植物細(xì)胞重編程機(jī)制及其在苔蘚植物中的研究進(jìn)展

張曉青 楊靜薇 王嘉靖

摘要 重編程在植物組織培養(yǎng)和干細(xì)胞治療等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，影響陸生植物重編程的分子機(jī)制還不清楚，而且缺少從進(jìn)化-發(fā)育角度對重編程的研究。通過建立模式生物小立碗蘚的再生體系，研究共有因子PpCSP1/Lin28調(diào)控高等植物重編程的作用機(jī)制，并對今后的研究進(jìn)行展望。

關(guān)鍵詞 細(xì)胞重編程；小立碗蘚；擬南芥；冷激蛋白

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0148-03

Abstract Reprogramming has potential applications value in plant tissue culture and stem cell therapy，but its molecular mechanism is still unknown in land plants，and there is a lack of research on reprogramming from evolutiondevelopmental perspective.In this paper，the regulation mechanism of the cofactor PpCSP1 / Lin28 on reprogramming of higher plant was studied by establishing the regenerative system of Physcomitrella patens，and the future research was prospected.

Key words Cellular reprogramming；Physcomitrella patens；Arabidopsis thaliana；Coldshock domain protein

干細(xì)胞（stem cell）具有自我更新（selfrenew）和產(chǎn)生可分化細(xì)胞的能力[1]。雖然多細(xì)胞性（multicellularity）和干細(xì)胞系統(tǒng)在陸生植物（land plants）和后生動(dòng)物（metazoa）中獨(dú)立進(jìn)化而來，但是二者的干細(xì)胞形成和維持存在相似之處。陸生植物和后生動(dòng)物干細(xì)胞的維持均由其所處的微環(huán)境，即干細(xì)胞小生境（stem cell niche）所控制[2-4]。干細(xì)胞小生境的穩(wěn)態(tài)調(diào)控對干細(xì)胞的自我更新及分化成新的組織和器官至關(guān)重要。

在陸生植物和后生動(dòng)物中，已分化的細(xì)胞在特定條件下自身細(xì)胞命運(yùn)可以逆轉(zhuǎn)為干細(xì)胞，這個(gè)過程稱為重編程（reprogram）。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞（induced Pluripotent Stem Cell，iPSC）的發(fā)現(xiàn)是重編程研究中的重大突破，即誘導(dǎo)表達(dá)Oct4、Sox2、cMyc和Klf4 （Krueppellike factor 4）這4個(gè)因子能夠使體細(xì)胞重編程為多功能干細(xì)胞[5-6]。此外，另一組多功能干細(xì)胞因子Oct4、Sox2、Nanog和Lin28的表達(dá)也能夠成功誘導(dǎo)人成纖維細(xì)胞成為iPSC [7]。iPSC的發(fā)現(xiàn)證明了哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞可以重編程為多功能干細(xì)胞。同樣，在模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）里異位表達(dá)一些干細(xì)胞因子，如WUS （WUSCHELRELATED HOMEOBOX 5）、PLT （PLETHORA）、BBM （BABY BOOM），也能異位再生干細(xì)胞小生境和體細(xì)胞胚[8-10]。雖然重編程廣泛發(fā)生于陸生植物和后生動(dòng)物中，但目前人們對其分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)還十分有限。通過建立模式生物小立碗蘚（Physcomitrella patens）的再生體系，研究共有因子PpCSP1/Lin28調(diào)控高等植物重編程的作用機(jī)制，以期揭示這一基本生命現(xiàn)象的進(jìn)化-發(fā)育生物學(xué)意義[11]。

