劉威 袁丁 郭桂義 楊國一 葉乃興

摘要：【目的】明確福建省福州市茶樹炭疽病病原菌種類，為茶樹炭疽病的防治及抗病育種提供參考?！痉椒ā坎捎眯螒B(tài)學(xué)結(jié)合基于谷氨酰胺合成酶（GS）、β-微管蛋白（β-TUB2）、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）和核糖體DNA大亞基（LSU）等4個基因序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育分析方法，對從福州市幾個茶園不同茶樹品種炭疽病典型病葉上分離獲得的茶樹炭疽病病原菌（FFB、FJG、FRG、FSX和FFA）進行鑒定，并利用柯赫氏法則驗證菌株的致病性?！窘Y(jié)果】5株供試病原菌均能通過傷口侵染茶樹葉片，且病癥相似，為茶樹炭疽病致病菌。5株病原菌分離物形態(tài)特征相似，基于多基因系統(tǒng)發(fā)育分析并結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征，將5株供試菌株鑒定為Colletotrichum siamense。【結(jié)論】C. siamense為茶樹炭疽病弱致病菌，主要通過傷口侵染茶樹。生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免人為活動造成茶樹葉片損傷，以減少茶樹發(fā)生炭疽病。

關(guān)鍵詞： 茶樹；炭疽病菌；鑒定；致病性測定；多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

中圖分類號： S435.711 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）03-0448-06

0 引言

【研究意義】茶樹原產(chǎn)于我國，種植與利用歷史悠久，其葉片富含茶多酚、氨基酸、生物堿等具有保健功效的化學(xué)成分（宛曉春，2014；徐歡歡等，2016），已得到全世界人們的認(rèn)可。隨著茶葉需求量的增加，茶園面積不斷擴大，加上部分茶區(qū)茶樹品種單一，管理粗放，使得茶樹病害日益加重（李向陽等，2016）。茶樹炭疽病是危害茶樹生長的主要病害之一，全國各茶區(qū)均有發(fā)生，影響茶樹種植與茶葉生產(chǎn)，造成茶葉產(chǎn)量及品質(zhì)下降（譚濟才，2011）。炭疽病致病菌種類繁多，種內(nèi)存在較多生理小種，地理分布和寄主范圍均非常廣泛，且不同小種間生物學(xué)特性及致病力也存在差異（Hyde et al.，2009）。近年來，福建省福州市茶園茶樹炭疽病病害發(fā)生較嚴(yán)重，而茶樹炭疽病致病菌種類仍未明確，因此，開展福州市茶樹炭疽病致病菌鑒定及病原致病性研究對于當(dāng)?shù)夭鑸@茶樹炭疽病病害防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】形態(tài)學(xué)特征和寄主范圍是區(qū)別炭疽菌種間關(guān)系的重要依據(jù)。陳宗懋和陳雪芬（1990）、陸家云（1997）采用傳統(tǒng)鑒定手段發(fā)現(xiàn)能侵染茶樹的炭疽病致病菌有Colletotrichum camelliae和C. crassipes。劉威等（2014， 2015）采用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)的方法將能侵染茶樹引起炭疽病的致病菌鑒定為C. camelliae、C. fructicola和C. gloeosporioide。王玉春等（2015）采用系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法對我國15省（市、區(qū)）部分茶區(qū)茶樹炭疽病病葉進行病原菌鑒定，基本明確C. camelliae為我國茶樹炭疽菌優(yōu)勢種。Liu等（2015）從貴州、河南、江西、四川、云南、福建和浙江等7個省茶樹上分離炭疽病病原菌，經(jīng)鑒定獲得6種茶樹炭疽病病原菌，并推測C. camelliae是我國山茶屬植物的主要危害種?！颈狙芯壳腥朦c】前人對福建省茶樹炭疽病菌鑒定的取樣點僅為泉州、漳州等福建東南沿海地區(qū)，福州地區(qū)茶樹炭疽病致病菌鑒定研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對福州市幾個茶園茶樹炭疽病病原菌進行分離、純化，采用形態(tài)學(xué)結(jié)合基于谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）、β-微管蛋白（β-tubulin， β-TUB2）、核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Ribosomal internal transcribed spacer，ITS）和核糖體DNA大亞基（Ribosomal RNA large subunit gene，LSU）等4個基因序列的多基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析方法對獲得的茶樹炭疽病病原菌進行鑒定，明確其病原種類、遺傳多樣性及致病性特點，以期為茶樹炭疽病的綜合防治及抗病育種提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

分別于2015年6～9月從福建省福州市福建農(nóng)林大學(xué)茶園（包括南山茶園、茶葉經(jīng)濟與科技實驗室茶園）茶樹上采集不同茶樹品種炭疽病典型病葉標(biāo)本，利用組織分離法從病葉上分離病原菌，經(jīng)單孢分離獲得純培養(yǎng)菌株，并通過接種測定確認(rèn)為茶樹炭疽病致病菌，編號為FFB、FJG、FRG、FSX和FFA，5株病原菌的寄主分別為福鼎大白茶、金觀音、肉桂、水仙和福安大白茶。5株菌株均用馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基保存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。

PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、硝酸鉀（KNO3）8 g、瓊脂粉3 g和水1000 mL，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌30 min。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 茶樹炭疽病菌形態(tài)學(xué)性狀 參考劉威等（2014）的方法進行各菌株純培養(yǎng)特性、菌落生長速度、分生孢子及分生孢子附著孢的形態(tài)、大小、色澤觀察。

1. 2. 2 茶樹炭疽病菌致病性測定 采用柯赫氏法則測定各菌株致病力。將供試病原菌FFB、FJG、FRG、FSX和FFA分別接種至PSA培養(yǎng)基上，26 ℃下培養(yǎng)至產(chǎn)生孢子，將分生孢子用無菌水制成懸液，用分生孢子懸液對已消毒的無菌茶樹當(dāng)年生成葉進行有傷口和無傷口接種，將接種后的茶樹葉片置于人工氣候箱中保濕培養(yǎng)，8 d后測定病斑直徑，根據(jù)病斑直徑判斷菌株的致病力（劉威等，2014）。

1. 2. 3 菌絲DNA提取及PCR擴增 從供試菌落上收集菌絲，加液氮研磨粉碎后參考Chen等（2007）的方法進行菌絲基因組DNA抽取。采用引物對Bt2a/Bt2b（5'-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3'/5'-ACCC

TCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3'）、ITS1/ITS4（5'-TC

CGTAGGTGAACCTGCGG-3'/5'-TCCTCCGCTTATT

GATATGC-3'）、GSF1/GSR1（5'-ATGGCCGAGTACAT

CTGG-3'/ 5'-GAACCGTCGAAGTTCCAC-3'）、NL1/NL4

（5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'/5'-GGT

CCGTGTTTCAAGACGG-3'）對菌株的DNA進行PCR擴增，分別獲得GS、ITS、β-TUB2和LSU等4段基因。PCR反應(yīng)體系（50.0 μL）：上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），DNA模板5 ng，dNTP 4.0 μL，rTaq DNA聚合酶0.5 μL，10×PCR緩沖液（含Mg2+）5.0 μL、加ddH2O至50.0 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，共進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取5.0 μL擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

1. 2. 4 PCR產(chǎn)物的克隆與測序 用DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化后的DNA片段經(jīng)pMDl8-T連接后轉(zhuǎn)化到DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑鑒定篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子送至上海華大基因科技有限公司進行堿基序列測定。將所得基因各序列上傳至GenBank中獲得20個登錄號，登錄號見表1。

1. 2. 5 多基因系統(tǒng)發(fā)育分析 將供試菌株各基因按GS-β-TUB2-ITS-LSU的連接順序首尾相連。從GenBank中下載模式炭疽菌的相應(yīng)基因序列作為參考序列（表1），以相同的連接方式首尾相連。將下載的序列組合與供試茶樹炭疽菌各基因的序列組合一起采用MEGA 6.0鄰近法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，以自展法進行檢測，循環(huán)1000次，構(gòu)建供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 供試菌株的致病性測定結(jié)果

致病性測定結(jié)果顯示，刺破茶樹葉片表皮分別接種FFB、FJG、FRG、FSX和FFA等5株供試菌后各處理均能表現(xiàn)病癥，各處理病癥相似（圖1），并能從病斑處組織重新分離獲得與原接種菌一致的菌株，新分離菌株所產(chǎn)生分生孢子與原接種菌的形態(tài)、大小一致，說明供試菌為茶樹炭疽病的病原菌；有傷口接無菌水（CK）和無傷口接種孢子懸液處理均未表現(xiàn)病癥，取接種病原菌處茶樹葉片組織也未能分離到病原菌，說明供試菌只能從傷口處侵染茶樹葉片。

2. 2 茶樹炭疽病菌形態(tài)學(xué)特征

供試5株菌株侵染茶樹在葉片上形成灰色病斑，病斑處凹陷，后期易破碎，病健交界處明顯（圖2-A）。病斑上的小黑點即為分生孢子盤，寄生于葉片表皮下，后期分生孢子穿破表皮，隨風(fēng)雨飛散，作為病原物再次侵染茶樹。供試菌株在PSA培養(yǎng)基上純培養(yǎng)特征相似，在26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)時，菌落生長速度為1.34～1.57 cm/d，菌落白色至淺灰色，氣生菌絲較長，毯狀，邊緣較整齊，背面一般會形成黑色物質(zhì)，培養(yǎng)過程中未見剛毛和菌核，培養(yǎng)后期于菌落中心產(chǎn)生橙黃色分生孢子堆（圖2-B、2-C和2-D）。分生孢子橢圓形（圖2-E），兩端鈍圓，淺灰色，表面粗糙，中間凹陷，大小7.5～25.0 μm×2.0～5.5 μm，其中FRG的分生孢子寬度較大，F(xiàn)JG寬度最小。分生孢子上易產(chǎn)生分生孢子附著孢（圖2-F），附著孢不規(guī)則形、球形，表面黑色或灰黑色，表面灰色顆粒狀物明顯，大小6.3～10.5 μm×4.5～7.5 μm。參考已發(fā)表的文獻(xiàn)（Guo et al.，2014）發(fā)現(xiàn)供試菌株的形態(tài)學(xué)特征與C. siamense相似。

