轉(zhuǎn)植酸酶玉米安全性評(píng)價(jià)研究進(jìn)展

譚燕華 謝翔 夏啟玉 張麗麗 霍姍姍 張家明 郭安平

摘 要 玉米種子含有豐富的磷，但大部分磷以植酸磷的形式存在，難以被豬和禽類(lèi)等單胃動(dòng)物利用。轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米是中國(guó)唯一獲得安全證書(shū)的轉(zhuǎn)基因玉米，含有高濃度的植酸酶，能夠提高動(dòng)物對(duì)植酸磷的利用率；減少排泄物對(duì)環(huán)境的污染，具有商業(yè)化種植前景。轉(zhuǎn)基因作物需要進(jìn)行必要的安全評(píng)價(jià)。本文綜述了近年來(lái)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米安全性評(píng)價(jià)研究，主要包括轉(zhuǎn)植酸酶基因和目標(biāo)蛋白的檢測(cè)、食用安全性評(píng)價(jià)、環(huán)境安全評(píng)價(jià)及非預(yù)期影響的研究，并對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米應(yīng)用及安全評(píng)價(jià)體系的發(fā)展作了展望。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因玉米；安全評(píng)價(jià)；植酸酶

中圖分類(lèi)號(hào) S514 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Maize is one of the most important feed crops in China and it is rich in phosphorus. However， most phosphorus is trapped in phytate phosphorus and which is difficult to be used by animals such as pigs and poultry. Phytase transgenic maize contains high concentration of phytase and can increase the phosphate uptake of animals， which is the only transgenic maize that has been officially issued with a biosafety certificate in China and has great potential in the animal feed industry. Genetically modified crops should carry out safety evaluation before commercial application. In this article， we mainly reviewed the safety evaluation of phytase transgenic maize in recent years， including phytase gene and protein detection， food safety evaluation， environmental safety evaluation， and unintended effects. The application of phytase transgenic maize and the development of safety evaluation system were also discussed.

Key words Transgenic maize； safety evaluation； phytase

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.032

玉米是我國(guó)重要的糧食和飼料用作物，生產(chǎn)中每年大約80%的玉米用于飼料行業(yè)。磷是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育不可缺少的元素之一，玉米中含有豐富的磷，但大部分的磷是以植酸磷的形式存在，這種形式存在的磷難以被豬和禽類(lèi)等單胃動(dòng)物利用。因此，能夠增加動(dòng)物磷酸鹽攝取的轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)顯得非常重要和有必要。植酸酶（phytase）是催化植酸及其鹽類(lèi)水解為肌醇與磷酸鹽的酶的總稱(chēng)，是一種可使植酸磷復(fù)合物中的磷變成可利用磷的酸性磷酸酯酶。陳茹梅等用玉米胚特異性球蛋白-1啟動(dòng)子在玉米種子中過(guò)表達(dá)黑曲霉（Aspergillus niger）菌株的植酸酶基因，得到了含有高濃度植酸酶的轉(zhuǎn)基因玉米，其植酸酶活性達(dá)到約2 200 U/kg種子，比非轉(zhuǎn)基因玉米種子約增加了50倍[1]，完全能滿(mǎn)足生產(chǎn)應(yīng)用需要，可以替代傳統(tǒng)方式中用微生物發(fā)酵生產(chǎn)的植酸酶[2]。目前，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米是我國(guó)唯一獲得安全證書(shū)的轉(zhuǎn)基因玉米，但還未進(jìn)行商業(yè)化種植。轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植前必須進(jìn)行必要的安全評(píng)價(jià)。近年來(lái)，已對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米安全性評(píng)價(jià)進(jìn)行了許多研究。

1 植酸酶基因玉米轉(zhuǎn)化事件和目標(biāo)蛋白的檢測(cè)