1 高等植物細(xì)胞重編程

植物的重編程能力普遍強(qiáng)于動(dòng)物。在合適的植物激素（生長素/細(xì)胞分裂素）處理下，已分化的細(xì)胞可以形成一團(tuán)脫分化的細(xì)胞，即愈傷組織（callus）。愈傷組織可以再生出包含干細(xì)胞的莖端分生組織（shoot apical meristem，SAM）和根端分生組織（root apical meristem，RAM） [12]。來源于胡蘿卜根的單一細(xì)胞能夠經(jīng)過愈傷組織再生出完整的植株，證實(shí)了植物細(xì)胞在特定條件下能夠重編程為全能干細(xì)胞（totipotent stem cell）[13]。在模式植物擬南芥中，一些參與愈傷組織形成的基因被鑒定出來。Fan等[14]發(fā)現(xiàn)LATERAL ORGAN BOUNDARIES DOMAIN（LBD）家族轉(zhuǎn)錄因子LBD16、LBD17、LBD18和LBD29受生長素調(diào)控，能夠強(qiáng)烈誘導(dǎo)擬南芥?zhèn)雀男纬桑^量表達(dá)這4個(gè)基因中的任意一個(gè)即可不依賴外源激素而誘導(dǎo)愈傷組織的形成。He等[15]發(fā)現(xiàn)clf （curly leaf）突變體的葉片在合適的激素處理下并不能形成愈傷組織，而隨后針對葉片組織和愈傷組織在基因組水平的H3K27me3變化研究表明，PRC2 （polycomb repressive complex 2）介導(dǎo)的H3K27me3是葉片組織向愈傷組織轉(zhuǎn)化所必須的。Li等[16]報(bào)道WUSCHEL基因的DNA甲基化和組蛋白修飾對愈傷組織形成莖端分生組織至關(guān)重要。損傷同樣可以導(dǎo)致擬南芥愈傷組織的形成，但其分子機(jī)制與激素誘導(dǎo)形成愈傷組織不同。損傷能夠誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子WIND1（WOUND INDUCED DEDIFFERENTIATION 1）上調(diào)表達(dá)。過量表達(dá)WIND1可以在沒有外源激素的情況下增強(qiáng)愈傷組織的形成[17]。盡管陸生植物和后生動(dòng)物干細(xì)胞系統(tǒng)有相似性（圖1），但是陸生植物和后生動(dòng)物重編程的機(jī)制是否類似尚不清楚[2-4]。

2 苔蘚植物細(xì)胞重編程

2.1 模式植物小立碗蘚具有很強(qiáng)的重編程能力

小立碗蘚是第1個(gè)基因組被測序的苔蘚植物種，其作為模式植物優(yōu)點(diǎn)眾多，它具有很高的基于同源重組的基因打靶（gene targeting）效率，其單倍體世代（haploid generation）占優(yōu)勢，因而不需要得到純合植株即可研究其發(fā)育過程[18]。莖葉體（gametophore）在原絲體（protonemata）上形成，存在于單倍體世代，由單層細(xì)胞的葉片組成。從莖葉體切割已分化的葉片，培養(yǎng)于不含植物激素的培養(yǎng)基中，葉片切口處的細(xì)胞會(huì)重編程為綠絲體（chloronema）頂端干細(xì)胞?；谠撝鼐幊腆w系，可以在細(xì)胞水平研究重編程的過程[19]。在擬南芥里，通過分析重編程過程中的轉(zhuǎn)錄譜變化，鑒定出一些參與重編程的關(guān)鍵基因，如CDKA （CyclinDependent Kinase A）及WOX13L （WUSCHELrelated homeobox 13like） [19-21]。Wang等[22]和Xiao等[23]分別研究了小立碗蘚原生質(zhì)體重編程為干細(xì)胞過程中轉(zhuǎn)錄譜和磷酸化蛋白質(zhì)組的變化。

2.2 進(jìn)化保守的因子PpCSP1/Lin28參與陸生植物和后生動(dòng)物的重編程

前期研究發(fā)現(xiàn)，小立碗蘚PpCSP1（Physcomitrella patens ColdShock Domain Protein 1）蛋白與后生動(dòng)物中Lin28存在最高的序列相似性以及相同的結(jié)構(gòu)域，并參與陸生植物的重編程（圖2，修改自Li等[11]）。

