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      羊耳菊活性部位在大鼠循環(huán)腸灌流液中的代謝產(chǎn)物研究

      2017-05-30 17:12:11鞏仔鵬李梅侯靖宇
      安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年28期

      鞏仔鵬 李梅 侯靖宇

      摘要 [目的]采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜(UHPLC-Q-TOF/MS)研究羊耳菊提取物在大鼠循環(huán)腸灌流液中的代謝產(chǎn)物。[方法]收集健康SD大鼠循環(huán)腸灌流液,分別用甲酸水溶液和正丁醇處理樣品后,UHPLC-Q-TOF/MS分析其代謝產(chǎn)物。結(jié)合對(duì)照品、質(zhì)譜碎片信息和相關(guān)文獻(xiàn),初步推測(cè)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。[結(jié)果]大鼠循環(huán)腸灌流液中的代謝物較少,初步鑒定出3個(gè)代謝產(chǎn)物,主要存在二咖啡?;鼘幩狨セ恢卯悩?gòu)和甲基化代謝物。[結(jié)論]該方法初步探究了羊耳菊提取物主要成分在大鼠循環(huán)腸灌流液中的代謝特征,為闡釋羊耳菊藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

      關(guān)鍵詞 羊耳菊;活性部位;腸灌流液;代謝產(chǎn)物

      中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611(2017)28-0122-03

      Abstract [Objective]To investigated the metabolites of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats by UHPLCQTOF/MS.[Method]The healthy intestinal perfusion fluid of SD rats was collected and the samples were treated with formic acid aqueous solution and nbutanol respectively.Identification and structural elucidation of the metabolites were performed by comparing the changes in molecular masses,retention times and full scan metabolisms (MS) spectra with those of the parent drug,and the relative data of authentic reference.[Results] There were fewer metabolites in the intestinal circulating perfusion fluid of rats,and three metabolites were identified.There were mainly isomers and methylated metabolites of dicaffeoylquinic acid ester groups.[Conclusion]The method is used to study the metabolic characteristics of the main components of the extract of Inula cappa extract in the intestinal circulating perfusion fluid of rats,and to provide the theoretical basis for elucidating the pharmacological basis of the herbs.

      Key words Inula cappa;Active parts;Intestinal circulating perfusion fluid;Metabolites

      羊耳菊為菊科植物羊耳菊[Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.]的干燥全草,具有疏風(fēng)散熱、解毒消腫的功效,是貴州苗族常用藥材,苗語(yǔ)藥名為“Bex nioux dant”(近似漢譯音為“白牛膽”),在《苗族醫(yī)藥學(xué)》《中華本草·苗藥卷》、2003 版《貴州省中藥、民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中均有收載[1-3]。在傣族,羊耳菊又名“納罕” ,為傣醫(yī)名方“雅叫哈頓散”(收載于 2010年版《中國(guó)藥典》一部)的主藥。 《中國(guó)民族藥志》記載[4]:除苗族、傣族外,羊耳菊在我國(guó)壯、侗、景頗、拉祜、傈僳、苗、彝、佤等少數(shù)民族地區(qū)均有豐富的藥用經(jīng)驗(yàn),常用于感冒發(fā)熱、咽喉腫痛、風(fēng)濕疼痛、癰瘡疔毒、乳癰等癥,有獨(dú)特療效。但羊耳菊基礎(chǔ)研究薄弱一直是亟待解決的技術(shù)問題,特別是羊耳菊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)一直未能明確,導(dǎo)致產(chǎn)品工藝和質(zhì)量控制水平低,很難保證羊耳菊及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量和療效[5],并已成為制約羊耳菊產(chǎn)品升級(jí)換代和產(chǎn)業(yè)鏈做大做強(qiáng)的瓶頸。

