盧東　 楊洪明　 花秋艷　 吳洪武

摘 要：對一株產(chǎn)纖維素酶的黃曲霉進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)初步探究，利用DNS法測定CMC酶活、濾紙酶活，結(jié)果顯示此菌株纖維素酶最佳反應(yīng)溫度為50℃，最佳反應(yīng)pH為7.0。在金屬離子中，發(fā)現(xiàn)Zn2+具有抑制作用，最大抑制濃度為0.4 mg/mL，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+具有促進(jìn)作用，最適濃度分別為0.4、1、1、0.8、1.4 mg/mL。蛋白胨和酵母粉具有促進(jìn)作用，最適濃度分別為1.0%、0.6%，最適pH為6.0。綜合優(yōu)化后，測得濾紙酶活和CMC酶活分別為7.73 U/mL、11.28 U/mL，相比優(yōu)化前提高了38.8%和43.7%。

關(guān)鍵詞：纖維素；CMC酶活；濾紙酶活；發(fā)酵條件優(yōu)化

每年，地球上植物通過光合作用凈生成至少有 10 億噸能源物質(zhì)，其中大部分為纖維類物質(zhì)。那些纖維素類物質(zhì)經(jīng)過工藝化處理，被分解為糖類，比如葡萄糖、麥芽糖，并可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為燃料乙醇。利用纖維素和半纖維素，其關(guān)鍵步驟是水解纖維成分，即將植物細(xì)胞壁中的碳水化合物降解成還原糖，而纖維素酶為該關(guān)鍵步驟中唯一催化酶[1]。

現(xiàn)在， 有很多能夠降解纖維素的微生物， 其中我們最熟悉的是真菌， 如木霉屬、曲霉屬、青霉屬，對細(xì)菌、放線菌研究較少。分離、篩選能夠高產(chǎn)纖維素酶， 有效降解纖維素的微生物，是利用纖維素材料的重要前提， 對解決當(dāng)今世界所面臨的糧食短缺、飼料資源緊張、能源危機(jī)和環(huán)境污染等問題具有深遠(yuǎn)的意義[2—4]。

因此，本實(shí)驗(yàn)對從土壤中篩選出一種纖維素酶活性較高的黃曲霉，對其酶學(xué)性質(zhì)初步探究，為今后的研究做好基礎(chǔ)工作。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

黃曲霉保存于貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基：PDA

發(fā)酵培養(yǎng)基：KNO3 2g，NaCl 1g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 1g，乳酸 0.2%，羧甲基纖維素鈉 1%，H2O 1000mL，pH自然，121℃滅菌30min。

1.1.3 試劑

DNS溶液[9]，pH 4.8檸檬酸鈉緩沖液[10]，1%羧甲基纖維素鈉溶液（用pH 4.8檸檬酸鈉緩沖液配制），1 mol/L NaOH 溶液，1 mol/L HCl 溶液，1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 方法

1.2.1 制備粗酶液

先將目的菌株接種到PDA種子活化培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24h，然后按2.5%接種量，接到50mL發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，搖床參數(shù)設(shè)置為28℃，120r/min，培養(yǎng)72h，取上清液，離心5min，轉(zhuǎn)速5400r/min。

1.2.2 纖維素酶活測定

酶活定義：在50 ℃條件下，每分鐘每毫升酶液水解含纖維素底物釋放出1 μmol 葡萄糖的酶量為1 個酶活單位（U）。

CMC酶活： 將一定量種子液加入液體培養(yǎng)基發(fā)酵72h，28℃。取0.5 mL待測酶液（空白對照不加），加入到1.5mL按上述條件配好的1%羧甲基纖維素鈉溶液中50℃，水浴鍋中反應(yīng)0.5h，然后，加入1 mL DNS顯色，空白對照加入0.5 mL待測酶液后，沸水浴5min，待溶液冷卻后定容至20mL，分光光度計(jì)測OD值，跟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，算出酶活。

濾紙酶活：先將濾紙剪成長為1.5cm，寬為0.5cm的濾紙條，折出v字型，放入滅菌的培養(yǎng)皿內(nèi)，在60℃恒溫培養(yǎng)箱里干燥30min，然后在每只試管內(nèi)放入3張濾紙條，保證交叉放置，再加入0.5mL待測酶液（空白管不加），加入緩沖液1.5mL，在50℃水浴鍋中反應(yīng)0.5h后，向各管中加入1mL DNS溶液，空白管加入0.5mL待測酶液，沸水浴中5min，冷卻后定容至20mL，分光光度計(jì)測OD值，跟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，算出酶活。

酶活計(jì)算公式：I=m×n×5 .56v×t

式中，I為酶活（U）；m為葡萄糖生成量（mg）；v為反應(yīng)液中酶液加入量（mL）；n為樣品的稀釋倍數(shù)；t 為反應(yīng)時間（min）。

1.2.3 反應(yīng)溫度和pH對纖維素酶的影響

反應(yīng)溫度設(shè)置3個梯度，分別為40℃、50℃、60℃；pH設(shè)置5個梯度，分別為4、5、6、7、8，溫度用水浴鍋控制，pH梯度用pH4.8的檸檬酸鈉緩沖液和1 mol/L的NaOH溶液調(diào)制，分別測定各個條件下的CMC酶活和濾紙酶活。

