甘蔗內(nèi)標(biāo)基因PCR檢測(cè)技術(shù)研究

肖乃衍 林冰 劉迪 陳平華 許躍語(yǔ) 施桂姣 王恒波 郭晉隆 高三基 許莉萍 陳如凱

摘 要 克隆鑒定甘蔗內(nèi)源低拷貝基因鮮有研究，影響轉(zhuǎn)基因甘蔗精確鑒定。根據(jù)其他作物已有的內(nèi)標(biāo)基因和內(nèi)源低拷貝基因，按照內(nèi)標(biāo)基因的物種特異性和通用性原則，用12個(gè)有代表性甘蔗栽培品種對(duì)11個(gè)候選基因進(jìn)行篩選與鑒定，獲得了甘蔗特有的內(nèi)源低拷貝基因，并以該基因建立了甘蔗內(nèi)標(biāo)基因PCR檢測(cè)技術(shù)體系，為轉(zhuǎn)基因甘蔗的精確檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)的制定奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 甘蔗；內(nèi)標(biāo)基因；鑒定；PCR檢測(cè)技術(shù)

中圖分類號(hào) S566.1；Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cloning and identification of endogenous low copy gene in sugarcane has been rarely reported， which affects the accurate determination of the transgenic sugarcane. Low copy endogenous genes of sugarcane were identified referring to the known endogenous reference genes and low copy endogenous genes of other crops. Eleven candidate genes were tested with twelve representative sugarcane cultivars based on the principles of species specific and universal existence. PCR protocol to amplify the low copy endogenous gene was set up subsequently， which contributes to identify transgenic sugarcane plants precisely and lays the foundation for development of relevant detection standards.

Key words sugarcane； endogenous reference genes； determination； PCR detection technology