      藥物代謝是指藥物吸收和分布之后在血液或組織中的生物轉(zhuǎn)化過程,生物轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物稱為代謝產(chǎn)物。在實(shí)際工作中常見許多中藥提取物在血中根本檢測(cè)不到原型藥物成分,但藥效卻是顯而易見的,究其原因可能是代謝產(chǎn)物發(fā)揮了治療作用[6]。因此,通過代謝研究,可以明確中藥吸收進(jìn)入體內(nèi)的成分及其存在形式,進(jìn)而闡明其代謝途徑和機(jī)制,從而初步明確其藥效物質(zhì)。羊耳菊藥材的臨床研究相關(guān)報(bào)道較多,但鮮有針對(duì)其體內(nèi)吸收代謝情況的研究報(bào)道。腸道不僅是藥物吸收的必經(jīng)主要部位,其存在的代謝酶和相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也同時(shí)參與藥物的生物轉(zhuǎn)化過程,因此藥物在腸道循環(huán)過程,不僅存在吸收過程,還伴隨著藥物代謝。而在體腸灌流模型不僅是研究藥物吸收的簡(jiǎn)單可行的研究方法,更能夠應(yīng)用于藥物腸道代謝特征的研究,相較于各種體外代謝研究方法,更加直觀和可靠[7-9]。因此該研究采用大鼠在體腸灌流模型研究羊耳菊活性部位在大鼠循環(huán)腸灌流液中的代謝產(chǎn)物,對(duì)其在腸道中可能的代謝物進(jìn)行初步研究,以期為闡釋羊耳菊藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      1.1.1 試材。木犀草苷、綠原酸對(duì)照品,批號(hào)分別為111720-201408、110753-201415,均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;新綠原酸、隱綠原酸、1,3-O-二咖啡酰基奎寧酸、3,4-O-二咖啡?;鼘幩?、3,5-O-二咖啡?;鼘幩岷?,5-二-O-咖啡?;鼘幩釋?duì)照品,批號(hào)分別為X20-20141012、Y58-20141012、1384-101215、1384-101215、S34-110121、1384-101215,均購(gòu)于中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心;羊耳菊藥材購(gòu)自貴州龍里縣,由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物羊耳菊[Inula cappa(Buch.-Ham.ex D.Don)DC.]的干燥全草。

      1.1.2 儀器。超高壓效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀(Agilent Technologies 1290 Infinity液相色譜系統(tǒng),布魯克道爾頓四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀);Allegra 64R低溫高速離心機(jī)(Beckman Coulter);MTN-2800D氮吹儀(天津奧特塞恩斯儀器有限公司)。

      1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物。健康SD大鼠,雌雄兼用,體重為(250±20) g,由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供[合格證號(hào):SCXK (渝)2015-0001]。

      1.2 方法

      1.2.1 溶液的配制。

      1.2.1.1 Krebs-Ringers (K-R)營(yíng)養(yǎng)液的配制。

      稱取NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、NaHCO3 1.37 g、NaH2PO4 0.32 g、MgCl2 0.02 g、CaCl2 0.37 g、葡萄糖 1.40 g,用少量蒸餾水溶解,其中CaCl2單獨(dú)溶解后逐滴加入,葡萄糖臨用加入,溶解后用蒸餾水定容至1 L。

      1.2.1.2 羊耳菊活性部位供試液的制備。

      取羊耳菊藥材12 kg,充分混勻,取10倍量60%乙醇,提取3次,每次1 h,合并3次濾液,減壓濃縮,回收乙醇,得12 L濃縮液。上述濃縮液用D101大孔樹脂吸附(徑高比1∶4),加水洗脫至流出液無(wú)顏色后,再用60%乙醇洗脫,收集洗脫液,蒸干,得浸膏,微波真空干燥即得,得膏率為7 %,-4 ℃條件干燥保存,備用。經(jīng)測(cè)定,羊耳菊提取物中木犀草苷、1,3-二咖啡?;鼘幩?、3,4-二咖啡?;鼘幩?、3,5-二咖啡?;鼘幩?、4,5-二咖啡酰基奎寧酸、新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸的含量依次為0.74%、2.01%、3.82%、3.56%、3.87%、2.17%、0.99%、3.36%。

