穆文靜 張永明 紅格日其其格

摘要 [目的]尋求操作簡(jiǎn)單、高效的苜蓿二胺氧化酶（DAO）純化方法。[方法]苜蓿種子黑暗培養(yǎng)3 d，幼苗依次經(jīng)硫酸銨沉淀，葡聚糖凝膠G-100（sephadex G-100），DEAE-纖維素以及羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）層析分離純化，最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳。[結(jié)果]最佳分段鹽析的硫酸銨飽和度為20%～50%。經(jīng)一系列層析分離后酶液比活力達(dá)84.67 U/mg，回收率為26%。經(jīng)非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，出現(xiàn)1個(gè)蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為110 kDa。而在變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，出現(xiàn)2個(gè)蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為55和40 kDa。[結(jié)論]苜蓿DAO是由2個(gè)大小不同的亞基組成的異源二聚體。

關(guān)鍵詞 苜蓿；二胺氧化酶；分離純化

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0144-02

Abstract [Objective]To seek a simple and efficient method for purifying the diamine oxidase from alfalfa. [Method] Alfalfa seeds were cultured in darkness for 3 days. The seedlings were isolated and purified by ammonium sulfate precipitation， dextran gel G100 （sephadex G100）， DEAEcellulose and hydroxyapatite （HAP），finally， polyacrylamide gel electrophoresis. [Result] The best fraction of salting out ammonium sulfate saturation was 20%-50%. After a series of chromatographic separation， the specific activity of the enzyme reached 84.67 U/mg， and the recovery rate was 26%. After the nondenaturing polyacrylamide gel electrophoresis， a protein band appeared with a relative molecular mass of about 110 kDa.But after denaturing polyacrylamide gel electrophoresis， two protein bands appeared at a relative molecular mass of about 55 kDa and 40 kDa. [Conclusion] Diamine oxidase from alfalfa is a heterodimer composed of two subunits of different sizes.

Key words Alfalfa；Diamine oxidase；Separation and purification

二胺氧化酶（Diamine Oxidase，DAO）是一種能催化二胺底物如腐胺和尸胺氧化能力的酶，屬于含銅胺氧化酶。在豌豆、鷹嘴豆、扁豆和大豆等豆科類植物中，二胺氧化酶是較豐富的細(xì)胞壁可溶性蛋白質(zhì)，其活性受光敏素的控制[1]。在豆科植物幼苗生長(zhǎng)期、機(jī)械損傷的響應(yīng)期及病原菌入侵期，二胺氧化酶活性與過(guò)氧化氫酶有功能性聯(lián)系[2]。

目前有關(guān)苜蓿二胺氧化酶的研究國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者擬對(duì)苜蓿幼苗二胺氧化酶進(jìn)行分離純化，旨在為研究該酶的結(jié)構(gòu)及酶學(xué)性質(zhì)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)尋求操作簡(jiǎn)單、實(shí)用及高效的純化方法。

1 材料與方法

1.1 材料

苜蓿種子購(gòu)置于東京丸種公司（日本），以黑暗條件下生長(zhǎng)3 d的苜蓿幼苗為酶液提取材料。

1.2 DAO活性測(cè)定

DAO活性測(cè)定采用稍作改進(jìn)的Awal和Hirasawa法[3]。

1.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

使用Folin-酚法檢測(cè)酶液蛋白質(zhì)含量。

1.4 粗酶液的提取

稱取50 g苜蓿黃化苗，加入50 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0），放入勻漿機(jī)內(nèi)粉碎。過(guò)濾，濾液在4 ℃、12 000 r/min離心20 min，得粗酶提取液。

1.5 DAO的分離純化

經(jīng)鹽析得到沉淀物，然后用磷酸緩沖液對(duì)沉淀物進(jìn)行溶解，再次離心得粗酶上清液。粗酶上清液依次用葡聚糖凝膠G-100（sephadex G-100）、DEAE-纖維素以及羥基磷灰石（Hydroxyapatite）層析柱進(jìn)行分離純化。每次過(guò)柱后用分光光度法進(jìn)行酶活性測(cè)定及用Folin-酚法測(cè)定蛋白含量。對(duì)純化后的酶液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），確定苜蓿二胺氧化酶的純化度和相對(duì)分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸銨沉淀