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.03.019

目前，轉(zhuǎn)基因作物的推廣已給全世界帶來(lái)了巨大的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益[1]，為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的需要，農(nóng)業(yè)部制訂了一系列標(biāo)準(zhǔn)。甘蔗（Saccharum officinarum）轉(zhuǎn)基因研究也越來(lái)越多，涉及增加蔗糖分積累和蔗莖產(chǎn)量、增強(qiáng)抗病能力、提高抗逆性等方面[2-5]，但迄今為止，尚沒有制訂一例轉(zhuǎn)基因甘蔗檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。農(nóng)業(yè)部制訂的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)大部分是定性PCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。定性PCR是檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植物常用的方法，具有快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效擴(kuò)增低拷貝的靶片段DNA[6]。影響PCR檢測(cè)效果的因素有很多，如PCR反應(yīng)程序、退火溫度、Taq酶質(zhì)量等，通過(guò)設(shè)立對(duì)照可以有效檢驗(yàn)這些因素合適與否。但樣品DNA質(zhì)量卻難以通過(guò)設(shè)立對(duì)照的方式來(lái)解決，因?yàn)槌Ｓ米贤夥止夤舛扔?jì)測(cè)定OD260/OD280比值的方法來(lái)衡量DNA質(zhì)量并把1.8作為純DNA的理論值，而OD260和OD280只是測(cè)定溶液中核酸和蛋白質(zhì)的含量，其他物質(zhì)的含量情況不得而知。抑制或干擾PCR反應(yīng)的物質(zhì)很多，如蛋白酶、有機(jī)溶劑、表面活性劑、鹽類、絡(luò)合物、金屬離子、多糖以及酸類物質(zhì)等，這些物質(zhì)是OD260/OD280比值所不能反映的。這就是有些經(jīng)測(cè)定純度很高的DNA樣品在PCR測(cè)定中結(jié)果卻很差的主要原因。逐個(gè)測(cè)定和去除這些抑制物需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和試劑，顯然不可取。目前研究人員已經(jīng)在某些作物上找到解決辦法，即鑒定該物種特有的低拷貝基因并作為內(nèi)標(biāo)基因建立PCR檢測(cè)方法，在目的基因PCR檢測(cè)前先對(duì)DNA樣品進(jìn)行內(nèi)標(biāo)基因PCR檢測(cè)，根據(jù)內(nèi)標(biāo)基因擴(kuò)增效果判定待檢DNA質(zhì)量是否滿足準(zhǔn)確測(cè)定目的基因的要求。多數(shù)主要作物的內(nèi)標(biāo)基因已被克隆并在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中得到應(yīng)用，如水稻的SPS[7]、gos9[8]基因，玉米的IVR[9]、zSSIIb[10]基因等，大豆的Lectin[9]、β-actin[11]基因等。但到目前為止，尚未有甘蔗內(nèi)標(biāo)基因被克隆鑒定，一個(gè)主要原因是：與上述整倍體植物不同，甘蔗是高度雜合的異源多倍體植物，其遺傳背景非常復(fù)雜，篩選和鑒定甘蔗內(nèi)源低拷貝基因比較困難。本研究試圖通過(guò)內(nèi)源低拷貝基因篩選鑒定，建立起甘蔗內(nèi)標(biāo)基因PCR檢測(cè)方法，為甘蔗轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制訂奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果對(duì)于甘蔗DNA樣品質(zhì)量判定和轉(zhuǎn)基因甘蔗準(zhǔn)確鑒定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 甘蔗品種 甘蔗栽培品種是由甘蔗屬中5個(gè)種即熱帶種、大莖野生種、細(xì)莖野生種、印度種和中國(guó)種中的幾個(gè)種雜交而來(lái)的。由于甘蔗本身遺傳背景非常復(fù)雜，為了使實(shí)驗(yàn)材料具有代表性，參考各實(shí)驗(yàn)材料的親本血緣，選取中國(guó)甘蔗主產(chǎn)區(qū)12個(gè)不同栽培品種（系）為材料，分別是廣西的柳城03-1137，廣東的粵甘34、粵甘35，云南的云蔗04-241、云蔗05-51、云蔗06-407，福建的FN36、FN02-5707、FN39，江西的贛南02-70，臺(tái)灣的ROC16、ROC22。其中云蔗04-241的父母本分別為ROC10、84-153；FN36的父母本分別為崖82-96、ROC1；ROC22的父母本分別為ROC5、69-435；粵甘34的父母本分別為ROC22、粵糖92-1287；云蔗05-51的父母本分別為ROC23、崖城90-56；FN39的父母本分別為CP84-1198、粵糖91-976；粵甘35的父母本分別為CP85-384和CP92-624、粵糖73-204；贛南02-70的父母本分別為CP84-1198、桂69-435；ROC16的父母本分別為F171、74-575；云蔗06-407的父母本分別為ROC25、粵糖92-70。以上品種的父母本覆蓋目前生產(chǎn)上常用的雜交育種親本材料，可以代表大多數(shù)甘蔗栽培品種的遺傳背景。上述材料由福建農(nóng)林大學(xué)甘蔗綜合研究所提供。

1.1.2 內(nèi)標(biāo)基因 從國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)準(zhǔn)中查找到的已有轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)標(biāo)基因有：IVR[12]、Lectin[12]、18S rRNA[12]、SPS[13]。美國(guó)農(nóng)業(yè)部以植物5S rRNA-ITS基因作為甘蔗內(nèi)標(biāo)基因[14]。

1.1.3 試劑 2×Premix Ex Taq酶、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購(gòu)自日本BioFlux公司；100 bp DNA Ladder、E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根生化科技公司；SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司；PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；其他生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 已有轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)標(biāo)基因檢測(cè)篩選 根據(jù)農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心編寫的《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全標(biāo)準(zhǔn)》以及國(guó)家技術(shù)監(jiān)督局《1949.5.4-2004轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)核酸定性PCR檢測(cè)方法》，檢索其中已有轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)標(biāo)基因及其PCR檢測(cè)引物序列和PCR反應(yīng)體系，按照標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)中各參試基因定性PCR反應(yīng)體系，在PCR反應(yīng)管中依次加入各反應(yīng)試劑，輕輕混勻，離心10 s后，將PCR管放入PCR儀中，按照擴(kuò)增參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR產(chǎn)物的特異性和通用性分析：PCR產(chǎn)物的特異性就是要求PCR產(chǎn)物擴(kuò)增只有單一的目的條帶并達(dá)到一定濃度，PCR產(chǎn)物的通用性就是要求PCR產(chǎn)物在甘蔗栽培品種中都能有效擴(kuò)增，并且擴(kuò)增的條帶符合特異性要求。利用入選的甘蔗品種DNA，對(duì)測(cè)試基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物條帶的電泳分析判定測(cè)試基因是否符合內(nèi)標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)。制備含有EB的1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析產(chǎn)物的特異性和通用性。膠回收目的片段，并進(jìn)行克隆和測(cè)序。