隨著轉(zhuǎn)植酸酶基因作物的開(kāi)發(fā)和對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的監(jiān)管要求，需要準(zhǔn)確地對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行驗(yàn)證[3]。為了對(duì)轉(zhuǎn)基因作物目標(biāo)基因進(jìn)行檢測(cè)，已對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米進(jìn)行了定性、定量PCR檢測(cè)技術(shù)方法的研究[4-5]，農(nóng)業(yè)部已于2012年頒布了植酸酶基因玉米定性PCR檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（農(nóng)業(yè)部 1782 號(hào)公告-11-2012），詳細(xì)的方法見(jiàn)表1。李俊等以真菌來(lái)源的植酸酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，建立了植酸酶基因的特異性檢測(cè)方法，可檢測(cè)各種含有該基因的轉(zhuǎn)基因作物；同時(shí)還構(gòu)建了陽(yáng)性質(zhì)粒分子pBS Endogenous-phytase，可作為轉(zhuǎn)植酸酶基因作物的檢測(cè)陽(yáng)性材料[6]（圖1）。

酵母中表達(dá)和純化的phyA2蛋白被糖基化，其分子量約為75 ku；去糖基化蛋白的分子量從氨基酸序列預(yù)測(cè)約為55 ku；植酸酶蛋白在轉(zhuǎn)基因玉米種子樣品中顯示的帶約60 ku[1]。對(duì)目標(biāo)蛋白植酸酶蛋白的檢測(cè)進(jìn)行了ELISA、Western blot、免疫親和層析等多種方法的研究[7-8]。閆廣為等用60%～80%硫酸銨分級(jí)沉淀植酸酶，得到的植酸酶比活要比粗提液高6.1倍[8]。種子中提取的轉(zhuǎn)植酸酶基因蛋白帶在SDS-PAGE不分離[1]，趙倩倩等用80%硫酸銨沉淀植酸酶蛋白粗提液，透析后再通過(guò)免疫親和層析得到了在 SDS-PAGE膠上單一條帶的植酸酶蛋白[7]。Zhou等開(kāi)發(fā)了一種快速免疫層析側(cè)流裝置，運(yùn)用4種單克隆抗體（EH10a，F(xiàn)A7，AF9a，和CC1），能夠快速檢測(cè)出轉(zhuǎn)基因玉米中重組尼日爾曲霉phyA2表達(dá)蛋白[9]（圖2）。

2 轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米食用安全性評(píng)價(jià)

對(duì)轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米進(jìn)行食用安全性評(píng)價(jià)時(shí)，首先比較了轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩谞I(yíng)養(yǎng)成分的差異。轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩紫啾?，在主要成分（蛋白質(zhì)、脂肪、氨基酸、淀粉、水分、灰分等）、微量營(yíng)養(yǎng)成分（礦物質(zhì)、維生素）等方面，沒(méi)有生物學(xué)意義上的差異，具有實(shí)質(zhì)等同性。但轉(zhuǎn)基因玉米中植酸酶活性明顯高于非轉(zhuǎn)基因玉米，非植酸磷含量比非轉(zhuǎn)基因玉米高1倍[10]。Gao等報(bào)道，轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米與常規(guī)玉米相比，植酸酶活性有顯著差異（p<0.001），但化學(xué)成分差異不顯著。其中粗蛋白、總能量、總脂肪、灰分和礦物質(zhì)含量差異不顯著（p>0.05）；氨基酸分析顯示2種玉米的氨基酸含量也相似（p>0.05）。不過(guò)2種玉米在濕度上有顯著性差異（p<0.001）[11]。