從圖1可以看出，用硫酸銨分級(jí)沉淀粗酶液，飽和度20%～30%至20%～50%時(shí)，DAO酶活力增加，飽和度為30%～40%、30%～50%、40%～50%時(shí)，DAO酶活力減小。硫酸銨飽和度為20%～50%時(shí)，DAO酶活力高。通過(guò)查閱文獻(xiàn)和材料分析，最終選定硫酸銨飽和法除去雜蛋白，且酶的比活性及產(chǎn)率都較高。

2.2 層析分離

將硫酸銨飽和法得到的沉淀用磷酸鉀緩沖液溶解，并再次離心提取上清液。上清液依次用葡聚糖凝膠G-100（sephadex G-100），DEAE-纖維素以及羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP）層析分離，結(jié)果見(jiàn)表1。分離純化過(guò)程中，酶活力逐漸降低，比活力逐漸升高，且在經(jīng)羥基磷灰石柱層析后比活力達(dá)到了硫酸銨沉淀后的8倍，這對(duì)獲得電泳均一的酶蛋白是必要的。

2.3 電泳 對(duì)分離純化得到的苜蓿酶液進(jìn)行變性和非變性條件下的不連續(xù)聚丙烯酰氨凝膠電泳，對(duì)其DAO純度和相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行確定。采用Laemmli法（1970年）進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，根據(jù)低分子標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)（lgMW）與Rf值的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線（圖2）。在非變性聚丙烯酰凝膠電泳后，出現(xiàn)1個(gè)蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為110 kDa（圖3a）。而在變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，出現(xiàn)2個(gè)蛋白質(zhì)條帶，相對(duì)分子質(zhì)量約為55 kDa和40 kDa（圖3b、c）。這說(shuō)明苜蓿DAO是由大小不同的2個(gè)亞基組成的異源二聚體。而在其他豆科植物（如豌豆和蠶豆）的研究中發(fā)現(xiàn)，DAO均由2個(gè)亞基組成，但2個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)是相同的，每個(gè)亞基都含1個(gè)Cu2+（豌豆幼苗DAO還存在多

巴醌輔助因子），并且2個(gè)亞基共用1個(gè)羰基，這說(shuō)明不同物種的DAO在結(jié)構(gòu)上存在較大差異[4-6]。

3 結(jié)論

研究表明，采用不同飽和度的硫酸銨進(jìn)行分段沉淀雜蛋白質(zhì)時(shí)，鹽析最佳分段的硫酸銨飽和度為20%～50%；勻漿粗提取液酶活力為225.98 U，蛋白質(zhì)含量為77.0 mg，經(jīng)硫酸銨沉淀后，酶活力為135.21 U，蛋白質(zhì)含量為13.00 mg，酶液回收率為60%；葡聚糖凝膠G-100洗脫后，酶活力為104.65 U，蛋白質(zhì)含量為8.0 mg，酶液回收率為46%；再經(jīng)DEAE-纖維素柱層析后，酶活力為85.20 U，蛋白質(zhì)含量為3.0 mg，酶液回收率為37%；最后經(jīng)羥基磷灰石柱層析洗脫分離后，酶活力為59.27 U，蛋白質(zhì)含量為0.7 mg，酶液回收率為26%；經(jīng)非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，出現(xiàn)1個(gè)蛋白質(zhì)條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為110 kDa；而在變性聚丙烯酰氨凝膠電泳后，出現(xiàn)2個(gè)蛋白質(zhì)條帶，其相對(duì)分子質(zhì)量約為55 kDa和40 kDa。結(jié)果表明苜蓿DAO是異源二聚體，由2個(gè)大小不同的亞基組成。

參考文獻(xiàn)

[1] 胡文婷.多胺氧化降解在大豆子葉節(jié)分化形成不定芽和不定根中的作用[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2012.

[2] 王明祖，何生根，楊暹.菜豆多胺氧化酶的分離提純及催化性質(zhì)研究[J].仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，20（1）：9-12.

[3] AWAL H M A，HIRASAWA E J.Diamine oxidase from millet catalyzes the oxidation of 1，3-diaminopropane[J].Journal of plant research，1995，108（3）：395-397.

[4] 蘇國(guó)興，劉友良.高等植物體內(nèi)的多胺分解代謝及其主要產(chǎn)物的生理作用[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22（4）：408-418.

[5] 王萍，周鋒，周元嬌.基因型對(duì)誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)不定芽的影響[J].淮海工學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，21（3）：71-74.

[6] 張永明，平澤栄次.四種禾本科植物幼苗中單胺氧化酶的分離與純化[C]//留日中國(guó)人生命科學(xué)協(xié)會(huì)第13回學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集.[出版地不詳]：[出版者不詳]，2011：42-43.