1.2.2 已知低拷貝基因檢測(cè)篩選 通過(guò)檢索文獻(xiàn)資料或登錄GenBank檢索已經(jīng)克隆的植物低拷貝基因或者甘蔗的低拷貝基因，檢索到已經(jīng)克隆的植物低拷貝基因和基因序列有：ALS[15]（登錄號(hào)：EU243998.1）、UGPase[16]（登錄號(hào)：FJ536261.1）、vrn2[17]（登錄號(hào)：CA080033.1）、LeftsH6[18]（登錄號(hào)：DN193862.1）、LsD1[19]（登錄號(hào)：CA224873.1）、NCED1[20]（登錄號(hào)：AY838901.1）。利用已有PCR檢測(cè)引物或根據(jù)其序列用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)適合甘蔗的引物，計(jì)算引物適宜退火溫度，建立PCR反應(yīng)體系。參照1.2.1進(jìn)行PCR產(chǎn)物特異性和通用性分析。

1.2.3 入選基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR測(cè)試和拷貝數(shù)分析 采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Holding Stage：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；Cycling Stage：95 ℃ 1 s；60 ℃ 1 min；40 cycles；Melt Curve Stage：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s；60 ℃ 15 s。反應(yīng)體系：DNA模板1.0 μL，SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，加ddH2O使總體積為25.0 μL。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物擴(kuò)增效率：將已知濃度的含目的基因質(zhì)粒濃度調(diào)整到109 copies/μL，再依次稀釋為108、107、106、105、104、103、102、101，然后作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線以log10為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)。如引物的擴(kuò)增效率（E）大于0.8、擴(kuò)增曲線相關(guān)系數(shù)（R2）大于0.95則認(rèn)為曲線線性關(guān)系成立，所設(shè)計(jì)引物能夠滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的要求，可用于下一步甘蔗內(nèi)源基因拷貝數(shù)分析。定量PCR反應(yīng)中，為了避免引物二聚體干擾并保證引物擴(kuò)增的效率，擴(kuò)增的目的片段一般都不大，以200 bp左右為宜。把測(cè)得的各樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出目的基因拷貝數(shù)，再代入公式：拷貝數(shù)/{[6.02×1023×10-9×40/（7 740×106×660）]}得出基因在單個(gè)細(xì)胞基因組中的拷貝數(shù)。

1.2.4 入選基因定性PCR檢測(cè)體系 為確定入選基因PCR檢測(cè)體系的靈敏度，根據(jù)優(yōu)化的入選基因定性PCR反應(yīng)體系，將甘蔗基因組DNA濃度依次稀釋為20、2、0.2、0.02、0.01、0.001 ng/μL，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)能夠擴(kuò)增出目的片段的最低甘蔗基因組DNA濃度高低，確定入選基因PCR反應(yīng)的靈敏度。

1.2.5 入選基因PCR檢測(cè)體系甘蔗物種特異性驗(yàn)證

為驗(yàn)證入選基因的物種特異性，以已經(jīng)有轉(zhuǎn)基因品種的典型作物如雙子葉植物大豆、單子葉植物水稻、玉米等和甘蔗DNA為模板，利用優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系同時(shí)進(jìn)行入選基因PCR檢測(cè)，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果判定甘蔗入選基因PCR檢測(cè)體系的物種特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗材料的遺傳背景和代表性分析