      取適量提取物,加入適量的K-R營(yíng)養(yǎng)液,超聲10 min,5 000 r/min 離心10 min,取上清液備用,獲得2.5、5.0、10.0 mg/mL 的供試液。

      1.2.2 Q-TOF MS/MS質(zhì)譜條件。

      電噴霧離子源;掃描方式為負(fù)離子掃描(ESI-,m/z 50~1 000);毛細(xì)管電壓:ESI-(3.5 kV)、ESI+ (4kV);離子源溫度200 ℃;霧化氣(N2)壓力1.2 bar;干燥氣溫度200 ℃;氣體體積流量6 L/min;準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液;校正模式選用Enhanced Quadratic;數(shù)據(jù)分析采用Data Analysis軟件、Metabolite Tools、質(zhì)量虧損過濾(MDF)等。

      1.2.3 UHPLC色譜條件。

      色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18 RRHD(2.1 mm×100 mm,1.8 μm);柱溫40 ℃;流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈(A)-0.1%甲酸水(B);進(jìn)樣體積為5 μL。梯度洗脫條件:0~1 min,5%~10 %A;1~13 min,10%~28%A;13~16 min,28%~100%A;16~17 min,100%A,17~18 min,100%~5%A。

      1.2.4 灌流液樣品處理。

      取灌流液樣品1 mL, 加入100 μL 1%的甲酸水溶液, 再加入500 μL正丁醇,渦旋混合5 min,萃取3次,合并正丁醇層萃取液,8 000 r/min 離心10 min,取上清液于37 ℃下N2吹干,殘?jiān)? mL正丁醇渦旋混合溶解后,10 000 r/min 離心10 min,取上清液37 ℃下N2吹干,殘?jiān)?00 μL 50 %甲醇水溶解,15 000 r/min 離心10 min,上清液進(jìn)樣UHPLC-Q-TOF/MS分析。

      1.2.5 羊耳菊活性部位在大鼠循環(huán)腸灌流試驗(yàn)中灌流液的收集。

      給藥前大鼠禁食24 h,自由飲水。手術(shù)前腹腔注射30%烏拉坦(1.4 g/kg)麻醉,固定于恒溫手術(shù)臺(tái),37 ℃保溫,剃毛。沿腹中線腹腔開口3~4 cm,小心分離十二指腸,并結(jié)扎總膽管,再分離出試驗(yàn)?zāi)c段,上端切口插入小硅膠管,縫合固定,連接恒流泵,下端切口插入硅膠管,固定,與恒流泵形成回路。灌流前,用37 ℃的生理鹽水以1.0 mL/min 的流速,沖洗腸道至凈,然后排空水分。取37 ℃羊耳菊灌流液50 mL,先以5 mL/min 流速循環(huán)平衡15 min 后,將流速調(diào)節(jié)為 2.5 mL/min,立即讀出循環(huán)液體積并自循環(huán)液量筒中取樣1 mL,作為零時(shí)間藥物濃度的樣品,另向量筒中補(bǔ)加K-R 緩沖液1 mL,于3 h時(shí)同法取灌流液,并結(jié)束試驗(yàn)。試驗(yàn)開始前收集一次空白灌流液,并收集在體循環(huán)灌流試驗(yàn)結(jié)束時(shí)3 h的灌流液樣品,備用。

      1.2.6 灌流液樣品中的代謝產(chǎn)物鑒定。采用UHPLC-Q-TOF/MS法檢測(cè),并運(yùn)用Bruker公司的Data Analysis軟件,得到生物樣品的總離子流圖,二級(jí)質(zhì)譜圖,再結(jié)合Metabolite Predict軟件預(yù)測(cè)的羊耳菊活性部位中多個(gè)有效成分的可能代謝產(chǎn)物,并將生成的Masslist導(dǎo)入Metabolite Detect軟件中,推測(cè)出其可能的代謝產(chǎn)物。