1.2.4 金屬離子的纖維素酶活的影響

選取6種金屬離子：Zn2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ca2+，每種金屬離子設(shè)置8個梯度，濃度分別為（mg/mL）：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6，以不添加金屬離子的發(fā)酵培養(yǎng)基為對照；pH設(shè)置6個梯度：4、5、6、7、8、9；蛋白胨設(shè)置8個梯度，含量為：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；酵母粉設(shè)置4個梯度：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，按照這些條件配制發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖床上，28℃，120r/min，發(fā)酵72h后，測定濾紙酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對纖維素酶活的影響

2.1.1 發(fā)酵pH對纖維素酶活的影響

用緩沖液對發(fā)酵液pH進(jìn)行控制，pH分別是4、5、6、7、8、9。搖床培養(yǎng)72h，制備粗酶液，測定濾紙酶活，結(jié)果如下：

通過圖1可以得出，此菌株濾紙酶活在發(fā)酵pH為6.0時酶活最高，為6.56 U/mL。在最適pH6兩側(cè)，酶活都普遍下降，所以此菌株的最適發(fā)酵pH為6。

2.1.2 蛋白胨對纖維素酶活的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的蛋白胨，搖床培養(yǎng)72h，測定濾紙酶活，結(jié)果如下：

通過圖2可以得出，蛋白胨對纖維素酶的促進(jìn)作用不明顯，只對纖維素酶活提高不多。在蛋白胨濃度為1.0%，酶活最大，為6.52 U/mL，在最適濃度兩側(cè)，下降趨勢較平緩。

2.1.3 酵母粉對纖維素酶活的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同濃度的酵母粉，搖床培養(yǎng)72h，測定濾紙酶活，結(jié)果如下：

通過圖3可以得出，酵母粉對濾紙酶活有一定的促進(jìn)作用，最適濃度為0.6%，此時酶活為7.61 U/mL，與蛋白胨相比，促進(jìn)效果更明顯。

2.2 金屬離子對纖維素酶活的影響

不同濃度Mg2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+分別加在發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，搖床上發(fā)酵72h后，制備粗酶液，測定濾紙酶活，結(jié)果如下：

通過圖4可以得出，Mg2+對纖維素酶具有促進(jìn)作用，最適濃度為0.4mg/mL，此時酶活為6337 U/mL，在越過最適濃度后，促進(jìn)作用比較平緩；Fe3+對纖維素酶具有激活作用，最適濃度為0.8mg/mL，此時酶活為6519 U/mL，相對于Mg2+來說，F(xiàn)e3+的促進(jìn)作用比較明顯；Zn2+對纖維素酶具有抑制作用，最大抑制濃度0.4mg/mL，此時酶活為5.70 U/mL，整體抑制趨勢比較平緩，波動不大；Mn2+對纖維素酶具有激活作用，最適濃度為1mg/mL，此時酶活為7.11 U/mL，Mn2+在金屬離子當(dāng)中促進(jìn)效果最高，整體走勢較明顯；Fe2+對纖維素酶具有激活作用，最適濃度為1.4mg/mL，此時酶活為6.29 U/mL，沒有Fe3+的促進(jìn)效果好，整體趨勢較平穩(wěn)；Ca2+對纖維素酶具有激活作用，最適濃度為1mg/mL，此時酶活為6.56 U/mL，激活效果僅次于Mn2+，整體趨勢明顯。總之因?yàn)榻饘匐x子各不相同，所以對纖維素酶活的影響也各不相同，由高到低排列為Mn2+>Ca2+>Fe3+>Mg2+>Fe2+>Zn2+。

2.3 酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.3.1 反應(yīng)溫度對纖維素酶活的影響

經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵36h后，在不同反應(yīng)溫度下測定濾紙酶活和CMC酶活，結(jié)果如下：

通過表1可以看出50℃是CMC酶活和濾紙酶活都高于40℃和60℃，因此此菌株纖維素酶活性最適反應(yīng)溫度為50℃。

2.3.2 反應(yīng)pH對纖維素酶活的影響

經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵36h后，測定濾紙酶活和CMC酶活，結(jié)果如下：

通過表2可以看出，此菌株纖維素酶活性最適反應(yīng)pH為7.0，酸性和堿性條件對纖維素酶活都有一定的降低。在pH7.0時CMC酶活和濾紙酶活達(dá)到最大，分別是5.92和2.99U/mL。

3 結(jié)論

根據(jù)以上發(fā)酵條件所得出的最適條件，選擇Mn2+ 1.0mg/mL，酵母粉0.6%，加入到發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，pH調(diào)到6.0，發(fā)酵72h后，測得濾紙酶活和CMC酶活分別為7.73 U/mL、11.28 U/mL，相比優(yōu)化前提高了38.8%和43.7%。金屬離子對纖維素酶活的影響，由高到低排列為Mn2+>Ca2+>Fe3+>Mg2+>Fe2+>Zn2+。

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基金項(xiàng)目：大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃（項(xiàng)目：201510663002）