2. 3 茶樹炭疽菌的分子鑒定結(jié)果

多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，5株供試炭疽菌與C. siamense聚在一起（圖3），結(jié)合其形態(tài)學(xué)特征將5株菌鑒定為C. siamense。通過DNAMAN 6.0多基因序列比對，結(jié)果顯示4個基因的拼接序列一致性為97.24%，其中各菌株LSU基因序列同源性為100.00%，說明各菌株間的LSU基因最保守；ITS基因序列同源性為99.93%，F(xiàn)FA與其他4株菌株相比在259和397 bp位上存在基因突變；β-TUB2基因序列同源性為99.80%，F(xiàn)FB在第260、267和347 bp上存在基因突變，F(xiàn)FA在460 bp上存在基因突變，F(xiàn)JG在290 bp上存在基因突變；GS基因序列同源性為94.55%，各菌株間存在較多變異，主要出現(xiàn)在基因的中段位置，將各供試菌株GS基因比較發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)FB與其余4株菌株間的差異相對較明顯。

3 討論

本研究測定了供試5株病原菌菌株的GS、β-TUB2、ITS和LSU基因序列，并進行基于多基因序列的各菌株系統(tǒng)發(fā)育分析。從各菌株基因序列的分析結(jié)果看，各菌株間存在一定的堿基差異，各菌株GS基因存在的多樣性最多， LSU基因不存在基因堿基差異，各菌株ITS和β-TUB2基因間存在2～3個堿基變異，可能是菌株與不同品種茶樹寄主之間長期相互作用引起，具體原因有待進一步驗證。

C. siamense最早由Prihastuti等于2009年在泰國咖啡樹上發(fā)現(xiàn)并命名。本研究于2015年在福建農(nóng)林大學(xué)教學(xué)和試驗茶園中的感染炭疽病的福鼎大白茶、福安大白茶、金觀音、水仙和肉桂等品種茶樹上采集病葉并分離病原菌株，得到5株分離菌，采用形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法將5株病原菌鑒定為C. siamense。王玉春等（2015）和Liu等（2015）在廣東廣州、福建泉州、江西南昌、云南普洱等地鐵觀音、福鼎大白茶和金萱等品種茶樹上發(fā)現(xiàn)該種炭疽菌侵染茶樹；Cheng等（2013）、韓永超等（2014）、李河等（2015）報道該菌還侵染柑橘、草莓和油茶。說明C. siamense既沒有寄主特異性，也沒有地理?；?。近年來，茶樹炭疽病病原菌的分類鑒定取得了一些研究成果，分子生物學(xué)技術(shù)引用到茶樹炭疽病鑒定中后，除文中的C. siamense外，發(fā)現(xiàn)能侵染茶樹的炭疽菌還有C. gloeosporioides、C. camelliae、C. fructicola、C. acutatum和C. crassipes，但均未發(fā)現(xiàn)上述炭疽菌具有地理分布特異性，其中以C. camelliae分布最廣，遍布我國的安徽、湖北、重慶、廣東、河南、四川、江蘇、湖南、貴州、浙江、陜西和福建等12個產(chǎn)茶?。ㄊ校愖陧完愌┓遥?990；Guo et al.，2014；劉威等，2014，2015；Chen et al.，2016）。

本課題組還對從福建省安溪、武夷山、周寧和永春等縣（市）茶區(qū)部分茶園中分離的茶樹炭疽病菌進行鑒定，但僅在福建農(nóng)林大學(xué)茶園茶樹上發(fā)現(xiàn)C. siamense，在其余產(chǎn)茶縣（市）茶樹上均未發(fā)現(xiàn)該病原菌，可能與采集的樣本數(shù)量少有關(guān)。從病原菌的致病性測定結(jié)果來看，C. siamense的致病力相對較弱，屬于弱致病菌，但當(dāng)茶園管理不善或茶樹衰老、茶樹抗逆性降低時，該菌也能表現(xiàn)出很強的危害性。供試的FFA、FFB和FJG等3株菌株采集于土層僅有20 cm茶園的茶樹上，茶樹長勢相對較差，菌株FSX采集于用于路邊綠化的茶樹上，缺乏管理，茶樹長勢不良，可能是在上述茶樹上分離到該種炭疽菌的一個原因。另外，本研究致病性測定結(jié)果顯示，C. siamense是通過傷口侵染茶樹葉片，因此在進行茶園耕作時應(yīng)盡量減少茶樹機械損傷，以減少該病菌侵染茶樹引發(fā)炭疽病。

4 結(jié)論

本研究從感染炭疽病的茶樹葉片上分離、鑒定出一種弱致病菌——C. siamense，該菌只能通過傷口侵染茶樹。生產(chǎn)中應(yīng)盡量避免人為活動造成茶樹葉片損傷，以減少發(fā)生茶樹炭疽病。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）