伯氏菌[13]、副豬嗜血桿菌[13，17]、胸膜肺炎放線桿菌[16，21]、遲緩愛德華菌[24]、多殺性巴氏桿菌[22]、柱狀黃桿菌[11]等，均可達(dá)到可觀的裂解效果，通常再采取反復(fù)凍融或高滲溶液處理即可獲得細(xì)菌菌殼，以此作為非變性滅活菌苗相比傳統(tǒng)甲醛滅活菌苗具有理想的免疫原性。

BGs的制備主要基于噬菌體phiX174裂解E基因的表達(dá)，在細(xì)菌的兩極或中部形成1～2個直徑為40～200 nm的跨膜孔道[5]，通過溫控敏感部件cI857阻遏蛋白在常溫28 ℃及以下可抑制E基因的表達(dá)，通過提高培養(yǎng)溫度致使阻遏蛋白失活，進(jìn)而促使裂解酶發(fā)揮活性。這通常依賴特定或廣宿主重組質(zhì)粒的導(dǎo)入進(jìn)而誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)。吳幼[27]基于藍(lán)白斑篩選技術(shù)將裂解E基因插入大腸桿菌LacZ序列中，利用菌落顏色篩選獲得非智力依賴性的菌殼株。錢晶等[4，30]采用同源重組技術(shù)經(jīng)正、負(fù)向篩選后將溫控裂解部件插入犬布魯氏菌基因組中的B0419基因，通過42 ℃誘導(dǎo)表達(dá)獲得非質(zhì)粒依賴型的布魯氏菌菌殼；與此同時，付立霞[10]采用同源重組技術(shù)制備獲得嗜水氣單胞菌菌殼。上述2種菌殼制備技術(shù)克服了過去依賴抗性標(biāo)記質(zhì)粒表達(dá)的局限性，如抗生素抗性基因的殘留和重組質(zhì)粒的遺傳不穩(wěn)定等因素。另外，管玲玉[31]報道了一種營養(yǎng)誘導(dǎo)型的裂解系統(tǒng)，即通過限鐵誘導(dǎo)啟動子PviuB控制裂解E基因的表達(dá)效率，最終基于該系統(tǒng)制備了鰻弧菌菌殼。除了通過裂解E基因表達(dá)系統(tǒng)以外，胡本鋼[13]采用抗菌肽配合超高壓裝置，分別制備了副豬嗜血桿菌菌殼和肺炎克雷伯氏菌菌殼，其免疫原性均優(yōu)于常規(guī)滅活菌苗。然而，無論是采用基因工程手段還是物理化學(xué)方法制備菌殼，其目的都是獲得完整的細(xì)菌空殼，這是保證細(xì)菌本身的免疫原性及其表面免疫激動分子功能活性的重要前提。

2細(xì)菌菌殼作為佐劑的作用機(jī)制

免疫佐劑通常是通過刺激宿主機(jī)體免疫細(xì)胞表面的天然免疫受體進(jìn)而增強(qiáng)疫苗的免疫原性[32]。其中，天然免疫細(xì)胞通過一系列模式識別受體，如Toll樣受體（TLR）識別細(xì)菌、病毒、寄生蟲以及霉菌感染等多種刺激進(jìn)而介導(dǎo)免疫應(yīng)答反應(yīng)[33]。例如TLR2/4識別細(xì)菌脂多糖（LPS）和脂磷壁酸質(zhì)（TLR-2/4）、TLR9識別CpGDNA、TLR5識別鞭毛蛋白等[34-36]。近些年，細(xì)菌的某些成分具有增強(qiáng)弱抗原性疫苗的免疫應(yīng)答能力，已經(jīng)被應(yīng)用到疫苗的研制當(dāng)中。