甘蔗育種的改良對(duì)象主要為栽培種，因此甘蔗栽培種的親本材料在甘蔗育種中有著重要的作用。中國(guó)大陸目前大多數(shù)的甘蔗優(yōu)良栽培品種是美國(guó)CP49-50、印度Co419和中國(guó)臺(tái)灣F134等的后代，而Co419、F134等又是印尼爪哇POJ2878的后代[21]。本研究的甘蔗材料中，父本為F系列的有ROC16；父本為“ROC”系列的有云蔗04-241、ROC22、粵甘34、云蔗05-51、云蔗06-407；母本為“ROC”系列的有FN36；父本為美國(guó)CP系列的有FN39、粵甘35、贛南02-70。此外，考慮到中國(guó)不同蔗區(qū)的特點(diǎn)，又增加了主要蔗區(qū)常用育種親本，如父母本分別為崖城系列的FN36和云蔗05-51；母本為粵糖系列的粵甘34、FN39、粵甘35、云蔗06-407；母本為桂糖系列的贛南02-70。以上受試品種的父母本不僅涵蓋美國(guó)CP系列、中國(guó)臺(tái)灣ROC和F系列，而且還有崖城系列、粵糖系列、桂糖系列等，基本可以代表目前生產(chǎn)上栽培品種的遺傳背景。由此可以看出，本研究的試驗(yàn)材料具有較廣泛的代表性，能夠較好地反映甘蔗遺傳背景的總體情況。

2.2 已有轉(zhuǎn)基因植物內(nèi)標(biāo)基因檢測(cè)篩選

2.2.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)與產(chǎn)物特異性和通用性分析 用表1中5個(gè)基因的引物對(duì)甘蔗DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：SPS、5S rRNA-ITS、Lectin基因PCR擴(kuò)增出多個(gè)條帶（圖1-A、B、C），其中SPS基因擴(kuò)增出3個(gè)不同的高豐度帶；5S rRNA-ITS基因個(gè)別甘蔗品種擴(kuò)增出的非特異條帶較亮；Lectin基因主擴(kuò)增帶長(zhǎng)度偏離很大。這些現(xiàn)象主要是引物特異性不強(qiáng)造成的，因此，沒有再進(jìn)行體系優(yōu)化研究。IVR基因PCR雖然只在部分材料中產(chǎn)生非特異條帶，高豐度帶也較單一，但條帶大小介于200～300 bp且接近200 bp，與玉米已有IVR內(nèi)標(biāo)基因的226 bp大小一致，因已被鑒定、使用，故不再進(jìn)一步研究（圖1-D）；18S rRNA（圖1-E）PCR只擴(kuò)增出1個(gè)條帶并且所有受試甘蔗品種均能擴(kuò)增出來(lái)，符合內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)，但條帶大小與棉花擴(kuò)增條帶大小一致。由于18S rRNA已作為棉花內(nèi)標(biāo)基因使用，不符合甘蔗物種特異性原則，不能作為甘蔗內(nèi)標(biāo)基因。

2.2.2 目的片段回收測(cè)序 為進(jìn)一步驗(yàn)證18S rRNA PCR擴(kuò)增的單一條帶大小，對(duì)目的條帶進(jìn)行了回收測(cè)序，結(jié)果顯示目的片段長(zhǎng)度137 bp，序列長(zhǎng)度與圖1-E中電泳條帶大小一致，兩種方法結(jié)果相互印證。

2.3 已知低拷貝基因檢測(cè)篩選

根據(jù)檢索到的6個(gè)低拷貝基因ALS、UGPase、vrn2、LeftsH6、LsD1、NCED1的序列設(shè)計(jì)特異引物，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見表2，其PCR反應(yīng)參數(shù)見表3。

2.3.1 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)與產(chǎn)物特異性和通用性分析 用ALS、UGPase、vrn2、LeftsH6、LsD1、NCED1的引物對(duì)甘蔗進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ALS基因引物PCR擴(kuò)增只出現(xiàn)1個(gè)條帶并且每個(gè)甘蔗品種均能擴(kuò)增出同一條帶，符合甘蔗品種通用性原則，結(jié)果見圖2-A，擴(kuò)增條帶大小在100～200 bp之間，接近預(yù)期長(zhǎng)度170 bp。該基因未作為內(nèi)標(biāo)基因使用，且在甘蔗上未進(jìn)行過(guò)鑒定，值得進(jìn)一步研究。NCED1基因引物擴(kuò)增出一個(gè)主帶，大小接近預(yù)期長(zhǎng)度203 bp，但有一個(gè)弱的非特異擴(kuò)增帶，結(jié)果見圖2-B。因已篩選到與預(yù)期目標(biāo)一致的基因，未對(duì)該基因深入研究。其他基因中UGPase和LeftsH6未擴(kuò)增出目的條帶，vrn2和LsD1擴(kuò)增出多個(gè)條帶，不符合內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)（圖未列出）。