      2 結(jié)果與分析

      由Metabolite Detect得到空白灌流液、灌流液樣品及差異圖譜見圖1,灌流液中共檢測(cè)到3個(gè)代謝產(chǎn)物(表1),鑒定結(jié)果如下。

      (1)M1。在5.8 min處存在m/z 543.127 2[M-H]-的準(zhǔn)分子離子峰,比二咖啡酰基奎寧酸多C2H4,裂解后,產(chǎn)生的m/z 367.103 2碎片離子比單咖啡?;鼘幩岫郈H2,同時(shí)m/z 193.055 9碎片離子比咖啡酸負(fù)離子多CH2,故初步推斷M1可能是二咖啡?;鼘幩岬碾p甲基化產(chǎn)物。

      (2)M2和M3。保留時(shí)間分別為9.2和9.4 min的準(zhǔn)分子離子峰分別為m/z 515.119 2[M-H]-、515.120 2[M-H]-,它們均產(chǎn)生m/z 353.087 0和m/z 353.088 3的碎片離子,與3,4-二咖啡?;鼘幩岷?,5-二咖啡?;鼘幩岬姆肿邮胶唾|(zhì)譜碎片相似,但保留時(shí)間不一致,通過與對(duì)照品對(duì)比,M2和M3可能為二咖啡?;鼘幩嵩诖笫篌w內(nèi)發(fā)生酯基位置異構(gòu)而產(chǎn)生的。

      3 討論

      該研究建立UHPLC-Q-TOF/MS對(duì)灌流液中的羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法,其具有離子傳輸效率高、傳輸離子質(zhì)量范圍寬、靈敏度高、錯(cuò)誤率低、重現(xiàn)性高等優(yōu)點(diǎn),并結(jié)合超高壓液相(UHPLC)的高靈敏度和基

      線穩(wěn)定性為研究帶來(lái)了優(yōu)良的分析能力。試驗(yàn)中18 min即可完成對(duì)復(fù)雜生物樣品的檢測(cè),該方法可對(duì)檢測(cè)樣品色譜信

      息進(jìn)行全采集,且各色譜峰分離較好,為后期分析處理海量的代謝數(shù)據(jù)奠定基礎(chǔ)。此外,樣品檢測(cè)時(shí)選用甲酸鈉溶液為高分辨質(zhì)譜質(zhì)量準(zhǔn)確度校正標(biāo)準(zhǔn)液。批量液質(zhì)聯(lián)用分析時(shí),可每個(gè)樣品進(jìn)行單獨(dú)校正,以消除儀器長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)行時(shí)造成數(shù)據(jù)波動(dòng),確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。在每個(gè)樣品的數(shù)據(jù)中,都有標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)入質(zhì)譜,可運(yùn)用DataAnalysis Version 4.0軟件中選擇相對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品列表與校正模式,對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自動(dòng)匹配并校正。

      在藥物體內(nèi)外代謝研究中,對(duì)代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)的分析處理是重點(diǎn)也是難點(diǎn)。因此,該研究運(yùn)用布魯克公司研發(fā)的數(shù)據(jù)處理工具M(jìn)etabolite Tools TM對(duì)代謝信息進(jìn)行分析。其中包含Metabolite Predict和Metabolite Detect 這2個(gè)相關(guān)軟件,首先根據(jù)藥物中原型成分的結(jié)構(gòu)特征及其在體內(nèi)可能發(fā)生的代謝變化,選擇相應(yīng)的代謝途徑,由Metabolite Predict軟件預(yù)測(cè)出龐大的代謝產(chǎn)物Masslist;將Masslist導(dǎo)入至MetaboliteDetect中,與差異圖譜進(jìn)行匹配,通過差異分析對(duì)可能的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。該研究中發(fā)現(xiàn)羊耳菊活性部位在大鼠灌流液中代謝產(chǎn)物較少,主要存在二咖啡?;鼘幩狨セ恢卯悩?gòu)和甲基化代謝物,為闡釋羊耳菊藥材的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

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