冷激蛋白（coldshock domain protein）能夠與單鏈DNA/RNA或雙鏈DNA結(jié)合，在細(xì)菌、陸生植物及后生動(dòng)物中高度保守[24]。Lin28在線蟲（Caenorhabditis elegans）中首次被報(bào)道，是調(diào)控發(fā)育時(shí)期的異時(shí)基因（heterochronic gene）。另一異時(shí)基因microRNA let-7能夠直接與Lin28的3-UTR區(qū)域結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制Lin28 [25]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，Lin28能夠直接抑制let-7轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的成熟過程，而let-7反過來會(huì)抑制Lin28自身[26]。除調(diào)控干細(xì)胞外，過量表達(dá)Lin28以及轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2和Nanog，能夠促進(jìn)人成纖維細(xì)胞重編程為具有自我更新能力的iPS細(xì)胞[7]。這些研究結(jié)果表明，Lin28在多功能干細(xì)胞的自我更新中起關(guān)鍵作用。CLIPseq（CrossLinking Immuno Precipitation sequencing）試驗(yàn)表明，RNA結(jié)合蛋白Lin28可以結(jié)合眾多的mRNA，其結(jié)合偏好于GGAG或與GGAG類似的基序[27]。異位表達(dá)Lin28可以增強(qiáng)小鼠的組織修復(fù)能力，該功能是通過Lin28促進(jìn)其結(jié)合的氧化代謝反應(yīng)相關(guān)酶的翻譯而調(diào)控的，這表明Lin28通過氧化應(yīng)激代謝網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)[28]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，小立碗蘚PpCSP1蛋白與其哺乳動(dòng)物同源蛋白Lin28有著類似的功能，即增強(qiáng)從已分化細(xì)胞到干細(xì)胞的重編程過程[23]。PpCSP1在原絲體干細(xì)胞中積累表達(dá)并特異在離體葉片切口處干細(xì)胞中富集，表明PpCSP1參與重編程的過程。PpCSP1的表達(dá)受其3-UTR負(fù)調(diào)控，移除3-UTR能夠使PpCSP1的轉(zhuǎn)錄本更穩(wěn)定，從而使其轉(zhuǎn)錄本和蛋白得到積累，最終增強(qiáng)重編程過程。通過基因打靶技術(shù)將小立碗蘚基因組中4個(gè)PpCSP基因敲除后，4重敲除突變體的重編程過程與野生型相比相對延遲[11]。這些結(jié)果表明PpCSP1是小立碗蘚中重編程的正調(diào)控因子，其功能與哺乳動(dòng)物iPSC因子Lin28類似。PpCSP1/Lin28作為陸生植物和后生動(dòng)物調(diào)控重編程的共有因子，其發(fā)現(xiàn)豐富了對進(jìn)化-發(fā)育（EvoDevo）過程中重編程的理解。

3 展望

重編程是陸生植物和后生動(dòng)物里非常有趣的現(xiàn)象，其在植物組織培養(yǎng)和干細(xì)胞治療等領(lǐng)域有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前，對陸生植物重編程的分子機(jī)制還不清楚。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)了一個(gè)陸生植物和后生動(dòng)物調(diào)控重編程的共有因子PpCSP1/Lin28。有趣的是，陸生植物和后生動(dòng)物在單細(xì)胞階段即分開并獨(dú)立進(jìn)化，為何存在共有因子來調(diào)控重編程、其重編程的調(diào)控機(jī)制是否也存在共性是未來研究的重要方向。筆者所在團(tuán)隊(duì)研究結(jié)果提示可能參與PpCSP1調(diào)控ROS（reactive oxygen species）水平，而ROS水平的變化可能通過DNA損傷途徑來調(diào)控重編程。值得注意的是，ROS和DNA損傷廣泛存在于生物中，這提示ROS和DNA損傷可能是陸生植物和后生動(dòng)物中重編程調(diào)控的共性之一。未來可以通過研究PpCSP1、ROS、DNA損傷這三者在調(diào)控重編程中的關(guān)系來闡明PpCSP1調(diào)控重編程的分子機(jī)制，從而為闡明陸生植物重編程的機(jī)理提供理論基礎(chǔ)，并與后生動(dòng)物重編程的分子機(jī)制相比較，來進(jìn)一步理解進(jìn)化-發(fā)育中重編程調(diào)控的共性問題。

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