食用安全性分析顯示，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米作為飼料喂養(yǎng)肉仔雞，對(duì)其生長(zhǎng)性能[12]、血清生理生化指標(biāo)、免疫器官發(fā)育及免疫功能[13]均無(wú)不良影響，未出現(xiàn)“非期望效應(yīng)”；對(duì)蛋雞的產(chǎn)蛋性能和雞蛋品質(zhì)均無(wú)影響[14-16]。對(duì)長(zhǎng)期（50周）喂養(yǎng)植酸酶轉(zhuǎn)基因玉米的蛋雞檢測(cè)了食糜、血液、組織、和雞蛋中的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源植物DNA片段和蛋白質(zhì)，分析發(fā)現(xiàn)phyA2基因和蛋白在消化道很快降解，沒(méi)有在血液、組織和雞蛋中檢測(cè)到phyA2基因和蛋白[15]。喂食轉(zhuǎn)基因玉米比喂食非轉(zhuǎn)基因玉米的豬含有著更容易消化和代謝的能量以及更高的的消化率[17]。飼糧中使用轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米有利于提高生長(zhǎng)豬的生長(zhǎng)性能[14]。因此飼喂轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米與常規(guī)玉米是同等安全的，且轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米可提高單胃動(dòng)物對(duì)日糧中磷的利用率，從而減少日糧中無(wú)機(jī)磷的添加量，節(jié)約磷資源，降低磷的排出對(duì)環(huán)境造成的污染。

3 轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米環(huán)境安全性評(píng)價(jià)

對(duì)轉(zhuǎn)基因植酸酶玉米環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的研究也是研究的熱點(diǎn)。目前對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶玉米進(jìn)行環(huán)境安全性評(píng)價(jià)的研究主要是花粉介導(dǎo)的外源基因漂移以及對(duì)生物多樣性的影響；對(duì)生物多樣性的影響包括對(duì)節(jié)肢動(dòng)物生物多樣性的影響以及對(duì)土壤微生物多樣性的影響。

轉(zhuǎn)基因玉米花粉擴(kuò)散的頻率和距離受環(huán)境影響，在不同日期、不同氣象條件下，花粉漂移擴(kuò)散的距離不盡相同。趙宗潮等采用花粉染色法研究了轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米花粉的擴(kuò)散頻率和距離，結(jié)果表明，花粉擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)概率在不同方位有不同，擴(kuò)散的頻率隨著距離增加而降低；在試驗(yàn)期間花粉擴(kuò)散的最遠(yuǎn)距離可達(dá)35 m[18]。

對(duì)田間節(jié)肢動(dòng)物種群動(dòng)態(tài)及多樣性的影響研究表明，轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米的種植未對(duì)田間主要害蟲(chóng)和天敵種群動(dòng)態(tài)產(chǎn)生顯著影響[19-20]；對(duì)亞洲玉米螟和棉鈴蟲(chóng)的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)利用均無(wú)影響[21]；對(duì)步甲物種多樣性及常見(jiàn)物種沒(méi)有明顯影響[22]。

對(duì)土壤生物的群落結(jié)構(gòu)和多樣性研究表明轉(zhuǎn)植酸酶玉米的田間種植未對(duì)土壤線(xiàn)蟲(chóng)的生態(tài)指標(biāo)和群落結(jié)構(gòu)造成直接影響[23]。同一時(shí)期同一種微生物數(shù)量在種植轉(zhuǎn)植酸酶玉米、非轉(zhuǎn)基因玉米及空白土壤中基本相同[24]；對(duì)土壤酶活性的影響中土壤蔗糖酶、土壤蛋白酶及土壤脲酶活性均無(wú)顯著影響；而對(duì)土壤酸性磷酸酶活性有顯著影響，轉(zhuǎn)植酸酶玉米的土壤酸性磷酸酶活性顯著高于親本非轉(zhuǎn)植酸酶玉米的土壤，這說(shuō)明轉(zhuǎn)植酸酶玉米顯著提高了土壤酸性磷酸酶的活性，進(jìn)而對(duì)土壤中磷酸酯的水解會(huì)起到一定的促進(jìn)作用[25]。

4 非預(yù)期影響的評(píng)價(jià)