2.3.2 目的片段回收測(cè)序 對(duì)ALS基因PCR擴(kuò)增的單一條帶進(jìn)行膠回收并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如下（5′-3′）：

測(cè)序結(jié)果顯示：ALS基因PCR目的片段長(zhǎng)度171 bp，與圖2-A中ALS基因PCR產(chǎn)物電泳條帶長(zhǎng)度一致。經(jīng)Blast比對(duì)，從甘蔗上克隆的ALS基因序列與水稻ALS基因只有62%的同源性（登錄號(hào)：XM_015779138.1、AP014960.1、AP014960.1），可見，利用甘蔗DNA為模板擴(kuò)增到的ALS基因片段，其序列與水稻相比差異很大，說(shuō)明該基因具有甘蔗物種特異性，符合內(nèi)標(biāo)基因物種特異性原則，但其在甘蔗基因組中的拷貝數(shù)未知，需要進(jìn)一步研究鑒定。

2.4 ALS實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

利用表2中ALS基因PCR引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，繪制出ALS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果引物的擴(kuò)增效率（E）大于0.95，擴(kuò)增曲線相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999（見表4），表明該引物適用于ALS基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的要求，可用于下一步甘蔗內(nèi)源基因拷貝數(shù)分析。

2.4.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線 對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線的分析實(shí)質(zhì)上是產(chǎn)物的特異性分析。如果溶解曲線為單峰則說(shuō)明引物的特異性強(qiáng)，峰值高則說(shuō)明PCR擴(kuò)增效率好。ALS基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR溶解曲線為單峰，且峰值較高，說(shuō)明引物特異性強(qiáng)，PCR擴(kuò)增效率好（圖3）。圖中有12條PCR溶解曲線，每條PCR溶解曲線代表一個(gè)受試甘蔗品種。

2.4.2 ALS基因拷貝數(shù)分析 以12個(gè)受試甘蔗品種的DNA為模板，把模板濃度調(diào)整為20 ng/μL，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，確定Ct值，然后按照ALS基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式將12個(gè)甘蔗品種的Ct值代入，計(jì)算出其相應(yīng)的拷貝數(shù)。然后按公式：拷貝數(shù)/{[6.02×1023×10-9×40/（7740×106×660）]}得出ALS基因在單個(gè)細(xì)胞基因組中的拷貝數(shù)，結(jié)果見表5。對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：ALS基因的樣本均值為1.107，與1接近，t統(tǒng)計(jì)量為0.778，自由度為11，p值為0.453。由于p值大于顯著水平0.05，所以接受ALS基因在甘蔗基因組中的拷貝數(shù)為低拷貝的原假設(shè)，推斷ALS基因是單拷貝基因。

2.5 ALS基因定性PCR檢測(cè)體系

表6是根據(jù)常見轉(zhuǎn)基因檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)的ALS基因定性PCR反應(yīng)體系，按照優(yōu)化的反應(yīng)程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：95 ℃變性5 min；進(jìn)行35次循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s）；最后72 ℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后取出PCR反應(yīng)管，對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)或在4 ℃下保存待用。

PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖4，可以看到：當(dāng)甘蔗基因組DNA濃度為0.2 ng/μL時(shí)仍然可以看到目的條帶，但當(dāng)濃度低于0.2 ng/μL就難以辨別目的條帶了，可見要檢測(cè)到甘蔗內(nèi)源低拷貝基因，DNA濃度應(yīng)在0.2 ng/μL以上。

2.6 甘蔗ALS基因PCR檢測(cè)體系物種特異性驗(yàn)證

根據(jù)設(shè)計(jì)的驗(yàn)證入選基因物種特異性方法，以水稻、大豆、玉米、甘蔗DNA為模板，用ALS基因的引物（表2中ALS-F和ALS-R）進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果只有甘蔗得到擴(kuò)增，且PCR擴(kuò)增產(chǎn)物很特異，亮度很強(qiáng)（圖5）。其他已經(jīng)有轉(zhuǎn)基因品種的作物如雙子葉植物大豆、單子葉植物水稻和玉米均未擴(kuò)增出任何條帶，這表明本研究利用甘蔗內(nèi)源低拷貝基因ALS建立的 PCR檢測(cè)體系可以從典型轉(zhuǎn)基因作物中特異地鑒定出甘蔗。