BGs的產(chǎn)生屬于非變性，保留了完整的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，這其中包含已知的免疫刺激成分（LPS、鞭毛等），是一類十分有潛力的高效免疫佐劑[6，37]。BGs的這些胞外結(jié)構(gòu)能夠有效地被免疫細(xì)胞或非免疫細(xì)胞所識別與遞呈[38]，主要通過TLR2和TLR4信號通路激活免疫細(xì)胞，包括誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DCs）的活化與成熟，進(jìn)而促使其向淋巴器官T細(xì)胞區(qū)域的募集；BGs通過TLR2和TLR4接頭分子經(jīng)依賴MyD88或TRIF途徑（非依賴MyD88）將信號傳遞給下游MAPK或IkB級聯(lián)分子，激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，如NF-kB、AP-1、IRF3/7，最終產(chǎn)生各種促炎細(xì)胞因子和趨化因子等[39-41]。

DCs作為專職的抗原遞呈細(xì)胞，能有效攝取和加工BGs，介導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，隨后上調(diào)DC細(xì)胞的共刺激因子表達(dá)，進(jìn)而有利于將外源抗原高效地遞呈給未致敏T細(xì)胞[42-43]。研究發(fā)現(xiàn)BGs能向DCs提供有效的早期成熟信號，大量分泌Th1細(xì)胞因子（特別是IL-12），進(jìn)而激活NK和Th1細(xì)胞[43]。另外，在DCs接觸BGs 12 h后，DCs表面MHC-II的表達(dá)水平顯著上調(diào)[42-43]，表明BGs具有激發(fā)早期免疫應(yīng)答反應(yīng)的潛力，這對于緊急免疫接種策略或許又是一個新發(fā)現(xiàn)。不僅如此，BGs的LPS還能夠增強(qiáng)DCs細(xì)胞MHC-I的表達(dá)，使DCs將抗原多肽交叉遞呈給CD8+T細(xì)胞，從而有助于誘導(dǎo)有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答[44-45]。菌殼能夠上調(diào)DCs表面細(xì)胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，這為激發(fā)高效CD8+T細(xì)胞反應(yīng)提供必要基礎(chǔ)[46]。研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌BGs和腸炎沙門氏菌BGs均引起有效的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答，并保護(hù)免疫的禽免受致死性劑量強(qiáng)毒株的攻擊[18-19]。除了能夠作用于DC細(xì)胞，BGs也能有效地激活單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，并且能促進(jìn)免疫反應(yīng)趨向Th1型應(yīng)答發(fā)展[47]。此外，BGs誘導(dǎo)許多淋巴和非淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和趨化因子，促使T、B淋巴細(xì)胞和免疫細(xì)胞向淋巴結(jié)的回流和遷移，從而充分與同源抗原接觸激發(fā)免疫應(yīng)答。這些結(jié)果表明BGs的自身免疫佐劑效應(yīng)使其能有效地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫及細(xì)胞免疫反應(yīng)。

BGs也可以刺激非專職抗原遞呈細(xì)胞，如結(jié)膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角蛋白細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等[38，48-50]。因此，BGs能夠提供非特異性的抗病原微生物的能力，并且BGs也能利用TLR5分子（識別鞭毛）激活下游信號通路。Abtin等發(fā)現(xiàn)野生型大腸桿菌（NK9373）的菌殼比突變的無鞭毛大腸桿菌菌殼更容易被角蛋白細(xì)胞所捕獲[48]，這表明細(xì)菌鞭毛蛋白能夠通過TLR5或炎癥小體介導(dǎo)細(xì)胞活化途徑進(jìn)而激活任意一種信號通路[51]。另外，BGs還能作用于淋巴細(xì)胞。利用放線桿菌BGs體外刺激T細(xì)胞以后，能夠檢測到特異性的T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)。Felnerova等[52]研究結(jié)果也表明，BGs能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖，并且在抗原遞呈細(xì)胞的輔助下其激活T細(xì)胞增殖能力強(qiáng)于單獨BGs刺激組。因此，BGs不僅可以通過抗原遞呈細(xì)胞活化T細(xì)胞，還可以通過TLR分子直接活化T細(xì)胞。

目前，BGs作為免疫佐劑的最大原因主要是包含LPS。Means等[53]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過鞭毛處理的DCs相比LPS處理的DCs具有較弱的遞呈T細(xì)胞能力，但也能介導(dǎo)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。Jawale等[54]研究發(fā)現(xiàn)含有大腸桿菌熱不穩(wěn)定B亞基腸毒素的沙門氏菌BGs比單獨BGs具有更有效地誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。