轉(zhuǎn)基因作物由于導(dǎo)入外源基因而使植物基因組發(fā)生改變，可能會(huì)導(dǎo)致意想不到的影響，從而影響人類(lèi)的健康或環(huán)境[26]，隨著轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化，這些非預(yù)期的未知影響是轉(zhuǎn)基因作物生物安全研究的熱點(diǎn)之一。評(píng)價(jià)非預(yù)期影響中，高通量的“組學(xué)”技術(shù)比有目標(biāo)分析評(píng)價(jià)具有優(yōu)勢(shì)[27-28]，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等。其中蛋白質(zhì)直接參與代謝和細(xì)胞的生長(zhǎng)，多數(shù)外源基因的表達(dá)或調(diào)控產(chǎn)物是蛋白質(zhì)[29]，一些毒素、抗?fàn)I養(yǎng)因子或過(guò)敏原等蛋白還可能對(duì)人體健康產(chǎn)生很大的影響。因此，從蛋白質(zhì)組學(xué)上對(duì)轉(zhuǎn)基因作物生物安全性進(jìn)行非預(yù)期影響評(píng)價(jià)非常重要[30]。

在轉(zhuǎn)基因玉米的非預(yù)期影響研究中，由于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因玉米MON810在商業(yè)上的重要性，其與對(duì)照的非預(yù)期影響已被廣泛的研究，分別從轉(zhuǎn)錄組學(xué)[31-34]、代謝組學(xué)[35-38]、蛋白質(zhì)組學(xué)上[39-42]進(jìn)行了比較研究，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米MON810在轉(zhuǎn)錄組水平、代謝水平、蛋白質(zhì)水平上與其對(duì)照常規(guī)玉米具有實(shí)質(zhì)等同性。

我們對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶玉米進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，獲得了轉(zhuǎn)植酸酶玉米葉片和種子的總蛋白2DE圖譜，其中葉片鑒定了44個(gè)差異蛋白，COG功能分類(lèi)表明這些差異蛋白主要與碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)，其次與翻譯后修飾相關(guān)；KEGG分析顯示差異蛋白主要是參與光合作用的碳固定途徑[43]。利用2DE-MS/MS和iTRAQ技術(shù)一共鑒定了148個(gè)差異蛋白，COG功能分類(lèi)表明差異蛋白主要是參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控與轉(zhuǎn)錄后修飾的蛋白[44]。與傳統(tǒng)育種的作物相比，轉(zhuǎn)植酸酶玉米葉片與常規(guī)玉米葉片具有實(shí)質(zhì)等同性，轉(zhuǎn)基因沒(méi)有顯著改變玉米的蛋白質(zhì)組。

5 展望

轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米作為飼料用玉米在我國(guó)的推廣使用有著極為重要的意義。目前對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米進(jìn)行的安全性評(píng)價(jià)主要是食用安全性方面的評(píng)價(jià)以及環(huán)境安全性評(píng)價(jià)，且主要是針對(duì)特定目標(biāo)進(jìn)行可預(yù)期影響的評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)植酸酶玉米與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩滓粯邮前踩摹５珜?duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米從組學(xué)上進(jìn)行的非預(yù)期影響的研究還很少，我們從蛋白質(zhì)組學(xué)上進(jìn)行了比較分析，還未見(jiàn)從轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)層面上進(jìn)行比較研究。因此還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米非預(yù)期影響的研究。

轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)是一項(xiàng)長(zhǎng)期工作，需要建立科學(xué)的評(píng)價(jià)技術(shù)體系進(jìn)行長(zhǎng)期跟蹤監(jiān)測(cè)。首先，轉(zhuǎn)基因作物的安全性評(píng)價(jià)應(yīng)遵循個(gè)案的原則一個(gè)一個(gè)的進(jìn)行。其次，對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)時(shí)，既要用目標(biāo)分析法對(duì)其進(jìn)行預(yù)期影響進(jìn)行評(píng)價(jià)，還應(yīng)使用非目標(biāo)的組學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行非預(yù)期影響研究。其中對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)及環(huán)境安全進(jìn)行評(píng)價(jià)研究時(shí)，在不同地區(qū)、不同土壤類(lèi)型條件下，需要分別進(jìn)行長(zhǎng)期定位監(jiān)測(cè)。評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因作物的非預(yù)期影響時(shí)，還應(yīng)結(jié)合多種組學(xué)技術(shù)，包括轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)等，評(píng)價(jià)可以更全面、更客觀[41]。

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