3 討論

實(shí)驗(yàn)材料的選擇?；诓煌难芯磕繕?biāo)選取相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)材料。本實(shí)驗(yàn)選取的甘蔗實(shí)驗(yàn)材料基于三個(gè)原則：一是栽培品種，因?yàn)檗D(zhuǎn)基因目的是應(yīng)用，受體材料用栽培品種才有更大利用價(jià)值。二是糖蔗，因?yàn)楦鶕?jù)人們對(duì)轉(zhuǎn)基因的敏感性，直接食用的果蔗很難獲得環(huán)境釋放；糖蔗作為工業(yè)原料則相對(duì)容易。三是材料要具有較廣泛代表性。因?yàn)殍b定的是甘蔗栽培種內(nèi)標(biāo)基因，在甘蔗栽培種內(nèi)要廣泛存在。由于甘蔗本身遺傳背景非常復(fù)雜，不同栽培種之間基因組大小差別就很大[22]，為使實(shí)驗(yàn)材料具有代表性，既要考慮實(shí)驗(yàn)材料的血緣，能夠代表大多數(shù)甘蔗栽培品種的遺傳背景，同時(shí)也要考慮甘蔗的來(lái)源，覆蓋較多的甘蔗不同產(chǎn)區(qū)才能進(jìn)一步提高實(shí)驗(yàn)材料的代表性。本研究所選材料較好滿足了上述要求。

基因拷貝數(shù)計(jì)算公式分析。在實(shí)時(shí)熒光定量PCR拷貝數(shù)分析中，先通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出基因拷貝數(shù)，然后再采用公式：拷貝數(shù)/{[6.02×1023×10-9×40/（物種單個(gè)細(xì)胞的基因組大小×660）]}得出該基因在單個(gè)細(xì)胞基因組的拷貝數(shù)。公式中6.02×1023為阿伏伽德羅常數(shù)，660為4個(gè)脫氧核糖核苷酸（A、T、G、C）的平均分子量的2倍（雙鏈），由于甘蔗基因組比較復(fù)雜，不同甘蔗品種間基因組大小差異較大，一般在7 500×106～11 780×106 bp之間，而80%的甘蔗高貴種的基因組大小在7 500×106～8 500×106 bp之間[23]，本研究所用材料為栽培品種，因此以甘蔗高貴種平均基因組大小7 740×106 bp作為計(jì)算公式中的“物種單個(gè)細(xì)胞基因組大小”的值代入公式進(jìn)行計(jì)算。從正文表5中拷貝數(shù)計(jì)算結(jié)果可以看出不同來(lái)源品種間存在差異，這與甘蔗學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為不同甘蔗品種間基因組大小差異較大的看法一致，由于本研究取樣具有較廣泛的代表性，且樣品數(shù)較多，多個(gè)樣品的平均值就比較接近真值。

參試基因篩選鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于參試的基因是否需要進(jìn)行深入鑒定，一是要看測(cè)試基因是否符合內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)，有3個(gè)基本要求，種間特異性、種內(nèi)非特異性和恒定低拷貝數(shù)的特點(diǎn)[24]，種間特異性指該基因在不同的物種間同源性極低，本研究在篩選過(guò)程中已充分考慮該要求；種內(nèi)非特異性要求該基因在同一物種的不同品種中具有很高的同源性和穩(wěn)定性，具體到本研究，要求PCR產(chǎn)物在甘蔗栽培品種中都能有效擴(kuò)增；恒定低拷貝數(shù)指的是在同一物種拷貝數(shù)不變，一般為1～3個(gè)拷貝，單拷貝最佳。參試基因首先要符合上述3個(gè)要求。二是在測(cè)試基因符合內(nèi)標(biāo)基因標(biāo)準(zhǔn)的前提下，看測(cè)試基因PCR產(chǎn)物大小是否與已有內(nèi)標(biāo)基因相同，如果相同，說(shuō)明不具備物種特異性要求，繼續(xù)研究失去意義；如果該基因尚未被鑒定為內(nèi)標(biāo)基因，則可進(jìn)一步鑒定。對(duì)于有明顯單一條帶的新基因，無(wú)論條帶大小如何，都值得進(jìn)一步研究鑒定。

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