3細(xì)菌菌殼的應(yīng)用潛能

大多免疫細(xì)胞或上皮細(xì)胞普遍表達(dá)TLR4和TLR5，作為其配體的LPS和鞭毛在BGs上固有存在，這使得BGs能夠有效地誘導(dǎo)黏膜免疫應(yīng)答。BGs本身的佐劑屬性使之成為潛在的載體平臺，可在其表面裝配外源蛋白或在其內(nèi)部裝載DNA片段。另外，BGs的靶向性也使其成為裝載小分子藥物的良好載體[26]。

目前，已報道用于裝載DNA疫苗的BGs有溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica，M.haemolytica）和傷寒沙門氏桿菌（Salmonella typhi，S.typhi）[47]。Ebensen等[42]于2004年證明在M.haemolytica BGs中裝載DNA可顯著增強(qiáng)APC對DNA的攝取，且能誘導(dǎo)更強(qiáng)的特異性體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)，并使初始型Th細(xì)胞向Th2型細(xì)胞分化，這有利于機(jī)體消除持續(xù)性感染。另外S.typhi Ty21a BGs可以協(xié)助HIV gp140 DNA被小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬，在體內(nèi)試驗中誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生更好的黏膜免疫反應(yīng)，這對HIV疫苗的研制具有重要的意義[55]。

然而，BGs作為蛋白載體平臺的應(yīng)用更為常見，Chan等[56]在S.typhi BGs表面分別表達(dá)產(chǎn)腸毒性大腸桿菌（enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）的菌毛蛋白 K88ab、K88ac、K99和 FasA，該嵌合BGs免疫小鼠后14 d，血清IgG和糞便IgA都有顯著上升，且腸道抗原特異性B淋巴細(xì)胞、脾臟淋巴細(xì)胞均有顯著上升。Cai等[57]在E.coli外膜表面表達(dá)線性Stx2Am-Stx1B，該嵌合BGs不僅能誘導(dǎo)更高水平的血液IgA或IgG，還較單獨BGs組提供更好的免疫保護(hù)效果。

通過黏膜免疫途徑對機(jī)體進(jìn)行免疫是當(dāng)前黏膜疫苗研究的熱點，但由于缺乏通過此途徑激發(fā)足夠有效的免疫原，因此一直處于瓶頸階段。BGs作為候選疫苗的一大優(yōu)勢就在于其能夠引起有效的抗原特異性黏膜免疫和系統(tǒng)性免疫反應(yīng)[26，57]。其中以幽門螺旋桿菌為載體的口服疫苗研究尤為突出，Talebkhan等[58]在幽門螺旋桿菌BGs表面裝載了其自身的一種保護(hù)性抗原Omp18蛋白，經(jīng)口服免疫小鼠后，小鼠產(chǎn)生高水平抗Omp18抗體，另外還發(fā)現(xiàn)活的幽門螺旋桿菌在胃部的數(shù)量也顯著減少。

BGs這類微小顆粒同樣易于被抗原遞呈細(xì)胞攝取，因此也常被用作裝載酶類、抗生素、抗腫瘤藥物[26，37，42]。研究表明，BGs裝載的酶類仍具有其酶活性，通過裝載特定的酶類，BGs不但有助于治療酶類缺失造成的代謝紊亂，還能通過裝載帶有偏嗜性的酶類調(diào)節(jié)腸道菌群[59]。除此之外，Paukner等[60]成功借助M.haemolytica BGs裝載抗腫瘤因子doxorubicin（DOX），使其靶向人結(jié)腸腺癌細(xì)胞，其抗癌效果顯著優(yōu)于單獨使用DOX，并未對健康細(xì)胞造成病理性損傷。由此可見，保留了細(xì)菌生物學(xué)活性的BGs的應(yīng)用潛能在不斷被挖掘。

4展望

BGs是一類具有良好安全性和免疫原性的新型滅活細(xì)菌，完整保留了其表面結(jié)構(gòu)，使其具備自體免疫佐劑的特征，基于BGs載體平臺為開發(fā)多聯(lián)嵌合疫苗、靶向疫苗以及腫瘤免疫治療提供了新策略。

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